陳玉雪, 楊 亮,張凡慶,朱建國**(. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，上海 0040；. 上海富朗特動物保健有限公司,上海,050)

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功能性蛋白口服制劑的研究進(jìn)展

陳玉雪1,2*, 楊 亮2,張凡慶1,朱建國1**
(1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，上海 200240；2. 上海富朗特動物保健有限公司,上海,201502)

摘 要：隨著功能性蛋白應(yīng)用的愈發(fā)廣泛，口服給藥途徑以其方便、安全、高順應(yīng)性等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)下提高生物利用率的研究熱點(diǎn)。本文結(jié)合文獻(xiàn)，對常用的口服給藥系統(tǒng)，包括化學(xué)修飾、功能改善及運(yùn)送載體等進(jìn)行簡要綜述。

關(guān)鍵詞：口服給藥；功能性蛋白

伴隨著生物技術(shù)日新月異的發(fā)展，越來越多的具有生理活性的多肽或蛋白分子被發(fā)現(xiàn)，使得功能性蛋白在現(xiàn)代疾病預(yù)防和治療中逐漸占據(jù)重要位置。同時利用轉(zhuǎn)基因動、植物實現(xiàn)了活性蛋白的批量生產(chǎn)，使得針對功能性蛋白給藥系統(tǒng)的研究愈發(fā)深入。功能性蛋白具有體內(nèi)作用明確、藥理作用強(qiáng)、免疫源性低、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，但與傳統(tǒng)合成藥物相比，蛋白多肽類藥物，穩(wěn)定性差、易變，在體內(nèi)半衰期短，分子量大，對pH及體內(nèi)酶變化敏感，難以穿透機(jī)體對其形成的天然屏障，化學(xué)和構(gòu)象不穩(wěn)定等問題極大地限制其應(yīng)用范圍。如何提高功能性蛋白的生物利用率，提高穩(wěn)定性，改變其給藥途徑成為這類藥物制劑研究的關(guān)鍵問題。

在眾多給藥途徑中，口服給藥系統(tǒng)以其較高的生物利用率、用藥順應(yīng)性及安全型備受研究開發(fā)者的青睞，成為當(dāng)前生物技術(shù)藥物最熱門的研究方向之一。目前已有少量生物技術(shù)類藥物上市應(yīng)用，如：口服干擾素、胸腺肽、胰島素等?，F(xiàn)常用功能性蛋白口服制劑的制備方式主要有以下三種：(1)化學(xué)修飾；(2)功能改善；(3)運(yùn)送載體。本文結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，主要對常用的口服給藥系統(tǒng)的制備工藝及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行簡單總結(jié)。

1 化學(xué)修飾

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾包括主鏈結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈基團(tuán)修飾兩種，目前針對改變側(cè)鏈基團(tuán)的研究較多。通過化學(xué)修飾，可有效降低或消除免疫原性，減少藥物分子的毒副作用，提高功能性蛋白的穩(wěn)定性，同時增加跨膜滲透性，提高生物利用率、延長循環(huán)半衰期等。

常用的化學(xué)修飾方法有：氨基酸替換、環(huán)化、乙?；EG化等。在右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG等眾多修飾劑中，以PEG類修飾劑最為常用[1]。PEG類修飾劑相較于其他修飾劑，它毒性小、無抗原性、具備良好的兩親性，且該聚合物具有得到FAD認(rèn)證的生物相容性。1990年，PEG修飾的腺苷脫氨基酶成為通過FDA認(rèn)證的第一種修飾蛋白。PEG化后的藥物分子量增大，從而避免了腎小球過濾；親水性增加，減少蛋白水解酶對其降解，提高穩(wěn)定性；與藥物間形成化學(xué)鍵合，水解過程達(dá)到緩釋效果。

雖然目前已有多種PEG化功能性蛋白進(jìn)入市場，但傳統(tǒng)的化學(xué)修飾方式存在修飾劑聚合度不一、選擇性不夠高，修飾后的藥物分子量分布寬，改性或降低其生物活性、穩(wěn)定性低于理想值等突出問題?；瘜W(xué)修飾仍需依靠綜合性修飾劑的制備、修飾條件的探索來提高其可行性。

2 功能改善

2.1 吸收促進(jìn)劑

吸收促進(jìn)劑是指具有可逆、特異或非特異性的，增強(qiáng)胃腸道對功能性蛋白吸收作用的一種小分子化合物，通過促進(jìn)劑的使用，可提高血液中藥物的濃度和生物利用率。

吸收促進(jìn)劑主要利用以下幾種作用機(jī)理：① 擾亂細(xì)胞膜上的磷脂層，達(dá)到增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動性、降低黏膜層粘度效果，形成細(xì)胞膜孔，提高細(xì)胞膜的通透性。② 抑制蛋白水解，提高藥物穩(wěn)定性；③增加靶部位單位時間的血流量，提高細(xì)胞膜內(nèi)外藥物濃度梯度；④ 促進(jìn)劑的陽離子與膜表面的陰離子結(jié)合，增加黏附能力，促進(jìn)吸收，提高生物利用率等。

不同理化性質(zhì)的天然或合成的輔料都具有促進(jìn)藥物吸收的作用，常用的吸收促進(jìn)劑有：生物粘附性高分子聚合物、脂肪酸及其衍生物、表面活性劑等。近年來的研究熱點(diǎn)集中于殼聚糖及其衍生物。殼聚糖、卡波姆等本身就是無毒性藥用輔料[2]，在功能性蛋白研究中主要應(yīng)用其生物黏附性及促吸收作用，研究證明殼聚糖及其衍生物的促吸收作用優(yōu)于卡波姆，效果較明顯。吸收促進(jìn)劑的選擇應(yīng)遵循理化性質(zhì)合理、可逆；少毒或無毒無副作用；可循環(huán)再生；作用部位明確；價廉易得等原則。但研究發(fā)現(xiàn)，使用過程中促吸收機(jī)理亦是毒性反應(yīng)的機(jī)理，在促進(jìn)胃腸道吸收功能性蛋白的同時，也有可能促進(jìn)腸道內(nèi)對毒素和病原體的吸收。促吸收劑用法用量的偏差都會造成機(jī)體局部或全身性的毒性反應(yīng)。如鈣離子螯合劑可導(dǎo)致細(xì)胞中鈣離子枯竭，破壞細(xì)胞的肌動蛋白絲，降低細(xì)胞間的粘附力[3]。

雖然對口服制劑中吸收促進(jìn)劑已有一定程度的研究，但臨床應(yīng)用還處于初級階段，無論促進(jìn)劑的促進(jìn)機(jī)理如何復(fù)雜，“安全、高效”將作為吸收促進(jìn)劑選用的唯一準(zhǔn)則。

2.2 酶抑制劑

胃腸道酶的降解作用是功能性蛋白口服生物利用率低下的主要原因，功能性蛋白與其代謝酶抑制劑一起使用，能顯著降低或者抑制代謝酶的活性，有利于促進(jìn)功能性蛋白生物利用率的提高。常用的代謝酶抑制劑有：抑肽酶、Bowman-Birk抑制劑[4]、大豆胰抑制酶、桿菌肽及肝膽酸鈉和卡默斯塔甲磺酸鹽等。

不同于吸收促進(jìn)劑，酶抑制劑的特異性要求功能性蛋白和酶抑制劑必須同時到達(dá)代謝部位，往往需要將酶與功能性蛋白共同包裹制成微囊、微球、納米粒等聚合物，Lee 等[5]選用腸溶材料EudraigitL 100制成了胰島素微球，并分別加入胰蛋白酶抑制劑、凝乳蛋白酶酶抑制劑、Bowman-Birk酶抑制劑，與胰島素包裹于上述微球體系中。大鼠給予上述微球后，抑酶譜范圍更廣的抑肽酶Bowman-Birk酶抑制劑，比對照組(未添加酶抑制劑的胰島素微球)降糖作用增加50 %以上，差異明顯；而胰蛋白酶抑制劑、凝乳蛋白酶抑制劑實驗組與對照組相比，無明顯差異。實驗說明酶抑制劑有利于功能性蛋白生物利用率的提高，但抑酶作用強(qiáng)弱，促吸收作用顯著與否取決于酶抑制譜的范圍。

酶抑制劑和功能性蛋白共同服用，能顯著提高功能性蛋白生物利用率，但動物體內(nèi)研究結(jié)果也證明了，酶抑制劑的使用也存在許多不良反應(yīng)[6,7]。酶抑制劑影響了胃腸道對正常營養(yǎng)性蛋白的消化吸收，同時反饋調(diào)節(jié)也刺激了酶的分泌，長期使用易導(dǎo)致脾臟肥大增生，過量使用會造成機(jī)體多系統(tǒng)產(chǎn)生毒性反應(yīng)。因此，在新藥物控釋系統(tǒng)及劑型的研發(fā)中，如何限定抑制劑不被釋放從而降低其毒副作用，是亟需解決的問題。

3 運(yùn)送載體

運(yùn)送載體亦可稱為微粒載體。微粒載體可同時滿足保護(hù)功能性蛋白在消化道劇烈環(huán)境中免受酶系統(tǒng)的降解，提高藥物在黏膜上皮的透過效率。目前被廣泛應(yīng)用的有：脂質(zhì)體、微球及納米粒等，功能性蛋白制成粒徑合適的納米粒、微球、脂質(zhì)體，不僅能減少和避免藥物口服時的酶解作用，提高生物利用率，還可以起到緩釋的作用。

3.1 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是將藥物包裹在類脂質(zhì)雙分子層的超微型球狀載體制劑，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，直徑分布幾十納米至數(shù)微米不等。脂質(zhì)體具有：①生物相容性好；②同時兼容包裹親水性和疏水性藥物；③無毒副作用，生物利用率高，免疫原性低；④避免體液對所載藥物的稀釋、體內(nèi)酶的分解破壞等優(yōu)點(diǎn)[8]。常用的制備方法[9]有薄膜分散法、超聲波分散法、離子梯度法、逆向蒸發(fā)法、溶劑注入法、冷凍干燥法、聯(lián)合制備法等，針對不同的性質(zhì)包封藥物選擇相應(yīng)的制備方式。顧一珠等[10]利用薄膜分散-超聲法制備葛根素脂質(zhì)體，并進(jìn)行小鼠灌服測試其相對生物利用率，葛根素脂質(zhì)體對葛根素的相對生物利用率為168.2 %，改善了葛根素的口服吸收。

盡管有多種制備方法，但脂質(zhì)體制備目前還存在各種各樣的問題，尤其以包封率和穩(wěn)定性低為突出問題，同時其靶向作用主要集中在肝、腎、脾等器官，對其他組織的靶向性不明顯，限制其應(yīng)用。高壓均質(zhì)機(jī)等新型制藥設(shè)備的出現(xiàn)，在提高脂質(zhì)體均勻性和穩(wěn)定性方面起到一定的推動作用，但依然無法完全滿足脂質(zhì)體工業(yè)化的需求。

3.2 微球

微球是以清蛋白、聚乳酸等可降解材料制成的，粒徑在1 μm～500 μm左右的球形載體給藥系統(tǒng)，其中粒徑小于500 nm，通常又稱為納米粒。近年來，常應(yīng)用微球給藥系統(tǒng)制備水溶性差、胃腸道滲透率低、口服生物利用率低的藥物的口服藥[11]。利用可降解材料制備的蛋白控釋微球具有高生物利用率、低藥物毒副作用、血藥濃度恒定、控釋及靶向等優(yōu)點(diǎn)。

常用的微球制備方法有：溶劑提取法、溶劑揮發(fā)法、相分離法、噴霧干燥法、超臨界流體技術(shù)等，應(yīng)用中多采用溶劑提取法、溶劑揮發(fā)法與相分離法，前兩者適用于非水溶性藥物的包載，而相分離法更適用于包載水溶性藥物。黃慧等[12]利用殼聚糖為載體，制成胰島素微球，灌服小鼠進(jìn)行降糖測試，血糖最大降幅為50.2 %，而諾和靈中效胰島素皮下注射降糖血糖最大降幅58.7 %，結(jié)果證明殼聚糖胰島素微球口服制劑對大鼠有降糖效果，且與諾和靈中效胰島素皮下注射降糖效果無統(tǒng)計學(xué)差異。

微球系統(tǒng)的粒徑大小是影響其在小腸吸收和體內(nèi)生物分布的重要因素[13]，粒徑越大，包封率和裝載量越高；而粒徑較小的微球具有更大的比表面積，可有效提高功能性蛋白口服的生物利用率。根據(jù)不同疾病類型和病變位點(diǎn)，選擇相應(yīng)載體，制備不同粒徑大小的各型微球，可以使微球能迅速達(dá)到相應(yīng)的靶向器官，并在靶部位持續(xù)維持有效濃度。

3.3 納米粒

納米粒載體屬于納米級微觀范疇的藥物載體運(yùn)輸系統(tǒng)，通常是指粒徑在10 μm～1 000 nm之間，是一類以天然或人工合成的高分子材料為載體的膠體微粒。納米粒利用空間位阻對包裹的藥物進(jìn)行保護(hù)，具有跨越黏膜屏障、改變藥物在體內(nèi)分布的優(yōu)點(diǎn)；較強(qiáng)的靶向性可以減少某些藥物的不良反應(yīng)；長效的藥物濃度維持可達(dá)到更佳的治療效果，同時納米粒制備材料及方法靈活多樣，為功能性蛋白口服給藥系統(tǒng)研究提供更多參數(shù)條件。

理想的納米粒應(yīng)具備[14]：①有較高的載藥量，如＞30 %；②具有較高的包封率，如＞80 %；③有適宜的制備及提純方法；④載體材料具有生物降解性，毒性較低或無毒；⑤具有適宜的粒徑和粒形；⑥具有較長的體內(nèi)循環(huán)時間。韓麗娜等[15]采用二次乳化法制備胰島素/維生素B12修飾透明質(zhì)酸鈉米粒(INS/VB12-HA NP)，以糖尿病模型大鼠降血糖實驗評價口服給藥體系藥效，VB12-1-HA、VB12-2-HA、VB12-3-HA三組在8 h后血糖量分別為初始血糖的(50.47±11.82) %、(62.22±13.25) %、(56.22±8.40) %，而口服胰島素溶液組的降糖作用為(91.84±2.10) %，證明與口服胰島素溶液相比，納米粒組均有顯著的降血糖作用。

常規(guī)納米?？诜o藥后，大部分納米粒因不能黏附小腸黏液層而導(dǎo)致停留時間過短，包載藥物未能達(dá)到完全釋放。同時小腸上皮層連接致密、蛋白多肽較高的親水性，使得胃腸道難以吸收釋放藥物，從而降低了納米?？诜苿┑纳锢寐?。通過提高納微球的黏膜粘附性和靶向性，可以很好地解決這一難題，主要依靠：改變納微球的粒徑；表面電荷；表面修飾、連接靶分子等方式來提高納微球的黏膜粘附性、小腸黏膜的通透性和靶向性[16]。Reineke等[17]分別制備了500 nm和1 μm、2 μm、5 μm的聚苯乙烯納米粒，研究其在腸道的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分布情況，結(jié)果顯示小腸對不同粒徑的納米粒均有吸收，且粒徑越小，其在小腸的吸收越多；帶正電荷的納米粒更易粘附于帶負(fù)電荷的小腸黏液層，利用納米粒和小腸黏液層的相互作用來延長藥物在小腸的停留時間；親水性納米粒更易通過小腸黏液層，且在黏液和血液中穩(wěn)定，而疏水性納米粒更容易被細(xì)胞攝取，Yuan 等[18]用 PEG 對納米粒進(jìn)行表面修飾，結(jié)果顯示，10 % PEG修飾后，納米粒通過黏液層量增加，上皮細(xì)胞攝取量無明顯變化，生物利用率較未修飾納米粒提高99 %，而20 % PEG修飾納米粒后，上皮細(xì)胞攝取量明顯降低，因此納米粒表面達(dá)到合適的親水-疏水平衡更有利于提高生物利用率。

4 結(jié)語

綜上所訴，相較于化學(xué)修飾、吸收促進(jìn)劑等功能性制劑添加以及脂質(zhì)體、微球，納米粒具有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，是目前研究較為深入廣泛的口服給藥載體。但不可否認(rèn)的是，納米粒體系復(fù)雜，作為口服給藥載體的影響因素過多，最佳因素參數(shù)組合仍有待確認(rèn)；且當(dāng)前蛋白口服給藥系統(tǒng)研究僅局限在提高蛋白多肽的口服利用度上，如何達(dá)到蛋白進(jìn)入機(jī)體后的控制釋放、定點(diǎn)靶位研究相對較少；制作成本高昂等諸多障礙，使得功能性蛋白口服制劑真正完全進(jìn)入臨床應(yīng)用還需更多數(shù)據(jù)支持。但隨著新材料的發(fā)現(xiàn)、制備工藝方法的提高及加工設(shè)備的完善化，蛋白口服制劑的發(fā)展?jié)摿κ菬o窮的，依然有光明的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)：(18篇，略)

中圖分類號：S816.79

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C

文章編號：1001-0769(2016)04-0085-03

基金項目：上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項目“防治仔豬腹瀉的豬源性單鏈抗體口服制劑研制及應(yīng)用(滬農(nóng)科攻字(2015)第1-8號)”及上海市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目資助。

*作者簡介：陳玉雪(1987- )，女，碩士研究生，主要從事飼料獸藥產(chǎn)品質(zhì)量檢驗及新產(chǎn)品開發(fā)驗證，E-mail：chenyuxue934592@163.com。

**通信作者：朱建國，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)方面的教學(xué)和科研工作，Email：zhu_jg@ sjtu.edu.cn。