龍建友 羅定貴 黃雪夏 陳永亨

(1.廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006；2.珠江三角洲水質(zhì)安全與保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心暨省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；3.廣東省放射性核素污染控制與資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

隨著核工業(yè)的發(fā)展、核技術(shù)的廣泛應(yīng)用及核能的需求日趨增大，尤其是人類活動(dòng)使得放射性核素不可避免地進(jìn)入環(huán)境，這些放射性核素進(jìn)入大氣、水體和土壤后，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成潛在的危害，銫-137(137Cs,以下簡(jiǎn)稱Cs)作為最危險(xiǎn)放射性核素之一，1860 年由德國化學(xué)家 BUNSEN 等首先發(fā)現(xiàn)，因其具有優(yōu)良的光電特性和強(qiáng)烈的化學(xué)活潑性，在材料制造、航空航天、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，一旦Cs被釋放到環(huán)境中，其可通過食物鏈轉(zhuǎn)移危害人類健康,因而如何去除這些進(jìn)入環(huán)境中的放射性核素已成為環(huán)境修復(fù)與治理的重要內(nèi)容[1]。目前，放射性核素治理的方法有物理和化學(xué)方法，如沸石吸附、離子交換、溶劑萃取等，但這些方法成本高，難以用于治理環(huán)境中的大面積污染，且易造成二次污染[2]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，生物修復(fù)技術(shù)尤其是微生物修復(fù)技術(shù)引起了人們的關(guān)注，生物修復(fù)技術(shù)與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法相比，具有可操作性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、環(huán)境美化的作用。同時(shí)，生物修復(fù)本身用的就是自然資源，不會(huì)造成二次污染，是一種生態(tài)友好的技術(shù)[3]。作為生物資源中的一種，微生物個(gè)體小、比表面積大、繁殖快，可以分解、轉(zhuǎn)化、吸附很多污染物，其對(duì)放射性核素的凈化起著重要作用[4]。開發(fā)經(jīng)濟(jì)實(shí)用的微生物修復(fù)技術(shù)來治理環(huán)境放射性污染，愈來愈受到科學(xué)家的關(guān)注，微生物雖然不能降解放射性核素，但微生物表面結(jié)合有許多表面蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，這些生物大分子與細(xì)胞膜結(jié)合蛋白富含多種活性基團(tuán)，這些活性基團(tuán)可以吸附放射性核素運(yùn)入液泡并與蛋白質(zhì)螯合起到脫毒、解毒的效果，即微生物把放射性核素運(yùn)入胞內(nèi)，就不容易運(yùn)出；同時(shí)，微生物在代謝的過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物與放射性核素結(jié)合后可以改變其化學(xué)或物理特性，從而影響其在環(huán)境中的遷移與轉(zhuǎn)化，從而使得放射性核素?cái)?shù)量和活度減至合理或達(dá)到盡量低的水平[5]?；谏鲜銮闆r，筆者以微生物培養(yǎng)物制成的生物吸附劑進(jìn)行了其對(duì)Cs吸附特性的研究，這是在對(duì)重金屬污染進(jìn)一步改善的同時(shí)獲得良好生物吸附劑新途徑的探討，為今后實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株、培養(yǎng)基與吸附劑制備

BAT-221菌株：由廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，分離大亞灣核電站周圍土壤。

培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉15 g，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min[7]。

吸附劑的制備：將培養(yǎng)好的BAT-221菌株洗滌后進(jìn)行離心得到菌體，將菌體置于60 ℃烘箱中烘8 h，最后將烘干的菌體用研缽研磨成粉末用于吸附。

1.2 儀器與試劑

儀器：JK08Q-THZ-C恒溫振蕩器；Perkin-Elmer 6000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)；VERTEX 70傅立葉變換紅外光譜(FTIR)儀；LDZX-40BⅠ立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器；TL-18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；SP-01生化培養(yǎng)箱；FEI Quanta400 FEG掃描電子顯微鏡(SEM)。

試劑：無水乙醇、HCl、NHO3、NaOH、Cs2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 (1 000 μg/mL)，均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 形態(tài)鑒定

將BAT-221菌株接種于培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h，用于SEM分析。

1.3.2 分子鑒定

16S rDNA基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增引物為：16F(5’-GGA TGA GCC CGC GGC CTA-3’)和16R(5’-CGG CCG CGG CTG CTG GCA CGT A-3’)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸3 min。基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序，將所得序列與NCBI的GenBank中已有的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST對(duì)比分析，用MEGA5.2進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用Kimura-2模型建NJ(Neighbor-joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹[8]。

1.3.3 吸附試驗(yàn)

取一定體積不同質(zhì)量濃度的Cs2+溶液置于100 mL 的錐形瓶中，用0.1 mol/L HNO3或NaOH將Cs溶液的pH調(diào)至一系列值，每組試驗(yàn)加入一定量的菌株粉末， 然后置于恒溫振蕩器中，控制溫度30 ℃，振蕩吸附一定時(shí)間后，測(cè)定菌株對(duì)Cs2+的吸附效果。

(1) pH的影響試驗(yàn)

將含80 mg/L Cs2+溶液pH分別調(diào)節(jié)至3、4、5、6、7、8，菌體粉末加入量為2.0 g/L,120 r/min振蕩吸附30 min，8 000 r/min下離心10 min，取上清液測(cè)定Cs2+濃度。

(2) Cs2+初始濃度的影響試驗(yàn)

菌體粉末加入量為2.0 g/L、pH=5、搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)，分別調(diào)節(jié)Cs2+質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100、120 mg/L,振蕩吸附30 min，8 000 r/min下離心10 min，取上清液測(cè)定Cs2+濃度。

(3) 反應(yīng)時(shí)間的影響試驗(yàn)

在Cs2+初始質(zhì)量濃度為80 mg/L、pH=5、搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min、菌體粉末加入量為2.0 g/L的條件下，振蕩吸附50 min，每5 min取一次樣，8 000 r/min下離心10 min，取上清液測(cè)定Cs2+濃度。

(4) 搖床轉(zhuǎn)速的影響試驗(yàn)

菌體粉末加入量為2.0 g/L， pH=5，Cs2+初始質(zhì)量濃度為80 mg/L,搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)為30、60、90、120、150、180 r/min，振蕩吸附30 min，8 000 r/min下離心10 min，取上清液測(cè)定Cs2+的濃度[9]。

1.3.4 SEM及FTIR分析

SEM分析：將充分干燥的菌株粉末制備SEM樣品， 置于室溫下掃描，觀察樣品形貌[10]。

圖1 吸附前后菌株SEM圖Fig.1 The scanning electron microscopy (SEM) of strain BAT-221 before and after adsorption

圖2 JF901707菌株的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the 16S rDNA genes of strain JF901707

FTIR分析：收集菌體沉渣，利用去離子水反復(fù)洗滌3次，然后置于60 ℃恒溫烘箱中烘干。取烘干的菌體2 mg，加入200 mg光譜純溴化鉀(質(zhì)量比1∶100)在瑪瑙研缽中研磨，壓成均勻透明的薄片， 利用FTIR儀對(duì)樣品進(jìn)行分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

菌株菌落的顏色為淡黃色，細(xì)胞呈柱狀，在培養(yǎng)基中不形成莢膜，不運(yùn)動(dòng)，周生鞭毛，孢子橢圓形或球形(見圖1)，表面光滑，不產(chǎn)生可溶性色素。

將培養(yǎng)好的菌株進(jìn)行DNA提取，并對(duì)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條1 381 bp的條帶，將其基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)菌株序列進(jìn)行BLAST對(duì)比。結(jié)果顯示，該菌株與蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)隸屬同一分支，因而將其命名為BacilluscereusBAT-221，并與相關(guān)種的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)，序列已提交NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，菌株基因序列登錄號(hào)為JF901707。

2.2 pH對(duì)吸附的影響

菌株在不同pH下對(duì)Cs2+的吸附率如圖3所示。由圖3可見，菌株對(duì)Cs2+的吸附率隨pH的增大先升高后降低。在pH=5時(shí)，吸附率達(dá)到最大(86.26%)。當(dāng)pH超過5時(shí)，吸附率開始下降。在低pH區(qū)域，吸附率較低的原因可能有兩個(gè)：一是吸附位點(diǎn)存在兩種離子的競(jìng)爭(zhēng)，分別是H+和Cs2+，低pH環(huán)境中高濃度H+具有更高遷移率，更容易占據(jù)吸附位點(diǎn)。也就是說，菌株的大多數(shù)吸附位點(diǎn)被H+所占據(jù)，由此使得Cs2+與吸附位點(diǎn)結(jié)合的可能性降低。二是在低pH下溶液呈酸性，鹽類金屬的溶解性和電離作用更活躍。相反，當(dāng)pH不斷增大，此環(huán)境下菌株吸附位點(diǎn)附近存在帶負(fù)電的離子，金屬離子帶正電，彼此間存在吸引力，對(duì)金屬離子的吸附有促進(jìn)作用[12]。

圖3 pH對(duì)吸附的影響Fig.3 Effect of different pH on adsorption of Cs2+

2.3 Cs2+初始濃度對(duì)吸附的影響

如圖4所示，吸附率隨Cs2+初始濃度的變化而發(fā)生較大的變化，呈先增大后減小的態(tài)勢(shì)。80 mg/L時(shí)吸附率最大，達(dá)86.00%。在20～80 mg/L時(shí)，吸附率上升明顯，很可能是存在于細(xì)菌表面的活性位點(diǎn)還沒有被全部利用，仍然存在可用位點(diǎn)，所以當(dāng)Cs2+濃度增加時(shí)，Cs2+與活性位點(diǎn)的接觸機(jī)會(huì)增加，吸附率增大。但當(dāng)Cs2+質(zhì)量濃度大于80 mg/L時(shí)，吸附率明顯下降，下降的原因可能包括：(1)Cs2+濃度進(jìn)一步增加時(shí)，溶液中的離子彼此間競(jìng)爭(zhēng)吸附活性位點(diǎn)，從而降低了菌體對(duì)Cs2+的吸附率；(2)對(duì)一定量的吸附劑而言，其吸附的位點(diǎn)是一定的，當(dāng)溶液中金屬離子達(dá)到一定濃度后，其吸附能力達(dá)到飽和，吸附就會(huì)受到限制，導(dǎo)致吸附率降低；(3)對(duì)于活性菌株而言，當(dāng)金屬離子濃度增加時(shí)，嚴(yán)重影響了微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖，甚至細(xì)胞會(huì)發(fā)生死亡現(xiàn)象，最后導(dǎo)致吸附率下降[13]。本研究與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的結(jié)果一致，溶液中金屬離子濃度過高或過低都不利于菌株對(duì)其的吸附，因此確定80 mg/L為最佳初始濃度。

圖4 Cs2+初始質(zhì)量濃度對(duì)吸附的影響Fig.4 Effect of initial Cs2+ concentration on its adsorption

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸附的影響

如圖5所示,吸附率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后趨于穩(wěn)定。在30 min時(shí)達(dá)到最大吸附率(為86.39%)；30 min以后，菌株對(duì)Cs2+的吸附趨于平衡?？赡苁怯捎谖介_始時(shí)，菌株表面存在大量可利用的吸附位點(diǎn)，經(jīng)過一段時(shí)間，菌株表面的可利用吸附位點(diǎn)由于固相與液相之間溶質(zhì)的分子間斥力而難以被利用，所以吸附率的增長(zhǎng)速度有所減緩。如果反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，菌株對(duì)Cs2+的吸附趨于平衡，其吸附主要是通過細(xì)胞的代謝和擴(kuò)張來實(shí)現(xiàn)，被吸附的Cs2+會(huì)被解吸到溶液中。綜上所述，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min[14]。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸附的影響Fig.5 Effect of reaction time on adsorption of Cs2+

2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)吸附的影響

如圖6所示，菌株對(duì)Cs2+的吸附率隨著轉(zhuǎn)速升高而先增大后減小。隨著轉(zhuǎn)速的升高，菌株與溶液中的Cs2+更容易接觸，吸附率增大。120 r/min時(shí)，吸附率達(dá)到最大(86.33%)。當(dāng)轉(zhuǎn)速升高到120 r/min后，吸附率開始逐漸下降，可能與Cs2+吸附傳質(zhì)速度、吸附液湍流度及外擴(kuò)散阻力有關(guān)。Cs2+吸附傳質(zhì)速度因吸附液湍流度的增大、外擴(kuò)散阻力減小而加快; 但當(dāng)吸附液湍流度過大時(shí)，Cs2+傳質(zhì)速度過快，嚴(yán)重影響了微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)速度從而造成微生物生物量嚴(yán)重下降，而生物量降低后，細(xì)胞表面的吸附位點(diǎn)也會(huì)減少，最終導(dǎo)致其吸附率也下降；另外，作為吸附劑的菌體其細(xì)胞壁受到外界的離心力過大，導(dǎo)致細(xì)胞破損，致使菌株與Cs2+接觸不良，影響了菌株對(duì)Cs2+的吸附效果。

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)吸附的影響Fig.6 Effect of rotation on adsorption of Cs2+

2.6 菌株吸附Cs2+的FTIR分析

菌株吸附Cs2+前后的FTIR分析如圖7所示。從圖7可知，菌株對(duì)Cs2+吸附前后的特征峰發(fā)生了變化，主要在3 400、2 900、1 600、1 000 cm-1附近。在3 400 cm-1附近出現(xiàn)了一個(gè)寬峰，吸附前該特征峰為3 408.83 cm-1，吸附后下降到3 399.09 cm-1，這一變化很可能是由于菌株細(xì)胞壁上負(fù)責(zé)吸附的基團(tuán)羥基(—OH)或者亞氨基(=NH)在起作用。在2 900 cm-1附近出現(xiàn)了一個(gè)尖峰，吸附前特征峰為2 926.02 cm-1，吸附后則平移到29 15.31 cm-1。該位置特征峰的平移，多是因?yàn)榫晡降闹饕δ芑鶊F(tuán)為次甲基(≡CH)。在1 600 cm-1附近出現(xiàn)了一個(gè)尖峰，吸附前該特征峰為1 639.20 cm-1，吸附后下降到1 628.01 cm-1，很可能是細(xì)胞壁上羧基(—COOH)的作用。特別是在1 000 cm-1附近，特征峰屬于雙峰形態(tài)，吸附前后分別為1 036.16、1 027.90 cm-1，很可能是因?yàn)榫晡降闹饕镔|(zhì)為醇類和酚類。由上述可知，JF901707菌株細(xì)胞壁中吸附Cs2+的主要官能團(tuán)可能為=NH、—OH、—COOH、≡CH、醇類和酚類物質(zhì)[15-16]。

圖7 菌株吸附Cs2+前后FTIR分析Fig.7 FTIR analysis of the strain before and after adsorbing Cs2+

3 結(jié) 論

(1) 通過SEM和16S rDNA序列分析，經(jīng)鑒定菌株為蠟狀芽孢桿菌，并命名為BacilluscereusBAT-221 (基因序列登錄號(hào)：JF901707)。

(2) 該菌株吸附Cs2+最佳條件為：pH=5，初始質(zhì)量濃度80 mg/L，反應(yīng)時(shí)間30 min，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min。在該條件下，菌株對(duì)Cs2+吸附率可達(dá)到86.39%。

(3) FTIR分析結(jié)果表明，菌株細(xì)胞壁上的=NH、—OH、—COOH、≡CH、醇類和酚類物質(zhì)對(duì)Cs2+的吸附起主要貢獻(xiàn)作用。

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