姜　丹　彭曉宇　山東省榮成市嶗山畜牧獸醫(yī)站264300

孫麗麗　山東省榮成市蔭子畜牧獸醫(yī)站264300

鴨疫里氏桿菌對氟苯尼考耐藥性的研究

姜丹彭曉宇山東省榮成市嶗山畜牧獸醫(yī)站264300

孫麗麗山東省榮成市蔭子畜牧獸醫(yī)站264300

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌感染而致，又稱鴨傳染性漿膜炎，是一種主要侵害雛鴨的接觸性傳染病，臨床特點(diǎn)是困倦、厭食、眼和鼻孔有分泌物、下痢、共濟(jì)失調(diào)和抽搐，是目前養(yǎng)鴨業(yè)中最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一。本實(shí)驗(yàn)測定了10種常用抗菌藥對8株鴨疫里氏桿菌的敏感性。結(jié)果表明，對頭孢曲松鈉和硫氰酸紅霉素的耐藥率達(dá)100％；其次為慶大霉素和頭孢喹諾，耐藥率為87.5％；而對氟苯尼考的耐藥率為50％。

鴨疫里氏桿菌；氟苯尼考；耐藥機(jī)制

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌引起的鴨、鵝、火雞等多種禽類共患的一種急性或慢性、接觸性傳染?。?］，又稱為鴨傳染性漿膜炎。鴨疫里氏桿菌對多種抗菌素極易產(chǎn)生耐藥性，治療時應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用敏感藥物。鴨疫里氏桿菌一般對氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、新霉素、土霉素和鹽酸林可霉素均較敏感，而對青霉索、鏈霉素、磺胺六甲氧嘧啶不敏感［2］。

1　實(shí)驗(yàn)材料

（1）鴨疫里氏桿菌菌株來源。某鴨疫里氏桿菌病發(fā)病鴨場臨床分離的8株鴨疫里氏桿菌。

（2）藥品。氟苯尼考（含量為90％，批號040301，江西博萊大藥廠），左氧氟沙星（含量：90.5％，批號：200611038639，岳陽同聯(lián)藥業(yè)），頭孢曲松鈉（批號：20090101，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司），頭孢喹諾（含量：中國獸藥監(jiān)察所），硫氰酸紅霉素（效價(jià)：783.4U/mg，批號：200709120，岳陽同聯(lián)藥業(yè)），硫酸慶大霉素（批號：GENTAMYCIN1005081，邯鄲市第二制藥廠），恩諾沙星（含量：98.5％，批號：NA00N100108-A，浙江新華藥廠），鹽酸環(huán)丙沙星（批號：060630-7，浙江國邦藥廠），阿莫西林（含量：99％，批號：08060507，華北制藥集團(tuán)先泰藥業(yè)有限公司），磺胺嘧啶（含量：99.45％，批號：080335，昆山雙鶴藥業(yè)）。

（3）各種試劑。LB培養(yǎng)基、酵母浸出物、水解酪蛋白為Oxoid產(chǎn)品。固體培養(yǎng)平板為LB液體培養(yǎng)基加入1.6％瓊脂，分裝平皿后滅菌。生化微量鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司出品。瓊脂糖淀粉購于Oxoid公司，TAE緩沖液、Golden view核酸染料試劑購于原平皓生物公司（1009081）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

（1）鴨疫里氏桿菌細(xì)菌的培養(yǎng)與生化試驗(yàn)鑒定。菌株復(fù)蘇、活化、傳代。用接種環(huán)蘸取凍存于-20℃條件下的RA甘油菌少許，劃線接種于瓊脂LB平板上，倒置于溫箱中，37℃下培養(yǎng)24小時。待平板上長出單個菌落，挑取形態(tài)均一的單個菌落，接種于含3mL LB的試管中，37℃下振蕩培養(yǎng)12～16小時，待菌株生長，再傳代接種于LB培養(yǎng)基中，多次傳代至0.5～0.6個麥?zhǔn)媳葷釢舛取?7℃恒溫保存，備用。

按常規(guī)方法進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、VP、枸櫞酸試驗(yàn)等生化特性試驗(yàn)［3］。

（2）臨床分離鴨疫里氏桿菌對指示藥物的敏感性試驗(yàn)。純培養(yǎng)好的菌液使用前稀釋1000倍。采用CLSI推薦的微量稀釋法測定各藥對細(xì)菌的MIC［4］。將細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃溫箱培養(yǎng)過夜，使細(xì)菌濁度達(dá)到9×108個/mL，取無菌96孔培養(yǎng)板，將上述菌液作1∶1000倍稀釋，除第1孔加入稀釋菌180μL外，其余的各孔均加入100μL。繼之于第1孔加入抗生素原液20μL（320μg/ml）充分混合后吸出100μL加入第2孔中，按同法稀釋至第11孔，棄去100μL，第11孔為細(xì)菌對照，第12孔為培養(yǎng)基對照。將培養(yǎng)板37℃下培養(yǎng)16～24小時，觀察結(jié)果。凡藥物最高稀釋孔中無細(xì)菌生長者，該孔的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

3　結(jié)果與分析

（1）細(xì)菌培養(yǎng)、細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果。菌株接種LB板，經(jīng)37℃培養(yǎng)24～48小時后，為光滑、微突起、透明、奶油狀、直徑為l.0mm～2.0mm的菌落，04#菌株直徑較小并呈雙排排列。在半固體瓊脂培養(yǎng)基上沿穿刺線上生長，沒有發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌具有運(yùn)動性。糖發(fā)酵、靛基質(zhì)、V-P、枸椽酸鹽、尿素酶和硫化氫試驗(yàn)（表1），符合鴨疫里氏桿菌的生化特性［5］。

（2）MIC的測定。結(jié)果根據(jù)CLSI（2008）中10種藥物MIC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，分離得到的8株鴨疫里氏桿菌，其中氟苯尼考耐藥率為50％，阿莫西林耐藥率為25％，頭孢噻呋耐藥率為37.5％，頭孢喹諾耐藥率為87.5％，頭孢曲松鈉耐藥率為100％，左氧氟沙星耐藥率為12.5％，環(huán)丙沙星耐藥率為25％，恩諾沙星耐藥率為25％，慶大霉素耐藥率為87.5％，硫氰酸紅霉素耐藥率為100％。其中有兩株菌株10.09.02 04#和10.09.14 06#菌對氟苯尼考、頭孢喹諾、頭孢曲松鈉、慶大霉素和硫氰酸紅霉素呈高度耐藥，其最小抑菌濃度（MIC）值均≥128μg/mL。其它藥物對這兩株菌的最小抑菌濃度差異性較大。

4　討論

（1）鴨疫里氏桿菌生化反應(yīng)。本試驗(yàn)共研究鴨疫里氏桿菌2株，采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉水解、靛基質(zhì)、H2S、明膠、甘露醇、vp等生化反應(yīng)對其進(jìn)行鑒定。經(jīng)多次鑒定試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩株菌株除葡萄糖和蔗糖發(fā)酵鑒定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道不符，其他生化反應(yīng)均一致。這種生化反應(yīng)的異同可能是由于受到環(huán)境中溫度、濕度、紫外線等各種理化因素變化的影響，在動物體內(nèi)則是受到各種細(xì)胞因子、抗生素的選擇性壓力的影響，從而造成細(xì)菌發(fā)生基因突變，使某些生化反應(yīng)不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果［6］。

（2）藥物敏感性。鴨疫里氏桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素如阿莫西林、氨芐西林、亞胺培南、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟的敏感性較高，其中亞胺培南、頭孢吡肟抗菌活性最高，它們對所有菌株的最小抑菌濃度（MIC）值較低［7］。頭孢吡肟主要抑制細(xì)胞壁肽多糖的形成，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而產(chǎn)生殺菌作用，能耐受多種β—內(nèi)酰胺酶的破壞，因此抗菌活性較高。

鴨疫里氏桿菌對氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星敏感，其MIC值均≤32μ/mL。氟喹諾酮類藥物（FQs）具有抗菌譜廣、臨床療效好及可多途徑給藥的優(yōu)點(diǎn)，在臨床實(shí)踐應(yīng)用中與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性。鴨疫里氏桿菌對氨基糖苷類藥物阿米卡星、慶大霉素也較敏感，氨基糖苷類藥物具有抗菌譜廣性質(zhì)穩(wěn)定及水溶性好等優(yōu)點(diǎn)。四環(huán)素類藥物多西環(huán)素對鴨疫里氏桿菌的MIC值均≤16μ/mL。該類藥物具有內(nèi)服吸收迅速、生物利用度高及組織滲透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。其它藥物由于菌株之間的差異性和不同地區(qū)用藥不同而表現(xiàn)出不同的敏感性。鴨疫里氏桿菌很容易產(chǎn)生耐藥性，殺滅此菌可根據(jù)藥敏試驗(yàn)選用敏感藥物。藥物治療短期內(nèi)有一定效果，但連續(xù)使用很快就會產(chǎn)生耐藥性。因此每次用藥前均需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以確定首選藥物，也可采用聯(lián)合用藥方式，提高治療效果。

［1］Calnek B W．禽病學(xué)［J］．第9版．高福，劉文軍，主譯．第lO版，北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1991．153-l57．

［2］陳金敏，王秀麗，李文義，等.雛鴨傳染性漿膜炎的診斷與防制［J］.養(yǎng)殖與飼料，2007（03）：39．

［3］張大丙，郭玉璞．不同血清型鴨疫里氏桿菌分離株的生化特性比較［J］．中國獸醫(yī)雜志，1999，2（5）：13-15．

［4］Performance standards for antimiarobial susceptibility testing eighteenth informational supplement.CLSI document MI00一S18［S］．Wayne，Pennsylvania，Cinical and Laboratory Standards lnstitute，2008，28（1）：1-83．

［5］劉偉華，趙艷麗，王玉海，等．鴨疫里默氏菌研究進(jìn)展［J］．動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（5）；91-93．