陳小燕，潘玨

復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200032

·綜述·

細菌耐多藥外排泵的研究進展

陳小燕，潘玨

復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200032

摘要：近年來，由于抗生素的不合理及廣泛使用，全球多重耐藥菌和廣泛耐藥菌不斷出現(xiàn)。關(guān)于細菌耐藥機制中外排泵及生物膜形成的研究越來越受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，外排泵與生物膜形成有密切聯(lián)系，不同細菌的不同外排泵對生物膜形成的影響各異，而生物膜形成又影響外排泵基因表達。本文就細菌耐多藥外排泵的研究進展進行綜述。

關(guān)鍵詞：耐多藥外排泵；生物膜形成；外膜因子

近年來，由于抗生素的不合理及廣泛使用，全球多重耐藥和廣泛耐藥細菌不斷出現(xiàn)。2014年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示，細菌耐藥呈增長趨勢，特別是革蘭陰性菌，其中不動桿菌屬(鮑曼不動桿菌占93.0%)對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為62.4%和66.7%[1]。目前，關(guān)于細菌耐藥性的研究主要包括細菌滅活酶產(chǎn)生、靶位改變、外膜通透性改變、主動流出系統(tǒng)(即細菌外排泵)、耐藥基因轉(zhuǎn)移及生物膜形成等。其中，細菌外排泵在介導細菌耐多藥、細菌毒力及生物膜形成中的作用逐漸受到關(guān)注，但尚不清楚細菌外排泵與細菌生物膜形成之間的內(nèi)在聯(lián)系。細菌耐藥外排泵的廣泛分布與功能重疊暗示其尚有介導耐藥以外的其他重要生物學功能。由此，本文就細菌耐藥外排泵的分類及其與生物膜形成的相互影響進行綜述。

1細菌耐藥外排泵的分類

根據(jù)超微結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運機制、氨基酸序列同源性等，目前抗菌藥物耐藥相關(guān)外排泵可分為五大家族：主要易化子超家族(major facilitation superfamily，MFS)、多藥和毒性化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion，MATE)家族、ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette，ABC)超家族、耐藥結(jié)節(jié)分化(resistance-nodulation-cell division，RND)家族和小多重耐藥(small multidrug resistance，SMR)家族〔屬于藥物/代謝物轉(zhuǎn)運蛋白(drug/metabolite transporter，DMT)超家族〕[2]。這5類外排泵的主要區(qū)別如下。①結(jié)構(gòu)組成：RND家族主要以三聚體形式轉(zhuǎn)運底物，RND外排泵通常由染色體基因編碼，其結(jié)構(gòu)由膜融合蛋白(membrane fusion protein，MFP)、RND轉(zhuǎn)運蛋白、外膜因子(outer membrane factor，OMF)3部分組成，以三聚體形式橫跨于細菌內(nèi)外膜之間。其中MFP使細菌內(nèi)外膜結(jié)合緊密，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；RND轉(zhuǎn)運蛋白具有識別底物和將底物轉(zhuǎn)出細胞膜的功能；OMF位于細胞外膜，具有孔道蛋白的作用。這種三聚體轉(zhuǎn)運復合體具備高效轉(zhuǎn)運功能，同時由于外膜屏障的存在，泵出菌體外的底物不易再次返回菌體內(nèi)。有研究發(fā)現(xiàn)，破壞OMF產(chǎn)生的效果與滅活泵效果無統(tǒng)計學差異，表明外膜通透屏障與RND的作用密不可分[3-5]；而ABC、SMR、 MATE家族和MFS則以單聚體形式橫跨細菌內(nèi)膜。這種單體泵往往在將底物泵至周漿間隙后，部分藥物因具有相對親脂性可再次經(jīng)內(nèi)膜脂質(zhì)雙分子層擴散入細菌胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此是一種低效率的耐藥泵。②細菌分布：革蘭陽性菌主要耐藥外排泵是ABC家族[6]，革蘭陰性菌的主要耐藥外排泵是RND家族[7]。除RND家族只存在于革蘭陰性菌外，其他4個家族(MFS、ABC、SMR、MATE)廣泛分布于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌[2]。③外排泵動力：ABC家族以ATP供能；SMR、MATE、RND家族和MFS則以質(zhì)子跨膜驅(qū)動力為外排動力。④外排底物種類：ABC和SMR家族外排泵的外排底物種類較少；MATE 和RND家族外排泵的外排底物包括多種抗菌藥物、消毒劑、染料等。

2耐藥外排泵在生物膜形成和生物膜介導耐藥中的作用

生物膜形成是臨床上定植菌難以清除的重要原因，生物膜形成后細菌耐藥性強于單個細菌(浮游細菌)。目前認為，細菌生物膜相關(guān)的耐藥機制可能與細菌生物膜誘導低生長率、改變代謝與生理、產(chǎn)生細胞外生物膜基質(zhì)和上調(diào)應激反應能力有關(guān)[8-9]。生物形成過程包括3個階段：初始黏附、成熟、形成分菌落[10]。此過程涉及多種環(huán)境刺激因子、特定基因和多種調(diào)節(jié)通路。細菌生物膜形成有賴于生物膜形成相關(guān)基因表達，從而增加菌毛數(shù)量、菌體外基質(zhì)纖維等，與相鄰細菌相互黏附構(gòu)成穩(wěn)固的三維立體膜結(jié)構(gòu)，提高細菌耐藥性。因此，外排泵介導細菌耐藥與生物膜介導細菌耐藥之間可能存在密不可分的關(guān)系。

2.1耐藥外排泵表達影響生物膜形成

在鼠傷寒沙門菌耐藥機制研究中，分別敲除或抑制9種外排泵〔AcrAB(AcrA 除外)、AcrD、AcrEF、MdtABC、MdsABC、EmrAB、MdfA、MdtK、MacAB〕和TolC，生物膜形成能力下降，但不影響細菌生長曲線。將攜帶外排泵基因的質(zhì)粒導入缺陷突變菌株后，又能恢復正常生物膜形成能力。剛果紅染色試驗中觀察到curli菌毛在外排泵敲除菌株中明顯減少，但菌體外基質(zhì)纖維素未減少。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)顯示，9種外排泵和tolC敲除突變株中，所有菌株csgB基因(curli菌毛合成相關(guān)基因)表達均顯著下調(diào)，9種突變株csgD表達顯著下調(diào)，acrB或tolC突變株的菌毛合成相關(guān)基因csgA、csgB、csgD、csgE、csgF、csgG均下調(diào)。前面提到的acrA基因敲除例外，但acrA基因缺失突變后可導致細菌多耐藥性、黏附力、侵襲能力下降。acrA突變株與acrB或tolC突變株的主要差別正是curli基因在acrA突變株中正常表達。綜上所述，推測鼠傷寒沙門菌耐藥外排泵可能改變curli菌毛合成相關(guān)基因表達水平，減少curli菌毛產(chǎn)生，影響細菌形成成熟的生物膜[11-12]。然而，最近有研究證明鼠傷寒沙門菌的acrAB或acrB基因敲除后并不影響細菌生物膜的形成；給予氯霉素處理后，突變株和野生株的生物膜形成才受影響[13]。這兩個相矛盾的研究結(jié)果提示，存在其他調(diào)控因子影響外排泵對生物膜形成的作用，因此如何更好地將外排泵抑制劑與抗生素聯(lián)合應用于耐藥菌感染的治療還需進一步研究。在鮑曼不動桿菌生物膜形成機制研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)RND家族外排泵adeG基因表達可誘導生物膜形成。AdeFGH外排泵參與鮑曼不動桿菌的生物膜形成，且abaI基因上調(diào)與adeG基因具有協(xié)同作用，可進一步促進生物膜形成。推測其分子機制為adeFGH基因過表達加速細菌群體感應分子〔?；呓z氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone，AHL)〕轉(zhuǎn)運至菌體外，菌體外AHL濃度不斷增加，反滲入菌體胞質(zhì)形成AbaR-AHL復合體，后者通過abaR(細菌群體感應轉(zhuǎn)錄調(diào)控子)激活abaI基因，使AHL合成增加，繼續(xù)通過過表達的外排泵泵出菌體外。如此周而復始，加強細菌間相互作用，促進生物膜形成[14]。此外，上調(diào)鮑曼不動桿菌多種RND泵、外膜蛋白 OmpA 和CarO 可促進生物膜形成。OmpA 和CarO可能作為細菌主要的L-組氨酸攝入通道，影響組氨酸代謝而促進生物膜形成[15]；而abeD缺失突變后不影響生物膜形成[16]。在大腸埃希菌耐藥機制研究中，腸集聚性大腸埃希菌tolC缺失突變后可能通過改變Mg2+轉(zhuǎn)運，在轉(zhuǎn)錄后修飾水平降低蛋白疏水性，提高其聚集性和生物膜形成能力；也可能通過某種TolC介導外排的體液因子(推測其為存在于AAF菌毛疏水蛋白表面的一種相對分子質(zhì)量為38 000的蛋白)，調(diào)節(jié)AAF菌毛疏水蛋白功能及表達量，提高其聚集性和生物膜形成能力。至于是否通過上述群體感應調(diào)控機制及TolC分泌抗原Ag43改變生物膜形成能力，還需進一步證實[17]。將大腸埃希菌RND家族(acrAB、acrD、acrEF、mdtABC、mdtEF)、MFS(emrAB、emrD、emrKY)、SMR家族(emrE)和ABC家族(macAB)的外排泵基因分別敲除后，生物膜形成能力均降低[18]。在大腸埃希菌IncX1大接合質(zhì)粒中，編碼OqxAB泵(RND家族)和Ⅲ型菌毛(mrkABCDF)的基因共同存在于復合轉(zhuǎn)座子(Tn6010和Tn6011)中，因此外排泵可影響菌毛表達，改變生物膜形成能力[19]。敲除嗜麥芽窄食單胞菌macABC基因后，生物膜形成減少50%[20]。在銅綠假單胞菌培養(yǎng)基中加入外排泵抑制劑PAβN(Phe-Arg-β-naphthylamide)和鐵離子螯合劑，發(fā)現(xiàn)生物膜形成減少[21]。脆弱類桿菌在膽鹽誘導下高表達RND外排泵基因，促進生物膜形成[22]。盡管許多研究證明上調(diào)外排泵表達可促進生物膜形成，但Yoon等在鮑曼不動桿菌耐藥機制研究中發(fā)現(xiàn)，過表達RND家族AdeABC和AdeIJK后細菌膜復合體結(jié)構(gòu)改變，從而降低細菌的生物膜形成率[23]。因此，不同細菌外排泵對生物膜形成的影響不同。在這些突變株中觀察到的外排泵對生物膜形成的影響可能是基于一些信號分子表達水平的改變，而這些信號分子很可能成為去除耐藥菌的靶分子，值得繼續(xù)研究。

2.2耐藥外排泵誘導浮游細菌耐藥，在生物膜包被細菌中與生物膜協(xié)同發(fā)揮作用

銅綠假單胞菌本身具有較高的生物膜介導耐藥能力，但體外研究發(fā)現(xiàn)其外排泵mexAB-oprM基因敲除后，可增強多黏菌素對生物膜包被細菌的殺傷力。這是通過MexAB-OprM泵和Pmr介導的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)修飾等多種機制改變生物膜包被細菌的多黏菌素代謝活性及多菌株共存能力，從而增強生物膜包被細菌對多黏菌素的耐藥性[24]。對氧氟沙星耐藥主要由MexAB-OprM泵介導，生物膜則依賴MexAB-OprM泵而稍提高其最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。這些菌株能在膜攻擊因子(多黏菌素和氯己定)作用下存活，不僅與MexAB-OprM 泵有關(guān)，MexCD-OprJ泵和MuxABC-OpmB泵也發(fā)揮重要作用。但研究并未證實AcrAB泵或MexAB-OprM泵可進一步提高生物膜介導的環(huán)丙沙星耐藥性。Mah等發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌外排泵缺失突變株通過MexAB-OprM外排泵下調(diào)表達而抑制生物膜的特異耐藥機制，可提高對大環(huán)內(nèi)酯類(阿奇霉素)的敏感性，因此MexAB-OprM外排泵對生物膜介導耐藥有協(xié)同作用[9]。在生物膜包被的銅綠假單胞菌中敲除OpmL-ABC-HlyD外排泵基因時，生物膜包被細菌對氨基糖苷類(妥布霉素)和喹諾酮類(環(huán)丙沙星)的敏感性增加。以上研究表明，生物膜既存在依賴外排泵的耐藥機制，也存在獨立而特異的耐藥機制。外排泵可進一步增強已形成的生物膜介導細菌耐藥。2.3耐藥外排泵依賴生物膜形成而誘導表達，生物膜形成相關(guān)基因同時被誘導表達研究發(fā)現(xiàn)，SagS和BrlR調(diào)控蛋白為生物膜介導耐藥所必需[25-26]。兩者結(jié)合可激活c-di-GMP第二信使[27]，它是氨基糖苷類誘導生物膜形成和耐藥的相關(guān)分子[28]。SagS與其他3個二聚體調(diào)控蛋白——BfiRS(調(diào)控生物膜初始黏附)、BfmRS(調(diào)控生物膜成熟)和MifRS(調(diào)控分菌落形成)在生物膜形成過程中協(xié)同發(fā)揮作用[24]。BrlR作為mexAB-oprM和mexEF-oprN基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，僅在生物膜形成細胞中表達[23]。brlR基因不能被外排泵底物誘導表達，與其他MerR型調(diào)控子(如BltR和BmrR)在外排泵底物誘導下調(diào)控耐藥不同[29]。滅活SagS可減少 c-di-GMP，因此c-di-GMP受SagS的正調(diào)控[25]。c-di-GMP進一步正調(diào)控BrlR，增強BrlR與啟動子(BrlR靶基因)的結(jié)合性[27, 30]。SagS、c-di-GMP、BrlR形成耐藥性轉(zhuǎn)換中的重要信號網(wǎng)絡，也為MexAB-OprM和MexEF-OprN泵基因高表達所必需(這兩個泵可提高生物膜包被細菌和浮游細菌的耐藥性)。有趣的是，浮游菌體c-di-GMP、BrlR、MexA和MexE高表達也可增加耐藥性[25]。滅活胞質(zhì)外功能σ因子(extracytoplasmic function σ factor) ECF-10可促進惡臭假單胞菌的生物膜形成，上調(diào)TtgABC耐藥泵[31]。在體外，利用熒光標記技術(shù)和共聚焦顯微鏡動態(tài)檢測mexAB-oprM基因在生物膜形成中的表達量，結(jié)果顯示暴露于多黏菌素后，直接接觸多黏菌素部位的細菌mexAB-oprM基因表達量未增加，而包繞多黏菌素生物膜外圍的細菌mexAB-oprM基因上調(diào)表達，表明外排泵在成熟生物膜這樣一個微環(huán)境中更易被誘導表達。Mah等也證實生物膜包被的銅綠假單胞菌多種外排泵被誘導表達，包括MexCD-OprJ和MexXY[9]。研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌A1875-PA1877編碼的外排泵在生物膜介導的環(huán)丙沙星、慶大霉素、妥布霉素特異耐藥中起重要作用[32]。大腸埃希菌UPEC 和K-12菌株中編碼解旋酶樣蛋白的rapA基因缺失突變后，其生物膜結(jié)構(gòu)正常但耐藥性下降，可提高對青霉素G的敏感性，而對浮游細菌的耐藥性無影響。這種突變株中有22種基因下調(diào)表達，包括編碼MDR外排泵YhcQ的基因。yhcQ基因在rapA突變株中低水平表達，表明RapA誘導生物膜形成的同時可提高yhcQ基因表達水平[33]。

綜上所述，外排泵在生物膜形成及生物膜介導耐藥機制中起重要作用。臨床實踐中，細菌在醫(yī)療器械如呼吸機和各種體內(nèi)植入物表面、感染部位形成生物膜一直是抗生素治療的難題。因此，研究細菌生物膜介導耐藥、外排泵介導耐藥及細菌生物膜與外排泵的內(nèi)在聯(lián)系非常必要。細菌外排泵不僅與細菌耐藥性有關(guān)，還與細菌生物膜形成息息相關(guān)。耐藥外排泵的上調(diào)或下調(diào)表達均可能改變細菌生物膜的形成。反之，形成生物膜的細菌又通過外排泵依賴和非依賴途徑介導耐藥。但并非所有外排泵抑制劑均對生物膜形成有抑制作用。外排泵通過何種信號分子而改變細菌生物膜形成能力至今尚不清楚，有待進一步研究。

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Research progress on bacterial multidrug efflux pumps and biofilm formation

CHEN Xiaoyan, PAN Jue

Department of Respiration, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Abstract:Multidrug-resistant bacteria and pan-drug resistant bacteria are major clinical concerns associated with misuse and abuse of antibiotics. The multidrug efflux pumps and biofilm formation, two mechanisms of drug resistance, are catching more attentions recently. Studies demonstrated that some efflux pumps in different bacteria influence biofilm formation, which in turn changes the gene expression of efflux pumps, indicating a possible interaction between multidrug efflux pumps and biofilm formation.

Key words:Multidrug efflux pump; Biofilm formation; Outer membrane factor

基金項目：上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題(201440394)

通信作者：潘玨

Corresponding author. PAN Jue, E-mail: jue.pan@yahoo.com

(收稿日期：2016-02-19)