余夢瑤，魏 巍，許曉燕，江 南，羅 霞

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥細胞與分子生物學(xué)實驗室，四川 成都 610041）

兩種茯苓固體發(fā)酵菌質(zhì)的制備及其主要成分含量測定*

余夢瑤，魏 巍，許曉燕，江 南，羅 霞**

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥細胞與分子生物學(xué)實驗室，四川 成都 610041）

采用固體發(fā)酵技術(shù)，得到兩種茯苓固體發(fā)酵菌質(zhì)。以茯苓（Poria coco） 為發(fā)酵菌株，分別以山藥（Dioscorea opposita）和面粉為培養(yǎng)基進行發(fā)酵，分別在茯苓菌絲滿瓶后40 d、50 d、60 d、70 d、80 d時取樣，測定樣品中茯苓酸、尿囊素、浸出物和水分的含量。結(jié)果表明，以山藥為基質(zhì)發(fā)酵茯苓，基質(zhì)含水量50%，轉(zhuǎn)化溫度25℃，轉(zhuǎn)化時間為茯苓菌絲滿瓶后60 d，可以制備良好的茯苓－山藥固體發(fā)酵菌質(zhì)；以面粉為基質(zhì)發(fā)酵茯苓，基質(zhì)含水量40%，轉(zhuǎn)化溫度25℃，轉(zhuǎn)化時間為菌絲滿袋后60 d，可制成良好的茯苓－面粉固體發(fā)酵菌質(zhì)。

茯苓；山藥；面粉；固體發(fā)酵

茯苓 [Poria cocos(Schw.)Wolf]是應(yīng)用較多的食（藥）用菌，為多孔菌科（Polyporaceae）臥孔菌屬（Poria）真菌茯苓的干燥菌核[1]。在茯苓中茯苓多糖為主要成分，具有提高機體免疫、抗腫瘤、抗衰老、抗炎等作用[2]，在醫(yī)學(xué)上有廣泛的應(yīng)用。

固體發(fā)酵（solid state fermentation）指體系在沒有或幾乎沒有自由水存在下，微生物在固態(tài)物質(zhì)上生長的過程。該過程中維持微生物活性需要的水主要為結(jié)合水或與固體基質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)[3]。其中中藥材固體發(fā)酵是現(xiàn)代生物技術(shù)和中藥學(xué)的完美結(jié)合，利用微生物強大的分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力，保護中藥活性成分免遭破壞，提高中藥藥效和活性成分的含量，節(jié)省藥源，減毒增效，并為中藥活性成分結(jié)構(gòu)修飾提供了新途徑。陳麗艷等[4]用猴頭菌發(fā)酵刺五加增強了抗疲勞作用。許曉燕等[5]用靈芝與丹參雙向固體發(fā)酵形成藥性菌質(zhì)，治療血瘀模型小鼠效果顯著。谷坤睿等[6]探索甘草渣和14種不同的靈芝菌株的復(fù)合型雙向發(fā)酵，結(jié)果表明，經(jīng)過真菌與中藥材雙向發(fā)酵后的菌質(zhì)藥效成分含量有不同程度的提高，是一種可行的中藥材制備技術(shù)。而利用茯苓菌發(fā)酵山藥和面粉的研究尚未見報道。本文采用茯苓山藥發(fā)酵和茯苓面粉發(fā)酵的新方法得到2種茯苓固體發(fā)酵菌質(zhì)，現(xiàn)把結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 發(fā)酵菌株

茯苓菌株，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥細胞與分子生物學(xué)實驗室提供。

1.2 發(fā)酵基質(zhì)

面粉（小麥粉）購買于紅旗超市，出自益海嘉里集團；山藥為藥用淮山藥，購于藥店。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂15 g，蒸餾水補足1 L，pH自然。

1.4 主要試劑

乙腈為色譜純；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.5 儀器設(shè)備

KXH-101-2A型熱鼓風(fēng)干燥箱，YX-400A型滅菌鍋，ZGX-300C型智能光照培養(yǎng)箱，W-201B型恒溫水浴鍋，LDZ5-2型低速自動平衡離心機，LDZ5-2型高速離心機，UV-2802型紫外可見分光光度計，Watersl525/2487高效液相。

2 方法

2.1 菌株活化

取茯苓菌種，按照無菌操作要求，轉(zhuǎn)接小菌塊在PDA斜面培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)6 d～7 d，待菌絲長滿后備用。

2.2 茯苓固體發(fā)酵菌質(zhì)的制備

2.2.1 茯苓－面粉固體發(fā)酵菌質(zhì)的制備

將活化好的茯苓菌種接種到制備好的培養(yǎng)基[7]上，其中基質(zhì)含水量為40%。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。分別在菌絲滿瓶后40 d、50 d、60 d、70 d、80 d時取樣進行成分含量分析。取樣時將樣品菌質(zhì)烘干粉碎備用，每個樣品做3個重復(fù)。面粉的處理按照參考文獻 [7]。

2.2.2 茯苓－山藥固體發(fā)酵菌質(zhì)的制備

培養(yǎng)基配制：每500毫升組織培養(yǎng)瓶中瓶裝入100 g山藥，加100 mL蒸餾水浸泡2 h，滅菌冷卻。將活化好的茯苓菌種接種到制備好的培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。分別在菌絲滿瓶后40 d、50 d、60 d、70 d、80 d時取樣進行成分含量分析。取樣時將樣品菌質(zhì)烘干粉碎備用，每個樣品做3個重復(fù)。

2.3 茯苓酸測定

2.3.1 樣品制備

取樣品0.5 g，加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，取濾液，干燥，加入1 mL甲醇溶解，供HPCL測定使用。

2.3.2 色譜條件

色譜柱 C18（Thermo， HYPERSil BDS，150 mm×4.6 mm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.2%磷酸溶液（φ）；按下表1條件梯度洗脫；流速1 mL·min-1；柱溫30℃；進樣量20 μL；檢測波長210 nm。

表1 梯度洗脫流動相比例Tab.1 Proportion of mobile phase of gradient elution

2.3.3 標(biāo)準曲線的繪制及樣品的檢測

分別配制茯苓酸標(biāo)準溶液0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1，按2.3.2的方法測定。

以茯苓酸的含量為x軸，以HPLC測得的峰面積為y軸做標(biāo)準曲線。將樣品供試液測定后，按標(biāo)準曲線查得相應(yīng)茯苓酸含量。

2.4 尿囊素測定

2.4.1 樣品制備

取樣品0.5 g，加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，取濾液，干燥，加入1 mL甲醇溶解，供HPCL測定使用。

2.4.2 色譜條件

色譜柱 NH2-C18（Thermo， HYPERSil SPS-2，150 mm×4.6 mm）；流動相為90%乙腈；流速1 mL·min-1，柱溫30℃；進樣量20 μL，檢測波長205 nm。

2.4.3 標(biāo)準曲線的繪制及樣品的檢測

分別配制尿囊素標(biāo)準溶液0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1，按2.4.2的方法測定。以尿囊素的含量為x軸，以HPLC測得的峰面積為y軸做標(biāo)準曲線。將樣品供試液測定后，按標(biāo)準曲線查得相應(yīng)尿囊素含量。

2.5 浸出物測定

參照《中國藥典》2005年版附錄ⅢA下的熱浸法測定[8]。

2.6 含水量測定

參照《中國藥典》2005年版附錄ⅨH第一法測定[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 苓酸含量

茯苓－面粉、茯苓－山藥發(fā)酵菌質(zhì)的茯苓酸含量變化見圖1。

圖1 茯苓－面粉、茯苓－山藥發(fā)酵菌質(zhì)中茯苓酸的含量變化Fig.1 Content variation of pachymic acid in Poria cocos with wheat flour fungal substance and P.cocos with Dioscorea opposite fungal substance

由圖1可以看出，在茯苓菌絲滿瓶后40 d～60 d內(nèi)茯苓－面粉、茯苓－山藥菌質(zhì)中茯苓酸含量逐漸升高；60 d以后茯苓－山藥菌質(zhì)中茯苓酸含量開始下降。茯苓酸是茯苓的主要活性成分，較高的茯苓酸含量可以作為2種新型菌質(zhì)產(chǎn)品開發(fā)的保證。因此在茯苓菌絲滿瓶后60 d采收發(fā)酵菌質(zhì)是合適的，此時菌質(zhì)中茯苓酸的含量最高。

3.2 尿囊素含量

茯苓－山藥菌質(zhì)中尿囊素的含量變化見圖2。

圖2 茯苓－山藥菌質(zhì)中尿囊素的含量變化Fig.2 Content variation of allantoin in Poria cocos with Dioscorea opposite fungal substance

由圖2可以看出，在茯苓菌絲滿瓶后，茯苓－山藥菌質(zhì)中尿囊素含量先逐漸減低再略有升高達到平衡，60 d以后尿囊素含量保持穩(wěn)定。尿囊素是山藥中的主要藥性成分，尿囊素的降低可能是山藥與茯苓雙向發(fā)酵過程中物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的結(jié)果。60 d以后尿囊素含量保持不變，可能是菌質(zhì)中藥效成分相互轉(zhuǎn)化達到平衡的結(jié)果。尿囊素是山藥的標(biāo)志性成分，所以茯苓-面粉發(fā)酵菌質(zhì)中沒有測定其含量。

3.3 浸出物含量

茯苓－面粉、茯苓－山藥發(fā)酵菌質(zhì)中浸出物的含量變化見圖3。

圖3 茯苓－面粉、茯苓－山藥發(fā)酵菌質(zhì)中浸出物的含量變化Fig.3 Content variation of extract in Poria cocos with wheat flour fungal substance and P.cocos with Dioscorea opposite fungal substance

由圖3可以看出，在茯苓菌絲滿瓶后茯苓－面粉、茯苓－山藥菌質(zhì)中浸出物含量變化不大；在發(fā)酵60 d時茯苓－面粉菌質(zhì)中的浸出物含量最大；在發(fā)酵80 d時茯苓－山藥菌質(zhì)中浸出物的含量最大。

3.4 水分含量

茯苓－面粉、茯苓－山藥發(fā)酵菌質(zhì)含水量的變化見表2。

表2 茯苓－面粉與茯苓－山藥發(fā)酵菌質(zhì)中含水量的變化Tab.2 Substrate moisture variation of Poria cocos with wheat flour fungal substance and P.cocos with Dioscorea opposite fungal substance

由表2可知，在茯苓菌絲滿瓶后茯苓－面粉、茯苓－山藥菌質(zhì)中的含水量基本保持穩(wěn)定。茯苓-山藥菌質(zhì)中，含水量在11%左右；茯苓-面粉菌質(zhì)中，含水量在15%左右。面粉在發(fā)酵過程中更容易保持水分。

4 討論

中藥發(fā)酵是中藥學(xué)與微生物學(xué)兩門學(xué)科的重要結(jié)合點之一。山藥或面粉不僅作為藥性基質(zhì)提供茯苓菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)，而且茯苓菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的酶，會與基質(zhì)中的山藥或面粉發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，使山藥或面粉中原有物質(zhì)被修飾或分解，從而產(chǎn)生底物衍生物或新的成分；同時產(chǎn)生的菌質(zhì)是真菌菌絲體利用山藥或面粉基質(zhì)構(gòu)造專性產(chǎn)物，生物轉(zhuǎn)化作用改變山藥或面粉單一基質(zhì)的藥效，產(chǎn)生生物級聯(lián)放大效應(yīng)。其中，山藥經(jīng)茯苓菌轉(zhuǎn)化后使一些大分子轉(zhuǎn)化為多種活性小分子，更利于吸收，且提高藥效[10]。

本文通過茯苓酸、尿囊素、浸出物、含水量4項質(zhì)控指標(biāo)，建立了茯苓－山藥、茯苓－面粉固體發(fā)酵菌質(zhì)的制備方法：以山藥為基質(zhì)，基質(zhì)含水量50%，轉(zhuǎn)化溫度25℃，轉(zhuǎn)化時間為茯苓菌絲滿袋后60 d，茯苓酸含量最高，尿囊素、浸出物和水分保持相對穩(wěn)定，可以制備良好的茯苓－山藥固體發(fā)酵菌質(zhì)。以面粉為基質(zhì)，基質(zhì)含水量40%，轉(zhuǎn)化溫度25℃，轉(zhuǎn)化時間為菌絲滿袋后60 d，茯苓酸含量最高，尿囊素、浸出物和水分保持相對穩(wěn)定，可以制備良好的茯苓－面粉固體發(fā)酵菌質(zhì)。

本試驗采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)固體茯苓菌種，菌體長勢良好，菌絲濃密潔白分布均勻。固體發(fā)酵條件成熟，菌體生長及產(chǎn)物穩(wěn)定。通過HPLC法確定發(fā)酵菌質(zhì)中有效物質(zhì)含量，確立了一種發(fā)酵茯苓菌質(zhì)的新方法。對于茯苓－面粉和茯苓－山藥兩種新型茯苓菌質(zhì)，還需進一步提純及結(jié)構(gòu)鑒定，以確定是否有新化合物的產(chǎn)生。該項工作為新藥開發(fā)提供了思路。通過藥理學(xué)方法對比分析茯苓菌質(zhì)與茯苓、山藥及面粉的活性，為該菌質(zhì)的應(yīng)用提供依據(jù)，也是下一步的工作內(nèi)容之一。

[1]張敏，高曉紅，孫曉萌，等.茯苓的藥理作用及研究進展[J].北大大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，1（9）：63-68.

[2]李雪，羅秀萍，梁宏東，等.茯苓多糖的研究進展[J].畜牧與飼料科學(xué)，2015（4）：45-46，53.

[3]莊毅，洪凈.藥用真菌雙向性固體發(fā)酵工程與中成藥藥渣再開發(fā)[J].中國中藥雜志，2006（22）：1918-1919.

[4]陳麗艷，金爽，張迎，等.猴頭菌發(fā)酵炮制中藥刺五加對

[5]許曉燕，鄭林用，李艷，等.靈丹菌質(zhì)雙向發(fā)酵工藝及藥效品質(zhì)研究[J].中國食用菌，2010，29（2）：28-31.

[6]谷珅睿，秦俊哲，陳合.14個靈芝菌株的新型（雙向型）固體發(fā)酵及菌質(zhì)多糖含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，4（16）：313-314.

[7]羅霞，魏巍，余夢瑤，等.培養(yǎng)食藥用菌的固體發(fā)酵基質(zhì)及其制備方法和用途[P].

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄56.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄47.

[10]陳麗艷，張迎，金爽，等.黃芩經(jīng)側(cè)耳菌和黑曲霉發(fā)酵后黃酮類成分的變化[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（5）：63.

Preparation and Main Component Content of Two Novel Poria cocos Fungal Substances by Solid-Fermented Technique

YU Meng-yao,WEI Wei,XU Xiao-yan,JIANG Nan,LUO Xia
(Cellular and Molecular Lab of Chinese Materia Medica,Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences,Chengdu 610041, China)

Two novel Poria cocos fungal substances by solid state fermentation (SSF)were produced.P.cocos was fermented in Dioscorea opposite and wheat flour respectively.The fungal substance was harvested at 40 d,50 d,60 d,70 d,80 d after mycelia overgrown the bottle.The contents of water,extract,allantoin,pachymic acid were determined.The results showed that P.cocos with D.opposite fungal substance was got with 50%substrate moisture in 25℃at 60 d after mycelia overgrown the bottle,and the P.cocos with wheat flour fungal substance was got with 40%substrate moisture in 25℃at 60d after mycelia overgrown the bottle.

Poria cocos;Dioscorea opposita;wheat flour;solid state fermentation

S646.9

A

1003-8310（2016）02-0050-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.02.013

四川省杰出青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人資助計劃（2014JQ0024）；四川省科技廳條件平臺建設(shè)項目（A－2014N－37）；四川省精深加工研究崗位建設(shè)項目（川農(nóng)業(yè)（2009） 75號）；四川省農(nóng)業(yè)微生物資源共享平臺建設(shè)（15010302）；科研院所成果轉(zhuǎn)化資金項目（14010156）；以精深加工為核心的食藥用菌產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)集成與產(chǎn)業(yè)化（成財教〔2013〕265）;四川省科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項（A－2014N－38）。

余夢瑤（1981－），男，博士，副研究員，主要從事菌類藥材方面研究。E－mail:50086283@qq.com

**通信作者：羅霞（1974－），女，博士，研究員，主要從事菌類藥材方面研究。E－mail:287748567@qq.com

2016－01－15