梁潘霞，劉永賢

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧 530007)

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植物硒蛋白不同提取方法的綜述

梁潘霞，劉永賢*

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧 530007)

摘要：硒(Se )是生物必需的一種微量元素，其生物學(xué)功能主要是以硒蛋白的形式表現(xiàn)的，植物硒蛋白具有抗氧化、抗癌、提高免疫力等功能.綜述了硒在植物中的存在形態(tài)、硒蛋白的分類及提取方法，并提出今后的研究方向.參21.

關(guān)鍵詞：硒；硒蛋白；提?。恢参?/p>

硒(Se)作為人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，具有防癌、抗癌、提高免疫能力和生殖機(jī)能，預(yù)防和治療心血管疾病、克山病和大骨節(jié)病多種地方性疾病等多重功效.全球目前有40多個(gè)國(guó)家及地區(qū)缺硒，我國(guó)大部分處于缺硒地帶，從東北到西南跨越了22個(gè)省市自治區(qū)，有70%多的區(qū)域不同程度缺硒.土壤缺硒可能導(dǎo)致人類膳食結(jié)構(gòu)中缺硒而產(chǎn)生相應(yīng)病變[1].大量研究表明有機(jī)硒比無(wú)機(jī)硒更安全、更易被機(jī)體吸收，其生理活性和吸收率要優(yōu)于無(wú)機(jī)硒，尤其是蛋白硒及硒代氨基酸毒性小、生物利用率高，因此如何從植物中獲取具有生物活性、高純度的硒蛋白和硒代氨基酸，已成為人們研究的熱點(diǎn)之一[2-7].作者對(duì)硒蛋白的提取技術(shù)和方法的發(fā)展進(jìn)行綜述.

1植物硒形態(tài)存在形式

硒被植物吸收到體內(nèi)后形成無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒兩大類化學(xué)形態(tài).無(wú)機(jī)硒較少，占硒總量的8%，主要是硒酸、亞硒酸和其他一些無(wú)機(jī)形態(tài)，有機(jī)硒占硒總量80%以上，由大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物組成.大分子硒主要包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等，其中硒蛋白是大分子硒的主要存在形態(tài).小分子硒化物包括硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒甲基硒半胱氨酸、硒代高胱氨酸和硒肽等.在硒積蓄植物中硒結(jié)合蛋白很少，硒可能作為硒代胱硫醚和甲基硒代半胱氨酸等含硫氨基酸代謝中間產(chǎn)物類似物存在;在非積聚植物中，硒多與蛋白質(zhì)結(jié)合，而且主要以硒代蛋氨酸存在，也有硒代半胱氨酸存在.硒代氨基酸是人類日常膳食中獲取硒的主要來(lái)源[8].

Rotruck在1973年首次證明細(xì)胞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是一種含硒酶，硒是該酶的活性組分，因此拉開(kāi)了硒蛋白的研究序幕.硒蛋白是硒的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)形式.目前對(duì)含硒蛋白有3種不同的分類方法：(1)按硒代謝形式分為：硒蛋白和含硒蛋白.硒蛋白是在基因密碼子UGA編碼下以硒代半胱氨酸形式特異進(jìn)入蛋白質(zhì)的那些蛋白，而把其它結(jié)合硒的蛋白質(zhì)稱為含硒蛋白，有時(shí)為表述方便也把一些含硒蛋白稱為硒蛋白[9].由于在有酶活性的硒蛋白中，硒代半胱氨酸往往參與構(gòu)成酶的活性中心，故又稱之為硒酶.由含硒氨基酸構(gòu)成的硒蛋白因具有重要的生理功能從而得到了廣泛的研究；(2)按硒在蛋白質(zhì)中的存在形式分為：含硒代半胱氨酸蛋白、含硒代蛋氨酸蛋白、鍵合硒蛋白、其他硒蛋白等；(3)按硒蛋白的生物化學(xué)功能分為：氧化還原蛋白、運(yùn)硒蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、甲基受體蛋白等.

2硒蛋白提取的研究

硒蛋白的提取與分離，是深入研究其生物與化學(xué)形態(tài)的前提.由于硒形態(tài)具有不穩(wěn)定性，在硒蛋白提取的過(guò)程中應(yīng)保證其生物與化學(xué)形態(tài)不發(fā)生變化，這比僅僅檢測(cè)硒元素復(fù)雜得多，因此需要尋找合適的提取方法.目前硒蛋白提取方法有溶劑提取法、柱分離技術(shù)、生物學(xué)方法等、輔助提取技術(shù)等.

2.1水提法

稱取一定量的富硒樣品脫脂干粉，加入適量雙蒸水，室溫下攪拌提取.離心后取上清液.再在殘?jiān)蟹謩e加入一定量水?dāng)嚢柚貜?fù)提取2次，合并3次所得提取液，即得水溶性硒蛋白溶液.在硒蛋白提取中pH、溫度、浸提時(shí)間、料液比(w/v)、提取次數(shù)等因素都會(huì)影響水溶性硒蛋白提取效果.同時(shí)，由于樣品不同所得水溶性蛋白中硒含量也不相同.文獻(xiàn)[10]用蒸餾水作為富硒大蒜含硒蛋白提取溶劑，蛋白提取率達(dá)19.42%，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定提取富硒蒜粉最佳水溶性蛋白浸提條件為：提取時(shí)間為4 h、pH為7.0、料液比為1∶35、溫度為4 ℃.文獻(xiàn)[11]用水提法提取黑木耳水溶性蛋白，其中水溶性蛋白質(zhì)中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可高達(dá)79.07 mg/kg，說(shuō)明水溶性蛋白質(zhì)中含有較多的微量元素硒.文獻(xiàn)[12]從荸薺中提取的水溶性蛋白質(zhì)中硒的含量最低，只有17.16 μg/g.文獻(xiàn)[13]從魔芋中提取的水溶性蛋白中的硒含量?jī)H為0.164 μg/g.文獻(xiàn)[13]從蛹蟲草提取的水溶性蛋白占總蛋白硒的20.47%～24.60%.文獻(xiàn)[14]采用蒸餾水、pH8.5和6.0的KH2PO4—NaH2PO4緩沖溶液、稀鹽、乙醇、稀堿分別依次提取富硒蘿卜葉中不同種類的蛋白質(zhì)，其中水溶性蛋白結(jié)合硒含量最高，占樣品含硒量的26.78%.水提取法對(duì)硒甲基硒代半胱氨酸、谷氨?；谆⑽腚装彼岬纫恍┓墙Y(jié)合蛋白形式的硒形態(tài)較適合，但對(duì)以蛋白形式結(jié)合的硒回收率較差.

2.2鹽提法

此法適用于鹽溶性硒蛋白的提取.在提取水溶性硒蛋白后的殘?jiān)屑右欢舛萅aCl溶液，室溫下攪拌提取，離心后取上清液.再在殘?jiān)蟹謩e加入一定量相同濃度的NaCl重復(fù)提取2次，合并3次所得提取液，即得鹽溶性硒蛋白溶液.武蕓等用鹽提法提取黑木耳鹽溶性蛋白，其中鹽溶性蛋白質(zhì)中硒的含量可高達(dá)35.32 mg/kg.文獻(xiàn)[14]從荸薺中提取的鹽溶性蛋白質(zhì)中硒的含量達(dá)871.62 μg/g.文獻(xiàn)[15]用0.5 M NaCl提取富硒綠茶中鹽溶性蛋白質(zhì)，得到的硒含量為1.53 μg/g.文獻(xiàn)[13]從蛹蟲草提取的水溶性蛋白占總蛋白硒的55.13%～56.80%.

2.3酸提法

在提取鹽溶性硒蛋白質(zhì)后的殘?jiān)屑尤胍欢舛鹊膒H6.0的KH2PO4—NaH2PO4緩沖液，攪拌提取，離心后取上清液.再在殘?jiān)蟹謩e加入一定量相同濃度的pH6.0的KH2PO4—NaH2PO4緩沖液重復(fù)提取2次，合并3次所得提取液，即得弱酸溶性硒蛋白溶液.文獻(xiàn)[11]用酸提法提取黑木耳酸溶性多糖硒占黑木耳總硒的12.65%，酸溶性蛋白中硒的含量可高達(dá)78.32 mg/kg.酸提取法回收率很高，但酸易使硒形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，在0.1 mol/L HCl強(qiáng)酸條件下，蛋白質(zhì)提取率低，且蛋白活性喪失高.

2.4醇提法

此法適用于醇溶性硒蛋白的提取.在鹽溶性蛋白硒提取后的殘?jiān)屑舆m量一定濃度的乙醇室溫下提取.離心，取上清液(保留沉淀)，加一定量的雙重蒸餾水，4 ℃靜置過(guò)夜.離心，轉(zhuǎn)速同上.取沉淀，凍干，一定濃度的乙醇溶解，降低乙醇濃度對(duì)蛋白質(zhì)沉淀分級(jí)，用一定濃度的乙醇定容.文獻(xiàn)[14]從荸薺中提取的醇溶性蛋白質(zhì)中硒的含量高達(dá)3 709.3 μg/g.文獻(xiàn)[13]從蛹蟲草提取的醇溶性蛋白占總蛋白硒的15.30%～16.49%

2.5堿提法

在提取弱酸或者醇溶性硒蛋白后的殘?jiān)屑尤胍欢舛鹊膒H8.5的KH2PO4—NaH2PO4緩沖液，攪拌提取，離心后取上清液.再在殘?jiān)蟹謩e加入一定量的pH8.5的KH2PO4—NaH2PO4緩沖液重復(fù)提取2次，合并3次所得提取液，即得弱堿溶性硒蛋白溶液.文獻(xiàn)[16]采用水提、堿提、醇提和酶提4種提取法對(duì)富硒靈芝子實(shí)體的總糖、硒及蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，結(jié)果表明提取率依次為堿提法、酶提法、水提法、醇提法.文獻(xiàn)[15]用0.1 mol/L氫氧化鈉為提取液對(duì)富硒茶葉中硒蛋白進(jìn)行提取，確定料液比1∶30 g/mL、提取時(shí)間16 h、提取溫度40 ℃時(shí)為最佳提取條件.文獻(xiàn)[11]用堿提法提取黑木耳堿溶性多糖硒占黑木耳總硒的4.78%，酸溶性蛋白中硒的含量可高達(dá)44.17 mg/kg.文獻(xiàn)[13]從蛹蟲草提取的堿溶性蛋白占總蛋白硒的2.99%～3.35%.文獻(xiàn)[17]確定富硒食用菌中硒蛋白提取的最佳工藝條件為：NaOH濃度為0.069 2 mol/L，溫度為60.62 ℃，料液比(w/v)為1∶24.69，提取時(shí)間為8 h，提取次數(shù)為2次，在此條件下，蛋白的得率為30.17%.雖然蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿條件下的提取率較好，但是強(qiáng)堿容易引起賴氨酸損失，產(chǎn)生不良副產(chǎn)物，使蛋白質(zhì)發(fā)生變性和水解.

2.6有機(jī)溶劑萃取法

文獻(xiàn)[18]用甲苯萃取分離了富硒樣品中的有機(jī)硒.方法如下：取富硒樣品0.3～0.5 g于燒杯中，加30 mL水?dāng)噭?，?%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6.0～7.5.將調(diào)好pH的樣品溶液倒入100 mL的分液漏斗中，并加入10 mL甲苯，萃取2 min，取有機(jī)相.同樣方法再萃取1次，將兩次有機(jī)相溶液合并于密閉消解罐中，沸水浴揮干甲苯.利用甲苯萃取兩次后，在有機(jī)相中加入15%半胱氨酸溶液l mL．搖勻后靜置，加入1～2滴亞甲藍(lán)溶液并開(kāi)始計(jì)時(shí)，有機(jī)硒作用下的亞甲藍(lán)的褪色時(shí)間為5～10 min，無(wú)機(jī)硒作用下的亞甲藍(lán)的褪色時(shí)間為30～60 s.根據(jù)褪色時(shí)間判斷有機(jī)相中是否含有無(wú)機(jī)硒.

2.7生物學(xué)方法

酶提取法在硒蛋白提取中應(yīng)用較廣，它是一種溫和的樣品處理技術(shù)，一般在37 ℃，pH7.0條件下進(jìn)行，其提取率高，對(duì)樣品的破壞性較小，但此法提取的速度較慢，一般需24～48 h.常用的酶有蛋白酶K，蛋白酶XIV，胰蛋白酶，胃蛋白酶和鏈霉蛋白酶等.通過(guò)多種方法比較提取富硒酵母中硒化合物的效率，結(jié)果表明用蛋白酶水解，硒的回收率最高可達(dá)85%，而用水和甲醇浸提得到的主要為SeMet和SeIV等8種硒化合物，回收率僅為10～20%，用崩潰酶分解可以釋放20%的SeMet，用SDS提取回收率為85%，主要形態(tài)是SeMet.文獻(xiàn)[19]用纖維素酶法提取富硒靈芝菌絲體多糖，將1.0 g富硒靈芝菌絲體加入50 mL水(浸提劑)中，加入0.5%的纖維素酶，酶解2 h，然后升溫至85 ℃滅酶，4 000 r/min離心15 min，測(cè)定提取液中多糖含量.纖維素酶法工藝簡(jiǎn)單且價(jià)格便宜，因此具有較高的應(yīng)用價(jià)值.

2.8柱分離技術(shù)

文獻(xiàn)[20]首先采用氯仿分離麻葉千里光有機(jī)態(tài)和無(wú)機(jī)態(tài);然后選擇正己烷、乙酸乙酯、甲醇等3種不同極性溶劑作洗脫劑，以硅膠柱進(jìn)行洗脫;其中有機(jī)態(tài)洗脫后，硒元素含量分別為：51 142、31 329、21 011 μg/g.

2.9輔助提取技術(shù)

為了更高效地提取生物樣品中的硒蛋白，通常采用加熱、攪拌、微波和超聲波等輔助提取技術(shù)中的一種或多種.微波輔助提取技術(shù)是讓待測(cè)樣品內(nèi)部受熱，通過(guò)加入的介質(zhì)對(duì)微波能的吸收，加速待測(cè)樣品分子與介質(zhì)分子之間的相互作用，從而顯著提高提取效率.它可以克服常規(guī)分解技術(shù)中耗時(shí)、低效、耗試劑及污染等缺點(diǎn).超聲輔助提取技術(shù)是在有固體試樣的溶液中，通過(guò)強(qiáng)而高頻率的超聲波使兩者充分混合發(fā)生物理或化學(xué)反應(yīng)，從而使固體試樣的預(yù)處理過(guò)程大大加速，顯著提高了提取效率.因此，超聲技術(shù)與常規(guī)的提取技術(shù)相比，是一個(gè)被優(yōu)先考慮的輔助提取技術(shù).

酶提取法雖提取效果不錯(cuò)，但耗時(shí)，可結(jié)合微波和超聲波方法來(lái)加速酶分解速度，克服其耗時(shí)的缺點(diǎn).文獻(xiàn)[21]將酶解法和微波輔助技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于提取富硒酵母標(biāo)準(zhǔn)樣品，這兩種方法結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)品硒蛋氨酸的回收率達(dá)100.1%，且提取時(shí)間由原來(lái)常規(guī)酶解的20 h縮短至30 min.超聲波提取技術(shù)在樣品前處理中可起到細(xì)胞破碎、團(tuán)聚物分解、乳化和勻質(zhì)等作用.目前在富硒芥菜、富硒大蒜、富硒馬鈴薯、富硒酵母和雞組織的硒形態(tài)研究中，超聲波探針輔助酶法提取技術(shù)己被廣泛應(yīng)用，其快速簡(jiǎn)便，提取時(shí)間縮短到30 s～180 s，仍能達(dá)到傳統(tǒng)48 h酶解相近的效果，同時(shí)可以防止長(zhǎng)時(shí)間提取導(dǎo)致的硒形態(tài)轉(zhuǎn)變.

3結(jié)束語(yǔ)

植物有機(jī)硒作為高效低毒優(yōu)質(zhì)硒源，在人和動(dòng)物的健康保健領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景.自然富硒植物資源少，有機(jī)硒資源出現(xiàn)世界性嚴(yán)重短缺，供求矛盾比較突出，尤其在我國(guó)表現(xiàn)更甚.雖然我們?cè)谟袡C(jī)硒資源的提取工藝方面已取得了很大的進(jìn)步，但天然有機(jī)硒的用途非常廣泛，在很多方面天然有機(jī)硒資源開(kāi)發(fā)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，不能滿足市場(chǎng)日益發(fā)展的需要.因此，研究植物的富硒特點(diǎn)、植物硒的存在形態(tài)及鑒定.尋找、開(kāi)發(fā)更加方便有效的天然有機(jī)硒提純工藝，將極大促進(jìn)富硒資源的開(kāi)發(fā)、利用和該研究領(lǐng)域的深入，以緩解有機(jī)硒資源的供求矛盾.

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Biography：LIANG Pan-xia,female,born in 1979, Ph.D., assistant researcher, plant physiology and biochemistry of soil environmental biotechnology.

收稿日期：2016-12-16

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(編號(hào)：2014GXNSFBA118139);廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目資助(編號(hào)：桂科合15104001-22);南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目資助(編號(hào)：20152054-13);廣西農(nóng)科院基本業(yè)務(wù)專項(xiàng)資助(編號(hào)：桂農(nóng)2014YD13);南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目資助(編號(hào)：2015312)

作者簡(jiǎn)介：梁潘霞(1979-)，女，壯族，博士，助理研究員，研究方向：土壤環(huán)境生態(tài)、植物生理生化與生物技術(shù).

文章編號(hào)：2095-7300(2016)02-038-05

中圖分類號(hào)：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Comparison of Extraction Technologies for Selenoproteins from Plant

LIANG Pan-xia，LIU Yong-xian*

(1.Resources and Environment Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007,China)

Abstract：Selenium(Se) is an essential trace element in many organisms，its biological function is mainly in the form of selenoproteins performance,plant selenoproteins can antioxidant,anti-cancer,enhance immunity.Review of the existing forms of selenium in plants,selenoproteins classification and extraction method selenoproteins and propose future research directions.21refs.

Keywords：Selenium; selenoproteins; extraction; plant

*通訊作者：liuyx27@163.com.