湯 歡，向 麗，趙 莎，孫 偉＊＊，葉 萌

（1.四川農(nóng) 業(yè)大學(xué)林學(xué)院 成都 611130；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所/中藥鑒定與安全性檢測評估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100700；3.中國中藥公司 北京 102600）

應(yīng)用DNA條形碼ITS2序列對市售藥材黃柏的鑒定研究＊

湯 歡1，2，向 麗2，趙 莎3，孫 偉2＊＊，葉 萌1＊＊

（1.四川農(nóng) 業(yè)大學(xué)林學(xué)院 成都 611130；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所/中藥鑒定與安全性檢測評估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100700；3.中國中藥公司 北京 102600）

目的：應(yīng)用DNA條形碼ITS2序列鑒定市售黃柏藥材及其混偽品，保障藥材質(zhì)量及用藥安全。方法：對90份藥材及其基原植物樣品進(jìn)行DNA提取，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增ITS2序列并進(jìn)行雙向測序，運(yùn)用CodonCode Aligner V3.7.1對測序峰圖進(jìn)行校對拼接，去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)，得到ITS2序列，運(yùn)用MEGA 6.1對序列進(jìn)行比對分析，基于K2P遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。結(jié)果：90份實(shí)驗(yàn)樣品均能提取到DNA，其DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增、測序，序列拼接剪切后均能得到高質(zhì)量ITS2序列。川黃柏和關(guān)黃柏基原物種黃皮樹和黃檗的種內(nèi)最大K2P遺傳距離分別為0.018和0.004，均遠(yuǎn)小于其與混偽品的種間最小K2P遺傳距離（0.051和0.056）；NJ樹結(jié)果顯示川黃柏和關(guān)黃柏聚為一支，其混偽品各自聚為一支。結(jié)論：基于ITS2序列的DNA條形碼技術(shù)可準(zhǔn)確、有效地鑒定市售黃柏藥材及其混偽品，為其市場監(jiān)管及用藥安全提供了一種高效的技術(shù)方法。

DNA條形碼 ITS2序列 黃柏 混偽品

黃柏Cortex phellodendri原名“蘗木”，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，“蘗木味苦寒。主五藏，腸胃中結(jié)熱，黃疸，腸痔，止泄利，女子漏下赤白，陰陽蝕創(chuàng)。一名檀桓。生山谷”。在1963-2000年的歷版《中華人民共和國藥典》（一部）中，在黃柏Cortex phellodendri項(xiàng)下列出黃柏來源為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.或黃檗Phellodendron amurense Rupr.除去栓皮的干燥樹皮。黃皮樹習(xí)稱“川黃柏”，黃檗習(xí)稱“關(guān)黃柏”。古代本草所記載的黃柏分布情況與現(xiàn)今“川黃柏”相符，而“關(guān)黃柏”在歷代本草中無記載，在1941年《朝鮮藥局方》和1957年《遼寧藥材》中才見有“關(guān)黃柏”的記載[1]。

隨著研究的深入，自2005年版《中華人民共和國藥典》（一部）開始，將“黃柏”分為Phellodendri chinensis cortex和 Phellodendri amurensis cortex兩種藥材，但對其功能主治敘述相同[2]。在最新出版的《中華人民共和國藥典》（一部）中也將黃柏Cortex phellodendri分 為P. chinensis cortex和P. amurensis cortex兩種藥材，但對其功能主治敘述相同。兩者均清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡，用于濕熱瀉痢、黃疽尿赤、帶下陰癢、熱淋澀痛、腳氣痿蹵、骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒、濕疹濕瘡等證。鹽（關(guān)）黃柏滋陰降火，用于陰虛火旺、盜汗骨蒸。兩者在性狀上有些微差異。川黃柏（其基原物種為黃皮樹P. chinense，下同）厚1-6 mm，外表面黃褐色或黃棕色，內(nèi)表面暗黃色或淡棕色，斷面深黃色；關(guān)黃柏（其基原物種為黃檗P. amurense，下同）厚2-4 mm，外表面黃綠色或淡棕黃色，內(nèi)表面黃色或黃棕色，斷面鮮黃色或黃綠色[3]。

川黃柏和關(guān)黃柏的基原物種黃皮樹和黃檗都是國家重點(diǎn)保護(hù)的76種野生藥材物種中的二級保護(hù)物種[4]。由于近年來川黃柏和關(guān)黃柏用量不斷增加，再加上川黃柏和關(guān)黃柏野生資源日益減少，導(dǎo)致市售川黃柏和關(guān)黃柏品質(zhì)逐年下降。近年來，隨著藥材市場不斷發(fā)展，摻偽造假現(xiàn)象層出不窮[5,6]。市場上不斷出現(xiàn)木蝴蝶Oroxylum indicum （L.） Kurz[7]、山楊Populus davidiana Dode[8]、密序吳 萸 Tetradium daniellii （Benn.） Hemsl.[9]、臭 辣吳 萸 Tetradium glabrifolium （Champ. ex Benth.）Hartley[10]、刺 楸 Kalopanax septemlobus （Thunb.）Koidz.[11]、楝 Melia azedarach L.[12]、番 薯 Ipomoea batatas （L.） Lam.[13]、合歡Albizia julibrissin Durazz.[14]等川黃柏和關(guān)黃柏混偽品。對于這些市售川黃柏和關(guān)黃柏混偽品，傳統(tǒng)鑒定較困難，急需找到一種快捷、有效的鑒定方法，以確保川黃柏和關(guān)黃柏的用藥安全。

近年來，中藥DNA條形碼鑒定研究得到快速發(fā)展[15-17]。DNA條形碼（DNA Barcoding）鑒定是利用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段對物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，該技術(shù)在傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)對物種準(zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)上，通過對樣品標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行測序，建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可以實(shí)現(xiàn)物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化，具有鑒定過程快、操作簡單、重復(fù)性和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[18-21]。中國學(xué)者首次提出將ITS2序列作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，并建立了以ITS2序列為主，psbA-trnH序列為輔的藥用植物類中藥材DNA條形碼鑒定體系[22-24]。陳士林課題組對753 屬4 800種藻類、真菌和高等植物的6 600條ITS2序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)ITS2序列在種級水平上的分辨成功率可達(dá)到92.7%[22]，遠(yuǎn)高于國際條形碼組織推薦的72%[25]。

目前，該體系已被廣泛應(yīng)用于鑒定中藥材及其混偽品中，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的鑒定能力[26-34]。《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》[35]的出版為藥典收載的中藥材品種提供了標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列。中藥材DNA條形碼鑒定方法正逐步實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)化和規(guī)范化[36]。本研究運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對市售川黃柏、關(guān)黃柏及其混偽品進(jìn)行鑒定，研究用DNA條形碼技術(shù)鑒定市售川黃柏、關(guān)黃柏的可行性，以期為川黃柏、關(guān)黃柏等皮用類中藥的快速準(zhǔn)確鑒定及其市場監(jiān)管和臨床用藥安全提供科學(xué)依據(jù)和保障。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共涉及川黃柏、關(guān)黃柏及其10種混偽品共90份樣品。其中，川黃柏藥材樣品（樣品號YC0079MT01-04、06、08、10-20、22、27-37，RC_ YC0079MT14-15、21，F(xiàn)DC426）共33份，均購自中國食品藥品檢定研究院、河北安國藥材市場、安徽亳州藥材市場、四川荷花池藥材市場、廣西玉林藥材市場、廣州清平藥材市場、河南禹州藥材市場、重慶儲奇門藥材市場、日本東京漢方藥店，川黃柏基原植物樣品（樣品號YC0079MT23-26，PS1593MT01）共5份，均采自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所和湖北神農(nóng)架；關(guān)黃柏藥材樣品（樣品號YC0068MT02-08，YC0068MT13-22，RC_ YC0068MT04，F(xiàn)DC334）共19份，均購自中國食品藥品檢定研究院、中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、吉林長白山、安徽亳州藥材市場、四川荷花池藥材市場，關(guān)黃柏基原植物樣品（樣品號YC0068MT09-12，PS1598MT03）共5份，均采自吉林長白山、北京東靈山、中國科學(xué)院華南植物園和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所；混偽品共28份樣品，分別來自四川、廣東、廣西、海南、安徽、河北、北京、上海、重慶等地。以上樣品絕大部分經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，詳細(xì)信息見表1。本研究中的90份樣品均獲得了ITS2序列，其序列均已提交至GenBank。另外，從GenBank下載了與各混偽品標(biāo)準(zhǔn)序列或主導(dǎo)單倍型（JQ898637、GQ434845、KP093206、DQ225862、JQ048740、KC621807、GU217653）相同或最相近的29條序列，通過剪切序列兩端的5.8S和28S區(qū)，獲得相應(yīng)的ITS2序列。樣品信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

樣品DNA提?。河?5%乙醇擦拭經(jīng)低溫干燥的基原植物葉片或藥材表面，取葉片約30 mg或取刮去外表皮的藥材約50 mg，用高通量組織研磨儀（中國Sceintz Biotech公司），在50 Hz頻率下研磨120 s后，加入核分離液[100 mmol·L-1Tris-HCl （pH=8.0），20 mmol·L-1EDTA（pH=8.0），0.7 mmol·L-1NaCl，2% PVP-40，0.4% b-巰基乙醇][35]清洗一至多次（800 μL/次）至上清液無色，用移液槍小心吸去上清液，留沉淀，再采用植物基因組DNA提取試劑盒（中國Tiangen Biotech公司）提取樣品總DNA。詳細(xì)操作步驟參見中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則及試劑盒說明書。

表1 研究所用材料信息表

PCR擴(kuò)增和測序：采用DNA條形碼ITS2序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。ITS2序列擴(kuò)增正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反 應(yīng) 體 系：以25 μL為 參 照，2×Taq PCR Master Mix（中 國Aidlab Biotech公 司）12.5 μL，正向和反向引物各1.0 μL（2.5 μmol·L-1），模板DNA量為50-100 ng（約2.0 μl所提的DNA液），再用dd H2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃變性5 min，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)均為：94℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸45 s），72℃延伸10 min[18]。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR情況，對出現(xiàn)清晰目的條帶的樣品進(jìn)行純化后，采用ABI 3730XL測序儀（美國Appli ed Biosystems公司）進(jìn)行雙向測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

使用CodonCode Aligner V3.7.1（美國Codon Code公司）對測序序列進(jìn)行質(zhì)量分析和校對拼接，去除低質(zhì)量區(qū)，將所得序列采用基于隱馬爾科夫模型HMMer注釋的方法，在ITS2 database網(wǎng)站（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）進(jìn)行注釋，剪去所得序列的5.8S端和28S端，獲得ITS2序列。之后，運(yùn)用MEGA 6.1（美國Molecular Evolutionary Genetics Analysis公 司）軟 件 將 全部119條ITS2序列進(jìn)行序列分析，并基于Kimura 2-parameter model（K2P）計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離，用鄰接法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，并用自舉檢驗(yàn)法Bootstrap 1 000次檢驗(yàn)各分支的支持率[37]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增

中藥材DNA提取是開展中藥材DNA條形碼研究的首要環(huán)節(jié)。藥材中普遍含有大量的次生代謝產(chǎn)物，采用核分離液洗滌后，可去除細(xì)胞核中大部分的多糖、多酚，提高DNA純度。將90份樣品用高通量組織研磨儀研磨后，用核分離液洗滌一至多次（800 μL/次），至上清液無色為止，再按DNA提取試劑盒的操作步驟提取樣品DNA，均能得到高質(zhì)量的DNA，其PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后均能顯示單一目的條帶，擴(kuò)增效率100%。測序后的序列在網(wǎng)站（http:// its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）進(jìn) 行ITS2注釋，剪去5.8S和28S區(qū)序列后，均能獲得到高質(zhì)量的ITS2序列。

2.2 ITS2序列分析

川黃柏和關(guān)黃柏的ITS2序列特征見表2和表3。川黃柏共38條ITS2序列，比對后長度226 bp，平均GC含量為36.1%（見表2），6個(gè)變異位點(diǎn)，9種單倍型（見表3）。關(guān)黃柏共24條ITS2序列，比對后長度226 bp，平均GC含量為36.3%（見表2），1個(gè)變異位點(diǎn)，2種單倍型（見表3）。關(guān)黃柏的這2種單倍型在川黃柏中都有，但本研究發(fā)現(xiàn)關(guān)黃柏的ITS2序列只在54位點(diǎn)有變異，若市售黃柏（包括關(guān)黃柏和川黃柏）的ITS2序列在另外5個(gè)位點(diǎn)（見表3）存在變異，則可以初步判定其是川黃柏。

2.3 BLAST及NJ樹分析

將實(shí)驗(yàn)獲得的90條ITS2序列在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)和GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST鑒定，結(jié)果表明ITS2序列能準(zhǔn)確鑒定川黃柏、關(guān)黃柏及其混偽品。運(yùn)用K2P模型，選取實(shí)驗(yàn)獲得的90條和從GenBank下載的29條ITS2序列中各物種的單倍型序列，以鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹（見圖1）。結(jié)果顯示，川黃柏和關(guān)黃柏聚為一支，其混偽品各自聚為一支。由此可知，運(yùn)用ITS2序列能將黃柏（川黃柏或關(guān)黃柏）和其混偽品區(qū)分開，具有較強(qiáng)的鑒定能力。

表2 川黃柏、關(guān)黃柏及其混偽品ITS2序列特征表

表3 川黃柏、關(guān)黃柏ITS2序列變異位點(diǎn)表

3 討論

3.1 DNA提取

川黃柏、關(guān)黃柏均為皮類藥材，藥材中多酚、多糖含量較高，研磨時(shí)，多酚極易氧化成醌類，使提取出的DNA帶顏色，在純化過程中很難去除，影響后續(xù)PCR反應(yīng)。本研究通過多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行優(yōu)化后能獲得質(zhì)量更高的DNA。具體優(yōu)化步驟如下：①取樣：取樣時(shí)盡量刮除樣品表皮，稱取約50 mg樣品，保證所取樣品未沾染其他物質(zhì)；②洗滌：向每管研磨好的樣品中加核分離液清洗一至多次（800 μL/次）至上清液無色，然后離心，用移液槍吸去上清液，提高所提DNA的純凈度；③水?。簩⒂煤朔窒礈爝^的樣品加入緩沖液GP1后，放入56℃水浴鍋中水浴8-12 h；④各試劑使用量可酌情進(jìn)行增減，以提高提取效率。

表4 川黃柏、關(guān)黃柏種內(nèi)遺傳距離及其與混偽品種間遺傳距離表

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的川黃柏、關(guān)黃柏及其混偽品鄰接（NJ）樹

3.2 應(yīng)用ITS2序列鑒定川黃柏、關(guān)黃柏及其混偽品的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性

本研究中，從不同產(chǎn)地收集的90份樣品均可穩(wěn)定地獲得其ITS2序列。說明采用ITS2序列鑒定川黃柏、關(guān)黃柏及其混偽品具有較好的穩(wěn)定性。登錄中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)網(wǎng)站（www. tcmbarcode.cn）進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)ITS2序列可準(zhǔn)確鑒定川黃柏、關(guān)黃柏及其混偽品，同時(shí)NJ樹顯示 川黃柏和關(guān)黃柏聚為一支，其混偽品各自聚為一支，表明運(yùn)用ITS2序列可以將黃柏（川黃柏或關(guān)黃柏）與其10種混偽品區(qū)分開。

本研究中，川黃柏和關(guān)黃柏在NJ樹中（見圖1）聚為一支，表明運(yùn)用ITS2序列不能將川黃柏和關(guān)黃柏區(qū)分開。Ryuk JA等[38]運(yùn)用ITS和rbcL序列對川黃柏和關(guān)黃柏進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)ITS和rbcL序列都不能區(qū)分開川黃柏和關(guān)黃柏，本研究的結(jié)果進(jìn)一步支持了他們的研究結(jié)果。在Ryuk JA等[38]的研究中，他們結(jié)合運(yùn)用RAPD及HPLC技術(shù)，才能較好地將川黃柏和關(guān)黃柏區(qū)分開。因此，若要找到一種更高效簡便的單純運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)鑒定川黃柏和關(guān)黃柏的方法，還需要搜集更多的樣品，并結(jié)合psbA-trnH、matK、rbcL等其他DNA條形碼序列進(jìn)行更深入的研究。

3.3 運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)鑒定中藥材的優(yōu)勢及意義

運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對中藥材進(jìn)行鑒定可以不受藥材外部形態(tài)不完整或已被加工成粉末、飲片的影響，能直接在分子水平上對中藥材進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定。DNA條形碼鑒定技術(shù)是實(shí)現(xiàn)中藥材市場監(jiān)控的有效手段，能夠確保原料藥來源準(zhǔn)確、保證制藥企業(yè)投料安全。因此，可將該技術(shù)在相關(guān)的藥材檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、藥材公司、生藥企業(yè)、藥材市場等地方進(jìn)行推廣應(yīng)用，為中藥材的準(zhǔn)確采購、市場流通及質(zhì)量監(jiān)管提供一種更高效的技術(shù)手段，切實(shí)保證中藥材的品質(zhì)，確保用藥安全。本研究為中藥材DNA條形碼鑒定法在中藥材檢驗(yàn)工作中的應(yīng)用提供了良好實(shí)例，隨著該技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)藥檢測技術(shù)的不斷融合、發(fā)展，必將會對整個(gè)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化起到巨大的推動(dòng)作用。

1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所.中藥志(第五冊).北京:人民衛(wèi)生出版社, 1994∶ 494.

2 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005∶ 99, 214.

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DNA Barcode Identification of Adulterants from Commercial Cortex Phellodendri Using ITS2 Sequence

Tang Huan1, 2, Xiang Li2, Zhao Sha3, Sun Wei2, Ye Meng1
(1. College of Forestry, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 3. China National Traditional Chinese Medicine Corporation, Beijing 102600, China)

In this study, Cortex phellodendri and its adulterants were identified by ITS2 sequence. The genomic DNAs were extracted from ninety samples, and the ITS2 sequences were amplified and bidirectionally sequenced. All the sequences were assembled by CodonCode Aligner V3.7.1. The genetic distances were computed by Kimura 2-parameter (K2P) model and Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.1. The results showed that the maximum intraspecific K2P genetic distance of Phellodendron chinense and Phellodendron amurense were 0.018 and 0.004, which were smaller than the minimum interspecific K2P genetic distance (0.051 and 0.056). The NJ tree showed that ITS2 sequence of P. chinense and P. amurense clustered into one clade, while each species of the adulterants clustered into one clade respectively. It was concluded that using ITS2 barcode can distinguish Cortex phellodendri and its adulterants, which provided an efficient technological method to identify Cortex phellodendri and its adulterants and had a great help for the market supervision.

DNA barcoding, ITS2 sequence, Cortex phellodendri, adulterants

10.11842/wst.2016.02.007

R282.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 科學(xué)技術(shù)部國家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2013ZX09301307）：基于中醫(yī)臨床轉(zhuǎn)化的中藥創(chuàng)新品種研發(fā)，負(fù)責(zé)人：陳士林。

＊＊ 通訊作者：孫偉，博士，助理研究員，主要研究方向：中藥資源與中藥分子鑒定；葉萌，博士，教授，主要研究方向：野生珍稀藥材資源開發(fā)利用。