邊艷琴，曹紅燕，李建緣，武 超，孫潤(rùn)菲，馮 輝，何小鵑，姜 淼，孫明瑜＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所 上海 201203；2.上海市中醫(yī)藥研究院 上海 201203；3.上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200052；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京 100700）

脂肪酸代謝異常是二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化發(fā)病機(jī)制之一＊

邊艷琴1,2,3，曹紅燕1,2，李建緣1,2，武 超1,2，孫潤(rùn)菲1,2，馮 輝3，何小鵑4，姜 淼4，孫明瑜1,2＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所 上海 201203；2.上海市中醫(yī)藥研究院 上海 201203；3.上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200052；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京 100700）

目的：二甲基亞硝胺（DMN）誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型是經(jīng)典的動(dòng)物模型，其病理變化與人類肝纖維化發(fā)生相類似。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為， DMN化學(xué)刺激導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷，是誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生的直接原因，然而其具體的發(fā)病機(jī)制并不清楚。糖脂代謝異常是脂肪性肝病發(fā)生的主要原因之一。糖脂代謝紊亂是否也在DMN誘導(dǎo)肝纖維化模型中占有重要地位，至今尚不清楚。本研究采用全基因芯片技術(shù)與生物信息技術(shù)相結(jié)合方式，研究糖脂代謝異常與DMN誘導(dǎo)肝纖維化之間關(guān)系。方法：雄性Wistar大鼠每周前3天連續(xù)腹腔注射10 mg·kg-1DMN，持續(xù)4周，正常組大鼠給予等量生理鹽水。造模2周末，正常組和模型組各5只大鼠做動(dòng)態(tài)觀察；造模4周末，剩余大鼠被全部處死，收集肝臟標(biāo)本。進(jìn)行肝組織全基因芯片分析，將結(jié)果導(dǎo)入生物信息分析軟件IPA進(jìn)行分析。結(jié)果：2周模型組與正常組之間、4周模型組與正常組之間共有55個(gè)共同差異基因（logRatio＞2）。共同差異基因構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)，主要參與了9條信號(hào)通路，它們與炎癥、免疫、肝纖維化、脂代謝和血管新生有密切關(guān)系。在造模2周（肝纖維化形成期）時(shí)，以脂肪酸代謝異常為主要表現(xiàn)；在造模4周（肝硬化形成期）時(shí)，以細(xì)胞增殖為主要表現(xiàn)。結(jié)論：脂肪酸代謝紊亂可能是DMN誘導(dǎo)肝纖維大鼠發(fā)病機(jī)制之一。

肝纖維化 大鼠 脂肪酸代謝 基因分析 發(fā)病機(jī)制

二甲基亞硝胺（Dimethylnitrosamine，DMN）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型是研究肝纖維化疾病常用的動(dòng)物模型，因其造模時(shí)間短，肝纖維化形成穩(wěn)定，且與人類肝纖維化早期改變及膠原纖維化沉積特點(diǎn)非常相似，停止染毒后又不易自行消退恢復(fù)，故是研究肝纖維化病理機(jī)制、血清標(biāo)志物評(píng)價(jià)及藥物治療等的經(jīng)典動(dòng)物模型之一[1]。DMN顯著的肝毒性已得到大家公認(rèn)，它在體內(nèi)通過(guò)代謝為具有高反應(yīng)活性的代謝物，例如乙醛[2，3]，與大分子如蛋白質(zhì)游離氨基酸、巰氫基團(tuán)等反應(yīng)，破壞這些大分子結(jié)構(gòu)；與細(xì)胞膜或線粒體膜表面膜蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，從而造成肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性增加[4]。

機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的生命體。越來(lái)越多的研究表明，生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性源于生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[5]。機(jī)體內(nèi)生物網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性相較于單一的基因或蛋白變化對(duì)機(jī)體表型的影響更大，這可能與基因冗余功能和信號(hào)通路的代償功能有關(guān)[6]。多數(shù)情況下，疾病發(fā)生，尤其是復(fù)雜類疾病發(fā)生的分子機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)異常所致[7]。DMN誘導(dǎo)的纖維化形成一直以來(lái)都被認(rèn)為是DMN的肝毒性所致，而由DMN引起的生物網(wǎng)絡(luò)異常進(jìn)而導(dǎo)致纖維化形成的生物學(xué)過(guò)程，目前并不清楚。

隨著生物知識(shí)的不斷積累和多層次“組學(xué)”數(shù)據(jù)的大量涌現(xiàn)，對(duì)復(fù)雜疾病的研究模式從以往的只關(guān)注某個(gè)分子擴(kuò)展到對(duì)分子之間相互作用形成的生物分子網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)分析，為揭示疾病形成的生物學(xué)過(guò)程提供幫助。本研究采用全基因芯片技術(shù)與生物信息學(xué)分析相結(jié)合的方式，來(lái)探索DMN誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型形成的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，為DMN肝纖維大鼠模型更好地應(yīng)用于科學(xué)研究提供證據(jù)支持。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量200±15 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證：SCXK（滬）2008-0003。上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)、造模和觀察，自由飲食。動(dòng)物房使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2009-0069。

1.2 試劑

DMN（和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：KWM6890）；二甲苯（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20101020）；無(wú)水乙醇（分析純，上海振興化工一廠，批號(hào)：20100115）；石蠟（德國(guó)Leica公司，批號(hào)：39601006）；甲醛[化學(xué)純，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：JH20070301]；甲醇（分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20090620）；天狼星紅Sirus Red（美國(guó)sigma公司，批號(hào)：43665）；中性樹膠（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：20061018）。Trizol、雜交試劑盒、體外轉(zhuǎn)錄的標(biāo)記試劑盒、單循環(huán)cDNA合成試劑盒、生物素化抗體、鏈霉素和藻紅蛋白等試劑及基因芯片掃描儀3000、基因芯片洗滌工作站（Affymetrix Fluidics Station 450）、Affymet rix基因芯片雜交爐640、GeneChipó操作軟件1.2等儀器、軟件均由上海生物芯片公司提供。

2 方法

2.1 造模方法

參照Ala-Kokko方法造模[8]。模型組大鼠以10 mg·kg-1劑量于每周前3天連續(xù)腹腔注射0.5% 的DMN溶液（以生理鹽水稀釋），持續(xù)共4周。造模2周末，等量來(lái)自正常和模型組的大鼠被處死；造模4周末，處死全部大鼠。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。

2.2 樣品的采集與處理

在實(shí)驗(yàn)2周末和4周末，待處死大鼠均用3%戊巴比妥鈉以2 mL·kg-1劑量腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，打開腹腔，經(jīng)下腔靜脈采血，待血液抽盡后，摘取肝臟，然后從肝臟最厚一葉切取1.0 cm× 1.0 cm大小肝組織2塊，10%中性福爾馬林固定，其余肝組織裝于干凈EP管中，-70℃保存?zhèn)溆?。選取一套標(biāo)本脫水、包埋、切片，做天狼星紅染色，觀察組織病理學(xué)變化。

2.3 肝組織天狼星紅染色

石蠟切片60℃烘片30 min→二甲苯I 10 min→二甲苯II 10 min→無(wú)水乙醇I 5 min→無(wú)水乙醇II 2 min→95%乙醇2 min→80%乙醇2 min→70%乙醇2 min→自來(lái)水沖洗→甩干、擦邊、滴加天狼星紅染液，置濕盒，37℃，30 min→100%乙醇分化→脫水，透明，中性樹脂封固。

膠原纖維增生程度分期標(biāo)準(zhǔn)：0期：正常肝臟，無(wú)明顯膠原纖維增生；Ⅰ期：膠原纖維增生，中央靜脈和門脈區(qū)有少量星狀膠原纖維束放散，但無(wú)間隔形成；Ⅱ期：膠原纖維增生，中央靜脈和門脈區(qū)結(jié)締組織變厚，由此向四周伸出纖維索，形成不完全間隔；Ⅲ期：膠原纖維大量增生，有個(gè)別菲薄的完全間隔形成，或較厚的不完全間隔即將形成假小葉；Ⅳ期：膠原纖維大量增生，完全纖維間隔較厚，假小葉大量形成。

2.4 肝組織基因芯片雜交實(shí)驗(yàn)

采用Trizol試劑盒提取總RNA→純化→合成cDNA→純化，參照BioArray（TM）HighYield（TM）RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒方法合成cRNA→將cRNA片段雜交于Afymetrix Rat 2302.0芯片→洗脫→染色→掃描芯片。基因芯片：Afymetrix Rat 2302.0基因表達(dá)譜芯片，共載基因探針31 099個(gè)。

2.5 基因芯片的數(shù)據(jù)處理

首先將信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和基于模型的表達(dá)指（Model Based Expression Index，MBEI）分析，得出校正后的數(shù)值，用于差異基因分析。特征性基因表達(dá)譜分析采用聚類分析法。特征性基因的篩選采用Fold change法，兩個(gè)芯片的每個(gè)基因之間倍數(shù)通過(guò)表達(dá)指數(shù)比值得出，以識(shí)別特征性基因，并用MBEI的標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)計(jì)算倍數(shù)的可信區(qū)間。本研究在組間進(jìn)行比較時(shí)，以倍數(shù)的可信下限作為基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 差異基因篩選

由于每組樣本中重復(fù)隨機(jī)樣本數(shù)量較少，一般較難達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的參數(shù)F檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，為了減少小樣本造成的差異篩選誤差，利用隨機(jī)抽樣和小樣本統(tǒng)計(jì)學(xué)的二次檢驗(yàn)，計(jì)算樣本間差異的顯著性水平（P值）和誤判率（FDR），得出真正代表多組樣本間顯著性差異的基因。選取差異2倍以上的上調(diào)及下調(diào)的差異基因進(jìn)行分析。

2.7 生物信息分析

將篩選所得2周DMN組與Control組比較差異基因、4周DMN組與Control組比較差異基因以及它們的共同差異基因依次導(dǎo)入（Ingenuity Pathway Analysis，IPA）生物分析軟件，分別構(gòu)建基于2周DMN組與Control組比較所得差異基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)、4周DMN組與Control組比較所得差異基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及它們差異基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用軟件中的Network、Canonical Pathway、Functions及Comparison等功能模塊進(jìn)行分析，獲得顯著差異基因參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及重要的生物學(xué)通路。同時(shí)，比較兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)參與調(diào)控的差異基因的生物學(xué)功能，尋找和分析二者的生物學(xué)通路的異同。

圖1 各組大鼠病理結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝組織病理變化

HE染色可以反應(yīng)組織的炎癥變化。如圖1A所示， Control組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列緊密。造模2周（2周DMN）時(shí)，大量炎細(xì)胞在肝竇內(nèi)彌漫浸潤(rùn)，有少量壞死組織，肝臟結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，表明炎癥反應(yīng)正在發(fā)生；造模4周（4周DMN）時(shí)，肝組織出現(xiàn)較廣泛的肝細(xì)胞壞死、小葉中心性出血及灶狀壞死形成，纖維組織大量增生，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝功能顯著異常，羥脯氨酸含量明顯增加[9-11]，提示纖維化和肝硬化的形成。HE染色結(jié)果提示，2周DMN組大鼠是以炎癥為主要病理表現(xiàn)，而4周DMN組大鼠是以纖維化和肝硬化形成為主要表現(xiàn)，這與以往研究結(jié)果一致[12，13]。膠原纖維在中央靜脈和門脈區(qū)開始沉積并向肝竇蔓延是肝纖維形成的標(biāo)志。如圖1B所示，Control組僅血管壁見少量膠原纖維的沉積；造模2周（2周DMN）時(shí)，中央靜脈和門脈區(qū)結(jié)締組織明顯增厚，并向肝竇蔓延伸出纖維索，形成不完全的間隔，提示纖維化已經(jīng)形成；造模4周（4周DMN）時(shí)，膠原纖維相較2周時(shí)明顯增多、增厚、變粗，相近的膠原纖維索相互連接包繞肝小葉形成假小葉，肝臟組織結(jié)構(gòu)被改變，大量膠原沉積在肝臟，提示肝纖維化向肝硬化的轉(zhuǎn)變。羥脯氨酸是膠原水解后的定量指標(biāo)，可以直觀反應(yīng)膠原含量的高低，與纖維化程度呈正相關(guān)[14]。本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致[15]，膠原沉積呈遞增趨勢(shì)，提示本研究DMN模型造模成功。

表1 各組顯著表達(dá)差異基因數(shù)目（Ratio＞2）

表2 共同差異基因相關(guān)的9條生物學(xué)信號(hào)通路

3.2 差異基因分析

選取變化倍數(shù)大于2倍的差異基因，并對(duì)比其中共同差異基因，結(jié)果如表1所示，2周DMN與正常組比較顯著差異基因共有133個(gè)，4周DMN與正常組比較顯著差異基因共有98個(gè)，其中共同差異基因共有55個(gè)。

3.3 共同差異基因參與調(diào)控的通路、網(wǎng)絡(luò)及生物學(xué)功能

將55個(gè)共同差異基因?qū)肷镄畔⒎治鲕浖?，分析其參與調(diào)控的通路、網(wǎng)絡(luò)及生物學(xué)功能。如圖2所示，共同差異基因參與通路主要有9條（如圖2A所示），根據(jù)-log（p-value）值從高到底排列，排在最前邊的表示其參與通路的比重最大。結(jié)果顯示，調(diào)控肝纖維的主要通路Hepatic Fibrosis/ Hepatic Stellate Cell Activation排在最前邊，表明篩選所得顯著差異基因與肝纖維化相關(guān)，是目標(biāo)基因。除肝纖維外，共同差異基因也參與脂代謝、炎癥、免疫和血管新生的調(diào)控，其中對(duì)脂代謝調(diào)控更加顯著（表2）。如圖2B所示，共同差異基因參與調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)是以SREBF1、TNF、MYC和NF-κB為核心的網(wǎng)絡(luò)，共同參與調(diào)控肝纖維化的形成。

圖3 2周DMN組與Control組、4周DMN組與Control組顯著差異基因分別參與生物學(xué)功能及功能的上游調(diào)控基因

3.4 2周DMN組、4周DMN組差異基因參與生物學(xué)功能及上游調(diào)控基因

對(duì)2周DMN組和4周DMN組差異基因參與生物學(xué)功能及上游調(diào)控基因進(jìn)行比較研究，結(jié)果如圖3A所示，2周DMN組差異基因參與生物學(xué)功能主要與脂肪酸代謝相關(guān)；4周DMN組差異基因參與生物學(xué)功能主要與細(xì)胞增殖相關(guān)。作者對(duì)排名第1位的生物學(xué)功能調(diào)控基因進(jìn)行分析，如圖3B所示，參與調(diào)控脂肪酸代謝的基因分別有SCD/SCD2、FASN、VIM、ACLY、FABP4和PTGS1（上調(diào)基因），ACSL1、CPT1A和FABP7（下調(diào)基因）；參與調(diào)控細(xì)胞增殖的基因較多，排名前5位的分別是COL1A1、NPY、Kng1、CTGF和CX3CL1（上調(diào)基因），CA3、FABP7、CYP2B6和INHBA（下調(diào)基因）。進(jìn)一步對(duì)參與調(diào)控脂肪酸代謝和細(xì)胞增殖的上游調(diào)控基因進(jìn)行分析，如圖3C結(jié)果提示，MLXIPL是調(diào)控脂肪酸代謝的上游調(diào)控基因，在脂肪酸代謝中被預(yù)測(cè)處于激活狀態(tài)，促進(jìn)FASN、SCD等基因表達(dá)，而抑制FGF21基因表達(dá)；TNF、MYC和TGFB1是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的主要上游調(diào)控基因；這提示除了炎癥反應(yīng)外，脂肪酸代謝異常是DMN誘導(dǎo)膠原增生、肝纖維化發(fā)生的另一重要原因。

4 討論

動(dòng)物模型的建立為研究人類疾病的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。人們對(duì)肝纖維化形成機(jī)制的了解，很大程度上取決于可靠的、可重復(fù)的動(dòng)物模型、各模型之間的共同點(diǎn)及人類肝纖維化發(fā)生過(guò)程的相關(guān)性。為了篩選有效的治療肝纖維化藥物和研究藥物作用機(jī)制，建立一個(gè)與人類疾病相似的肝纖維化動(dòng)物模型極為重要。DMN誘導(dǎo)的肝纖維化模型是經(jīng)典的肝纖維化動(dòng)物模型[8]，在國(guó)內(nèi)外肝纖維化發(fā)生機(jī)制和篩選藥物研究中被廣泛使用。既往認(rèn)為DMN的肝細(xì)胞毒性導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)和膠原的沉積，但對(duì)其導(dǎo)致的代謝系統(tǒng)紊亂機(jī)制的研究甚少。本研究借助生物信息分析技術(shù)，對(duì)造模2周和4周模型差異基因與共享差異基因生物網(wǎng)絡(luò)及生物學(xué)功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在肝纖維化形成的不同時(shí)間點(diǎn)，差異基因調(diào)控的生物學(xué)功能不同，2周差異基因參與調(diào)控脂肪酸代謝為主，4周差異基因參與調(diào)控細(xì)胞增殖為主，而共享差異基因代表肝纖維化的整個(gè)過(guò)程調(diào)控基因，主要與纖維化形成、炎癥、免疫、脂代謝、血管新生等生物學(xué)功能相關(guān)[16-18]。

脂代謝異常一直以來(lái)被認(rèn)為是非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生的重要原因，本課題組的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂代謝的異常也是DMN誘導(dǎo)的肝纖維發(fā)生的一個(gè)重要原因。脂肪酸代謝是肝臟內(nèi)重要的生理過(guò)程，正常狀態(tài)下處于動(dòng)態(tài)平衡。脂肪酸代謝，在過(guò)去僅被認(rèn)為是一個(gè)能量合成存儲(chǔ)途徑。然而，越來(lái)越多的研究表明，脂肪酸代謝是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，與人體內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌信號(hào)網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)，參與調(diào)控人體許多生理代謝過(guò)程[19，20]。脂肪酸代謝異常與腫瘤、高血壓、糖尿病、冠心病、脂肪肝等多種代謝性疾病密切相關(guān)[21-23]。

脂肪酸合成受脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)ASN）的調(diào)節(jié)，F(xiàn)ASN是一種多功能酶，對(duì)于脂肪酸的合成起著至關(guān)重要的作用。在還原型輔酶II存在情況下，F(xiàn)ASN負(fù)責(zé)乙酰輔酶和丙二酰輔酶A從頭合成長(zhǎng)鏈軟脂酸（棕櫚酸酯）的所有催化步驟[24]。FASN的表達(dá)水平可以直接反應(yīng)細(xì)胞和組織的脂肪合成能力，F(xiàn)ASN啟動(dòng)子活性的降低，可以明顯減少肝臟中甘油三酯水平及肝臟中脂肪的生成[25]。硬脂酰輔酶A脫氫酶[Stearoyl-CoA Desaturase（delta-9-desaturase），SCD]是脂肪酸代謝的另一種關(guān)鍵酶，它可以催化飽和脂肪酸的第一個(gè)雙鍵向acyl-CoA中加成，轉(zhuǎn)化為單一不飽和脂肪酸，為甘油三酯、膽固醇和膜磷脂等提供底物[26，27]。最新的研究結(jié)果顯示，SCD所結(jié)合的脂肪酸的?；溈杀籗CD屏蔽，使其形狀處于一個(gè)特定的構(gòu)型，這為脂肪酸代謝的選擇性提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN、SCD基因在2周DMN中表達(dá)均明顯上調(diào)，且處于上調(diào)基因的前2位，提示在DMN誘導(dǎo)2周模型中，脂肪合成顯著增加。脂肪酸合成延長(zhǎng) 酶6（ELOVL fatty acid elongase，E LOVL6）是長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的啟動(dòng)酶和延長(zhǎng)的限速酶，它的清除可以阻斷油酸的合成，但對(duì)脂肪酸的合成和胰島素抵抗沒有作用[29]。本研究結(jié)果顯示，ELOVL6 在2周DMN模型中表達(dá)上調(diào)，提示DMN誘導(dǎo)大鼠纖維化模型中，同時(shí)存在飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸合成異常。M LX相互作用蛋白（MLX Interacting Protein-Like，MLXIPL）是內(nèi)分泌特異的轉(zhuǎn)錄因子，是溝通糖代謝與脂代謝的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[30]。對(duì)肥胖者和正常人肝臟以及脂肪組織中的M LXIPL 的mRNA和蛋白表達(dá)的比較研究結(jié)果顯示，肥胖者肝臟中MLXIPL的mRNA和蛋白表達(dá)要高于正常人，大網(wǎng)膜和皮下脂肪組織中M LXIPL的mRNA和蛋白表達(dá)要低于正常人，而大網(wǎng)膜和皮下脂肪前體細(xì)胞中的MLXIPL的mRNA和蛋白表達(dá)要高于正常人[31]，這提示MLXIPL在調(diào)節(jié)肝臟脂代謝和脂肪組織脂肪代謝方面具有重要作用。本研究對(duì)DMN誘導(dǎo)的2周模型差異基因分析結(jié)果提示，MLXIPL是調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的上游基因，它可以促進(jìn)FASN、SCD和E LOVL6等脂肪酸合成調(diào)節(jié)催化酶的上調(diào)，被預(yù)測(cè)顯著激活，表明DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型存在明顯的糖脂代謝紊亂[32]，以基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的脂肪酸合成增加為主。

既往研究結(jié)果顯示，DMN誘導(dǎo)4周肝纖維化大鼠肝組織SOD活性下降，而Hyp和MDA表達(dá)明顯增加，且與SOD呈顯著負(fù)相關(guān)[33]，表明DMN模型存在脂質(zhì)過(guò)氧化損傷表現(xiàn)。脂肪合成大于消耗，就會(huì)導(dǎo)致肥胖。本研究結(jié)果顯示，在2周模型中，除炎癥反應(yīng)外，脂肪酸合成增加是另一主要表現(xiàn)且伴隨肝體比值的增加（結(jié)果未提供）；在4周模型中，則主要以細(xì)胞增殖為主伴隨肝體比下降（未提供），表明DMN誘導(dǎo)大鼠模型在從肝纖維化向肝硬化發(fā)展期，肝臟先增大后減小，脂肪酸合成先增加后減少，與肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化不一致，這提示DMN誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷與脂肪酸代謝異常引起的脂肪沉積可能不同步。最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21可以調(diào)節(jié)脂肪酸向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，減少肝臟脂質(zhì)堆積，促進(jìn)其線粒體氧化反應(yīng)發(fā)生和能量產(chǎn)生[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21在脂肪酸代謝過(guò)程中是下調(diào)的，提示脂肪合成與脂質(zhì)過(guò)氧化可能存在動(dòng)態(tài)平衡——脂肪酸向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)減少，促使脂肪消耗減少，合成增加；脂肪合成增加，能量消耗增加，當(dāng)能量不足時(shí)，脂肪酸才向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)增加，脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生，從而促使脂肪酸消耗增加，合成減少，脂肪堆積減少；脂肪在肝臟的大量堆積，刺激肝臟炎癥因子釋放，導(dǎo)致FASN等脂肪酸合成酶受損[35]，脂肪酸合成減少。

本研究發(fā)現(xiàn)，DMN誘導(dǎo)4周差異基因主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖過(guò)程，其上游是TNF、MYC和TGFB1。TNF是促使炎癥發(fā)生的重要基因，在4周DMN中處于自我抑制狀態(tài)；MYC是一組原癌基因，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及惡性轉(zhuǎn)化等生物學(xué)功能，TGFB1是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)增加的重要基因，提示在DMN誘導(dǎo)4周模型中，以細(xì)胞外基質(zhì)增加為主的細(xì)胞增殖過(guò)程的存在。對(duì)2周和4周差異基因的共享基因進(jìn)行構(gòu)網(wǎng)研究發(fā)現(xiàn)，以SREBF1、TNF、MYC和NF-κB為核心的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成肝纖維化發(fā)生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。固 醇調(diào)節(jié)單元連接轉(zhuǎn)錄因子1（Sterol Regulatory Element Binding Transcription Factor 1，SR EBF1）是編碼脂代謝調(diào)節(jié)因子的重要轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)脂肪酸、磷脂和三酰甘油的代謝，與胰島素抵抗、2型糖尿病、脂肪肝等密切相關(guān)[36，37]，可調(diào)節(jié)FASN蛋白的合成[38]；NF-κB是已知的炎癥核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，提示在肝纖維化發(fā)生的全過(guò)程中，脂肪酸代謝和炎癥發(fā)生是DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化發(fā)生的兩個(gè)重要原因，這與表2分析結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，從肝纖維化發(fā)展到肝硬化（從2周DMN到4周DMN），脂肪酸合成先增加后減少，其具體機(jī)制可能是脂肪酸合成酶上調(diào)，促使脂肪酸合成增加，脂肪酸向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)減少，導(dǎo)致線粒體脂肪酸氧化反應(yīng)消耗減少，進(jìn)一步導(dǎo)致脂肪酸合成增加，大量脂質(zhì)在肝臟積累；大量脂質(zhì)在肝臟的堆積，促使肝臟功能受損——尤其是肝臟轉(zhuǎn)錄期基因的表達(dá)，刺激肝臟炎癥因子的釋放[39]，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生；炎癥因子的大量產(chǎn)生，進(jìn)一步導(dǎo)致F ASN等脂肪酸合成酶受損[35]，從而促使脂肪酸合成減少，膠原生成細(xì)胞增殖增加，最終導(dǎo)致肝硬化的形成?？梢?，發(fā)生在炎癥反應(yīng)前的脂肪酸代謝異常，可能是啟動(dòng)DMN誘導(dǎo)肝纖維化大鼠發(fā)病的重要機(jī)制之一。

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Bian Yanqin1,2,3, Cao Hongyan1,2, Li Jianyuan1,2, Wu Chao1,2, Sun Runfei1,2, Feng Hui3, He Xiaojuan4, Jiang Miao4, Sun Mingyu1,2

(1. Institute of Liver Disease, Shuguang Hospital Affiliated with Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases of the Ministry of Education,

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2. Shanghai Institute of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 3. Guanghua Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai 200052, China; 4. Institute of Basic Research in Clinical Medicine, China Academy of Chinese Medicine Sciences, Beijing 100700, China)

Fatty Acid Metabolic Disorder is One of Mechanisms of Dimethylnitrosamine Induced Hepatic Fibrosis Rats

Dimethylnitrosamine (DMN)-induced hepatic fibrosis rat model is a classical model in hepatic fibrosis research over decades. It is recognized as the same pathological changes of hepatic fibrosis in chemical injury as in human. DMN chemical stimulation which induced hepatocyte injury is the direct cause of hepatic fibrosis. However, its pathogenetic mechanism i s not clear. Besides, glucolipid metabolism disorder is one of the main causes of fatty liver disease. Whether g lucolipid metabolic disorder plays an important role in DMN induced hepatic fibrosis also remains to be understood. So the purpose of this study was to know the relationship between glucolipid metabolic disorder and DMN induced hepatic fibrosis. Male Wistar rats were divided into the control group and DMN group randomly. DMN (10 mg·kg-1) was administered by i ntraperitoneal injection for consecutive three days each week for four weeks. Equal amount of normal saline was given to rats in the normal group. At the end of the second week, five rats that selected from control group and DMN group respectively were sacrificed to observe fibrosis stage. At the end of the fourth week, all the animals were sacrificed and liver samples were collected and prepared for detection in Affymetrix Gene Chip. Then significant differential genes were analyzed by bioinformatics software IPA. The results showed that there were 55 significant differential genes shared between two-week DMN group and the normal group, four-week DMN and the normal group (logRatio ＞ 2). Nine pathways were involved in molecular network that was established by the 55 significant differential genes, which highly correlated with inflammation, immune, hepatic fibrosis, lipid metabolism and angiogenesis process. It was found that fatty acid metabolism disorder was the main performance in the progression of D MN induced hepatic fibrosis (two-week DMN), while cell proliferation was the main behavior in the period of DMN induced hepatic cirrhosis in rats (four-week DMN). In conclusion, fatty acid metabolism disorder probably was another important cause of DMN induced hepatic fibrosis.

Hepatic fibrosis, rat, fatty acid metabolism, gene analysis, pathogenesis

10.11842/wst.2016.02.016

R575

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-10-15

修回日期：2015-10-26

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（ 81273729）：茵陳蒿湯調(diào)控Notch信號(hào)通路影響庫(kù)普弗細(xì)胞活化的效應(yīng)機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：孫明瑜；國(guó)家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項(xiàng)目（30701070）：茵陳蒿湯治療肝硬化的方證病理基礎(chǔ)研究，負(fù)責(zé)人：孫明瑜；上海中醫(yī)藥大學(xué)首屆杏林學(xué)者、上海市科委專項(xiàng)（15DZ1900104）：胃復(fù)春治療胃癌前病變及八寶丹防治肝性腦病的臨床和作用機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：孫明瑜。

＊＊ 通訊作者：孫明瑜，醫(yī)學(xué)博士，研究員，主要研究方向：炎癥-免疫-纖維化的發(fā)病機(jī)制及中藥效應(yīng)機(jī)理研究。。