張嫄怡 綜述 李春鳴 審校

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義 563099)

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人胃癌裸鼠移植瘤建立的研究慨況

張嫄怡 綜述 李春鳴 審校

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義 563099)

胃癌； 裸鼠； 移植癌模型

胃癌是我國乃至全球常見的消化道腫瘤，也是全世界癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]，嚴重威脅著人們的生命健康。為了更好地研究胃癌的發(fā)病學(xué)機制和防治，臨床前模型有著重要的作用。然而，自發(fā)或者誘發(fā)的鼠源性腫瘤模型與人瘤的生物學(xué)差別較大，因此在1969年Rygaard第一次成功地將人結(jié)腸癌移植入裸鼠體內(nèi)也為胃癌的動物模型開創(chuàng)了新的研究方向。裸鼠移植瘤模型的操作簡便易行，可重復(fù)性高并且與人類腫瘤生物學(xué)行為相近，在腫瘤的基因治療、化療和中醫(yī)中藥治療及藥效等研究中應(yīng)用廣泛。現(xiàn)就胃癌裸鼠移植瘤建立的研究概況做一綜述。

1 人胃癌裸鼠移植的建立

1.1 裸鼠的選擇 裸鼠包括裸小鼠和裸大鼠。裸小鼠是一種無胸腺，無被毛的突變種小鼠，“nu”表示其基因符號。裸大鼠的一般特征與裸小鼠相似，但頭部、軀干和四肢有少量的毛，基因符號用“rnu”來表示。由于兩者都具有T細胞免疫缺陷，不會排斥來自異種的組織移植，因此成為人癌異種移植的良好接受體。

裸大鼠常選用rnu/rnu，4～5周齡，體質(zhì)量55～70 g，雌雄兼用。裸大鼠體型大于裸小鼠、產(chǎn)瘤量大、壽命長，在血液學(xué)和血清生化分析實驗中能提供足夠的血液樣本。另外裸大鼠體型大易進行外科手術(shù)，為胃癌瘤周淋巴管的分離、研究癌組織血供提供了方便。裸小鼠常選用BALB/C(nu/nu)，鼠齡4～6周齡為佳，體質(zhì)量18～20 g，雌雄兼用。裸小鼠易抓取，沒有被毛所以容易觀察皮下的移植瘤，實驗所需經(jīng)費較少。裸鼠必須飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中，相關(guān)的實驗也需要在超凈臺中進行。

1.2 瘤源 一種是胃癌細胞株，常選用的包括BGC-823(胃低分化腺癌)、SGC-7901(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性胃腺癌)、MGC-803(胃低分化黏液腺癌)、AGS(胃中分化腺癌)、MKN-45(胃低分化腺癌)、MKN-28(胃中分化管狀腺癌)、HGC-27(胃未分化癌)。目前國內(nèi)外關(guān)于胃癌裸鼠移植瘤建立的實驗中多采用SGC-7901和BGC-823，這兩種細胞株均易培養(yǎng)。這兩株細胞成瘤率均達到100%，無自發(fā)消退的現(xiàn)象，都可以很好的反應(yīng)人低分化胃癌的病理變化。

另一種是使用胃癌患者新鮮的腫瘤組織(PDTT)來建立裸鼠移植瘤的模型。此種個體化的腫瘤模型與患者的腫瘤在組織病理學(xué)特征上有著高度一致性[2]，能為不同的胃癌患者選用最有效的個體化治療藥物提供理想的實驗基礎(chǔ)。近年來PDTT模型也越來越多的用于臨床前靶向療法的研究，如K.Jin等[2]利用PDTT模型來驗證新型抗VEGF靶向藥物(FP3或貝伐單抗)的療效，研究表明該模型對兩種藥物均敏感且雙重靶向治療優(yōu)于單藥治療。

2 人胃癌裸鼠移植瘤建立的方法

2.1 人胃癌皮下種植法 常用的有兩種方法：一種是用直接將新鮮人腫瘤組織剪成2 mm×2 mm×3 mm[2]或研磨成懸液后接種于裸鼠的皮下。另一種是培養(yǎng)胃癌細胞系進行接種，此種方法必須保證細胞數(shù)量在106～107，活力要≥95%。一般將腫瘤細胞懸浮于PBS、無血清的培養(yǎng)基或生理鹽水中，某些難以成瘤的胃癌細胞可以與matrigl 1∶1混合提高成瘤率。皮下接種法在各種研究中應(yīng)用廣泛。如Z.H.Ma等[3]采用皮下接種法研究了125I粒子的植入對裸鼠人胃癌細胞NCI-N87移植瘤，發(fā)現(xiàn)125I通過導(dǎo)致NCI-N87胃癌細胞的凋亡和降低細胞的有絲分裂而使移植瘤生長受限。王萍玲等[4]等利用裸鼠皮下建瘤發(fā)現(xiàn)H-ras的小干擾RNA可下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達。

但是由于有皮下結(jié)締組織包裹的限制、腫瘤細胞所處微環(huán)境的改變，所以移植瘤生長局限，不發(fā)生其他器官和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[5]。因此，想要研究胃癌轉(zhuǎn)移的機制和抗轉(zhuǎn)移的治療，建立人胃癌裸鼠轉(zhuǎn)移癌就有了重要的意義。

2.2 人胃癌原位移植法

2.2.1 胃癌細胞懸液接種法 傳統(tǒng)的方法:將培養(yǎng)好的細胞制成懸液注射入裸鼠胃壁大彎側(cè)近胃竇處。此種模型成瘤周期較長、成瘤率和轉(zhuǎn)移率比組織塊法低。主要是因為胃癌細胞系被胰酶處理后，腫瘤原有的細胞結(jié)構(gòu)、抗原成分被破壞。結(jié)果影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。改進方法：首先將培養(yǎng)基(1 mL)與鼠尾膠原溶液(1 mL)1∶1等比例混合，再將胃癌細胞重懸于配制好的溶液中，最后把腫瘤細胞/膠原復(fù)合物注射入胃大彎近胃竇處漿膜下。胃癌細胞/膠原復(fù)合物能在局部形成工程化的胃癌組織，可以防止細胞溢出，且細胞呈現(xiàn)出三維立體式生長，細胞與細胞間、細胞外基質(zhì)及組織的結(jié)構(gòu)等微環(huán)境與人體胃癌組織相似。膠原孔道還能為瘤組織的微血管提供孔道[6]。

2.2.2 組織塊法 有研究[7]表明胃癌組織塊移植成瘤率高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移廣泛，肝臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高。組織塊法能使腫瘤完全表達其惡性特性，類似于臨床患者，因此也是目前最理想的模型。

胃腫瘤組織塊移植處理的方法有：(1)首先將胃癌細胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤長出后再進行裸鼠間傳代，后將瘤塊取出縫合于裸鼠胃壁大彎側(cè)[7]。(2)在方法(1)的基礎(chǔ)上，待原位移植瘤生長一個月后再把原位瘤取出切成2 mm×1 mm×1 mm的瘤塊荷包縫扎于胃漿膜損傷處[8]。(3)直接把胃癌患者新鮮的腫瘤組織和(或)轉(zhuǎn)移瘤組織縫合于裸鼠胃壁[9]，此種方法需要嚴格無菌采集新鮮胃癌組織并馬上放置在含有抗生素的培養(yǎng)液里，而且要盡可能快的進行移植，否則癌組織容易失去活性或者壞死。

縫合的操作方法包括：(1)縫掛法：剪開約2 mm胃壁漿膜層后直接將1～2枚2 mm×1 mm×1 mm大小的瘤塊縫掛于切口處即可。這種處理的缺點是癌組織塊有可能脫落、腫瘤向胃腔外生長、與腹膜粘連。但是此法操作相對簡便。(2)胃囊法:在胃大彎處縫黏膜囊包埋胃癌組織，早期就使癌組織接觸到正常的胃黏膜，不會脫落造成轉(zhuǎn)移假陽性。(3)顯微外科法：在放大顯微鏡下，將大約1 mm×1 mm×1 mm的瘤小塊固定于胃竇小彎側(cè)2 mm長的切口內(nèi)[10]。由于在臨床上大部分胃癌發(fā)生在胃竇部，所以顯微外科法能很好的模擬胃癌的生長特點。但是顯微外科難度較大未得到大范圍適用。(4)“膠水”粘貼法：用1ML的無菌針頭刺破胃小彎處胃漿肌層，用無齒鑷向內(nèi)推形成一個類似小口袋的凹陷，將瘤塊用生物膠粘貼于凹陷處[10]。最近幾年來，原位移植從以前“縫”改進到“粘貼”的流行主要是因為性能好、成本低、操作時間短和裸鼠術(shù)后恢復(fù)好，為胃癌原位移植研究提供了方便。生物膠可選用OB膠或者FS膠。(5)“纖維蛋白原-凝血酶”法：將瘤塊切成大約1 mm×1 mm×1 mm泡在放置在冰上的纖維蛋白原溶液里，用1ML無菌針頭刺破裸鼠胃大彎近胃竇處的胃壁漿肌層，植入3～4塊瘤塊，滴上10 μL凝血酶在瘤組織表面，凝血酶和纖維蛋白原會發(fā)生反應(yīng)，把所形成的膠狀物粘合到胃壁破損處即可[11]?！袄w維蛋白原-凝血酶”復(fù)合物能有效的止血，能被機體吸收而不影響腫瘤的生長。這一模型彌補了OB膠不可吸收的缺點。

胃癌預(yù)后差主要在于許多患者初次就診時就有局部或遠處的轉(zhuǎn)移，裸鼠的原位移植方式模擬了人胃癌生物學(xué)機制，更有利于研究。如Y.Li等[12]用原位移植的方法研究轉(zhuǎn)染了ZNF139-siRNA對人胃癌SGC-7901的影響，用熒光雙向差異凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZNF139可能通過上調(diào)ANXA5的表達促進胃癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，抑制ANXA1的表達而促進胃轉(zhuǎn)移。

2.3 腹腔注射轉(zhuǎn)移瘤模型 消毒裸鼠腹部，將胃癌細胞懸液于右下腹正中線處注射入裸鼠腹腔。此法可以用來模擬晚期胃癌患者腹腔轉(zhuǎn)移的情況，因造模簡單常用于評估各種干預(yù)手段對腹腔轉(zhuǎn)移的胃癌細胞和病灶的效應(yīng)。南蛇藤可能通過NF-κB/Snail信號通路調(diào)控HSP27的表達，進而抑制胃癌細胞在裸鼠腹腔中的轉(zhuǎn)移。

2.4 尾靜脈注射轉(zhuǎn)移瘤模型 固定好裸鼠，拉直其尾部，將細胞懸液注射到裸鼠尾靜脈內(nèi)。此種方法雖不能模擬人胃癌生長、轉(zhuǎn)移的過程，但能造成遠處器官的血行轉(zhuǎn)移，可以用來研究某種抑癌基因或癌基因?qū)β闶笪赴┺D(zhuǎn)移瘤的影響。如C.Zhou等[13]轉(zhuǎn)染shRNA沉默人胃癌AGS和SGC-7901細胞中的腫瘤轉(zhuǎn)移基因MAT2，發(fā)現(xiàn)其在裸鼠尾靜脈模型中裸鼠的胃癌肺轉(zhuǎn)移比只轉(zhuǎn)染了shRNA的空白組明顯減小。還發(fā)現(xiàn)MAT2的表達與癌組織內(nèi)的SP1因子呈正相關(guān)。

2.5 脾內(nèi)注射肝轉(zhuǎn)移模型 消毒裸鼠腹部，切開左側(cè)腹部，將備好的胃癌細胞懸液注入脾臟下極包膜下，復(fù)位脾臟，縫合切口關(guān)腹。脾內(nèi)注射的胃癌細胞經(jīng)過脾內(nèi)的巨噬細胞和NK細胞的篩選后，能轉(zhuǎn)移到裸鼠肝臟的胃癌細胞都是具有高度轉(zhuǎn)移潛能的。近年來此種造模法不常用。

3 裸鼠移植瘤的評價手段

3.1 剖腹探查 裸鼠移植瘤若建立成功，要觀察其生長情況，一般方法是腫瘤形成后處死裸鼠，剖腹取出瘤組織觀察。觀察內(nèi)容包括腫瘤體積、質(zhì)量的測量、觀察組織形態(tài)、周圍組織的改變和腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。但是剖腹探查必須處死裸鼠，不能實時對裸鼠進行觀察所以觀察情況和收集的信息十分有限。

3.2 活體成像技術(shù) 活體光學(xué)成像常采用生物發(fā)光和熒光發(fā)光。前者熒光素酶基因可用來標記細胞或DNA。而熒光發(fā)光中用(GFP、RFP及DiR等)等熒光基團來標記?？蓪⒈磉_GFP或RFP的質(zhì)粒與目的基因一起轉(zhuǎn)染到胃癌細胞，但需要分選出穩(wěn)定表達熒光蛋白的細胞，也可以把熒光染料注射到裸鼠的尾靜脈或腹腔靜脈?；铙w成像能廣泛應(yīng)用胃癌的基因治療、移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移的實時監(jiān)測中[14]。如樸春梅[15]等利用生物發(fā)光成像技術(shù)確定癌細胞的肝轉(zhuǎn)移，再用近紅外熒光探針簡單、快速地觀察血管新生情況。M.Yang[16]等研究發(fā)現(xiàn)用轉(zhuǎn)染了GFP熒光蛋白的胃癌細胞注射到RFP轉(zhuǎn)基因裸鼠的皮下后癌組織能表達GFP的綠色熒光，而腫瘤脈管系統(tǒng)能表達RFP的紅色熒光，說明癌組織保持著良好的生存能力，若是腫瘤只有少許RFP熒光殘留則說明瘤細胞有壞死。這樣應(yīng)用雙重標記的裸鼠又為腫瘤組織微環(huán)境的研究提供了新的可能。

3.3 核素成像 將示蹤劑導(dǎo)入裸鼠，可定位在靶器官，再用小動物PET/SPECT顯像儀采集信息，能在顯示不同斷面圖的同時給出定量生理參數(shù)。放射性標記物進入體內(nèi)能聚集在特定組織和器官參與代謝，適合于各類抗腫瘤藥物的動態(tài)實時研究。如K.H.Jun等[17]將溶瘤病毒GLV-1 h153轉(zhuǎn)染入胃癌細胞MKN-74進行裸鼠成瘤，2 d后在裸鼠尾靜脈注射放射性核素99mTc，利用小動物PET對腫瘤組織成像為觀察GLV-1 h153對胃癌細胞MKN-74的作用提供了非侵入性成像的工具。

3.4 MRI成像 MRI具備無創(chuàng)、空間高分辨率、多方位多參數(shù)成像的特征。而且所獲得的解剖信息不受組織深度的影響。Y.Chen[18]等在研究中成功制備了siRNA傳遞和MRI顯像功能的胃癌組織靶向納米載體，可以靶向性的識別胃癌SGC-7901，將siRNA靶向性的傳遞到SGC-7901細胞同時能夠?qū)崿F(xiàn)MRI分子影像學(xué)示蹤，為治療胃癌提供了新手段。

4 小 結(jié)

目前,裸鼠移植瘤技術(shù)比較成熟，建立周期短、成功率也高，能滿足胃癌生物學(xué)行為研究、藥物評價的需求。欲研究胃癌的整個發(fā)生發(fā)展的全過程，尤其是機體對胃癌的免疫作用。今后應(yīng)在裸鼠建模的平臺上繼續(xù)進行優(yōu)化?？偠灾闶罂梢愿鶕?jù)實驗要求的不同選用不同的造模方法，同時裸鼠活體腫瘤的實時監(jiān)控也廣泛應(yīng)用到監(jiān)控轉(zhuǎn)基因的表達、基因治療、病毒載體的傳送和胃癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移中，與裸鼠的異種移植相輔相成。胃癌的發(fā)展是個多階段、多因素的過程。因此想要全面的評價胃癌裸鼠模型，理想的辦法是將模型與活體成像、尸體解剖、病理和分子生物學(xué)檢測等手段相結(jié)合綜合觀察。

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