王娟娟，馮　芳,2

(1 中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇　南京　210009;2 藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點實驗室，江蘇　南京　210009)

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專論與綜述

中藥體內(nèi)代謝研究方法與技術(shù)*

王娟娟1，馮芳1,2

(1 中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇南京210009;2 藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點實驗室，江蘇南京210009)

傳統(tǒng)中藥在我國使用歷史悠久，但是其活性成分及作用機(jī)制仍然不明確。體內(nèi)代謝研究在探索藥物藥效基礎(chǔ)，了解藥物的代謝途徑，以及代謝物毒性評價方面發(fā)揮重要作用。但是中藥進(jìn)入體內(nèi)后含量低，成分更復(fù)雜，需要建立靈敏、專屬、準(zhǔn)確的檢測方法。本文通過查閱近年文獻(xiàn)，介紹了樣本處理、目標(biāo)物質(zhì)分離與檢測的方法與技術(shù)在中藥體內(nèi)代謝研究中的應(yīng)用。

中藥；體內(nèi)代謝；方法；技術(shù)

傳統(tǒng)中藥在我國的使用已逾數(shù)千年，是中國傳統(tǒng)文化的瑰寶。傳統(tǒng)中醫(yī)使用的經(jīng)典方劑多為幾味藥材通過中醫(yī)理論合理配比組合而成，這些復(fù)方中含有的化學(xué)成分少則幾十種，多則可達(dá)上千種。如此多的成分在進(jìn)入體內(nèi)后既有互相促進(jìn)也會有拮抗作用，其在體內(nèi)的藥效活性成分既可能是原型成分也可能是代謝產(chǎn)物。通常認(rèn)為，藥物必須吸收入血，分布到靶器官，而且在相應(yīng)的靶器官處在一定時間段內(nèi)維持一定的濃度水平才可能發(fā)揮藥效作用[1]。研究藥物體內(nèi)代謝可以了解藥物在體內(nèi)的存在形式，藥物代謝途徑以及藥物發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。探索藥物在體內(nèi)的代謝過程將為闡明藥物活性成分提供有用信息，為藥物的作用機(jī)制和安全性評價提供理論依據(jù)，為新的活性成分的發(fā)現(xiàn)提供重要來源。

1　中藥體內(nèi)代謝研究的難點

研究中藥在體內(nèi)的代謝過程具有重要意義，但也充滿挑戰(zhàn)。首先，傳統(tǒng)中藥化學(xué)成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，如經(jīng)典方劑大承氣湯中含四味藥材，其中來源于其君藥大黃的成分就多達(dá)75個[2]。對這些成分尤其是一些痕量成分進(jìn)入體內(nèi)的原型及代謝物的檢測是非常困難的。其次，研究藥物體內(nèi)代謝，其樣本常來自血漿，尿液，膽汁和糞便等，這些生物基質(zhì)含有多種內(nèi)源性成分，如血漿中含有多種蛋白質(zhì)，尿液中則含有尿酸，尿素，以及多種無機(jī)鹽等，待測物經(jīng)常被這些內(nèi)源性雜質(zhì)掩蓋。最后，不同于單一化學(xué)藥品，中藥中大部分成分缺少對照品，更不用說相應(yīng)的代謝物了，所以，試圖通過僅有的標(biāo)準(zhǔn)品對藥物在體內(nèi)的代謝物進(jìn)行識別是不可能實現(xiàn)的[3-4]。因此，在藥物體內(nèi)代謝研究中建立高效，靈敏，專屬的分析方法是至關(guān)重要的。

2　樣本處理

藥物及其代謝物進(jìn)入體內(nèi)后存在于復(fù)雜的生物基質(zhì)中，如何有效地將這些目標(biāo)化合物提取出來是影響體內(nèi)代謝研究的重要因素。體內(nèi)樣品的前處理技術(shù)迅速發(fā)展，出現(xiàn)了許多分離與濃集的新方法和新技術(shù)，如液相萃取，液相微萃取，固相萃取，自動化固相萃取，固相微萃取，超濾及微透析技術(shù)。其中液液萃取，固相萃取以及蛋白沉淀法仍是目前使用最多的樣本預(yù)處理方法，現(xiàn)將其分別敘述如下。液液萃取是利用待測物與干擾物質(zhì)在不同溶劑中的溶解度不同對其進(jìn)行提取，因此，液液萃取多用于極性跨度比較小的物質(zhì)的純化，即適合于對結(jié)構(gòu)相近的化合物的提取。姜悅[5]在對4種蒽醌成分在大鼠體內(nèi)組織分布的研究中，在組織勻漿液中加入重蒸乙酸乙酯提取蒽醌，結(jié)果提取回收率在91.3%～104.6%之間，滿足方法學(xué)驗證要求。該實驗中目標(biāo)物質(zhì)為蒽醌，其結(jié)構(gòu)接近且極性較小，所以采用乙酸乙酯可以獲得較高提取回收率。固相萃取是利用色譜理論，采用裝有不同填料的小柱進(jìn)行體內(nèi)藥品處理的方法。目前以C18柱最為常用，一般是將中等極性及弱極性化合物與極性干擾物質(zhì)分離[6]。為了擴(kuò)大固相萃取柱的適用范圍，使其對極性較弱的物質(zhì)和極性較強的物質(zhì)均有保留，親水親脂柱開始被應(yīng)用。這種柱子的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性的N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按照一定比例聚合成的大孔共聚物。但是相比于常規(guī)固相萃取柱，這種小柱價格較昂貴。蛋白沉淀法是利用有機(jī)溶劑如甲醇，乙腈等，將生物基質(zhì)中的蛋白質(zhì)沉淀析出，從而將待測物質(zhì)分離出來，蛋白沉淀法常用于血漿樣本的預(yù)處理。呂磊等[7]在200 μL給藥血漿中加入400 μL乙腈，將血漿中的蛋白質(zhì)沉淀，從而提取淫羊藿在大鼠血漿中的原型藥物與代謝物。最終鑒別出3個入學(xué)成分和4個代謝物。

3　樣本分離與檢測

3.1HPLC技術(shù)在中藥體內(nèi)代謝研究中的應(yīng)用

如前所述，中藥材中含有的成分紛繁復(fù)雜，結(jié)構(gòu)多樣。藥物進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)吸收代謝后，其含量降低，結(jié)構(gòu)變得更加復(fù)雜，除了原型藥物還包括相應(yīng)的代謝物，因此有效地分離這些物質(zhì)是決定其檢測成敗的重要因素。高效液相色譜(HPLC)是目前使用范圍最廣的分離技術(shù)，不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的固定相填料使得HPLC技術(shù)幾乎適合于分離所有化合物。根據(jù)不同的固定相填料，HPLC有不同的分離機(jī)制，但是目前在中藥體內(nèi)代謝研究中使用最多的還是C18為主的的反相色譜柱，以乙腈-水或甲醇-水系統(tǒng)作為流動相，通過待測物化學(xué)性質(zhì)在流動相中加入其它物質(zhì)使待測物更好的分離，如甲酸或者乙酸。邵明晶等[8]通過比較不同酸度對色譜峰分離及出峰順序的影響，發(fā)現(xiàn)大黃酸峰位受酸度影響較為明顯。在樣本干擾較小，分離度大于1.5，出峰時間相對較短的條件下，最終選擇0.1%乙酸-甲醇作為流動相用于蒽醌物質(zhì)的分離分析條件。超高效液相色譜技術(shù)(UPLC)采用粒徑小于2μM的填料作為固定相，這極大地提高了色譜分離技術(shù)的分離效率，縮短了分析時間，峰形更好，特別適合于分離含有多種成分的中藥及其在體內(nèi)的代謝物。楊杰等[9]采用UPLC技術(shù)分析小柴胡湯提取液化學(xué)成分及其在抑郁模型大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，在25 min內(nèi)在血清樣品中檢測到8個代謝物，尿液中檢測到19個代謝物。

3.2質(zhì)譜技術(shù)在中藥體內(nèi)代謝研究中的應(yīng)用

飛行時間質(zhì)譜檢測器(TOF/MS)和三重四極桿質(zhì)譜檢測器(QqQ/MS)是藥物體內(nèi)代謝最常用的質(zhì)譜檢測器。TOF/MS主要應(yīng)用于待測物的定性分析，通過從質(zhì)譜圖上獲得的準(zhǔn)分子離子以及碎片離子的精密質(zhì)量可以推測待測物的可能元素組成。TOF/MS的高靈敏度，高分辨率與高掃描速度特點使其特別適合與HPLC技術(shù)聯(lián)用對代謝物進(jìn)行鑒別。QqQ/MS包括四種掃描模式，即母離子掃描，產(chǎn)物離子掃描，中性丟失掃描以及多反應(yīng)監(jiān)測，其中，前面三種應(yīng)用于定性分析，最后一種適合于定量分析，如中藥進(jìn)入體內(nèi)后特征成分的血藥濃度測定[10]。三種定性分析技術(shù)中又以產(chǎn)物離子掃描和中性丟失掃描方式最為常用。QqQ/MS中，第一級與第三級四極桿發(fā)揮檢測作用，中間一級作碰撞室用。在產(chǎn)物離子掃描方式中，第一級四極桿中的離子只有符合設(shè)定的質(zhì)荷比才能進(jìn)入碰撞室，其碰撞產(chǎn)生的離子在第三級四極桿被檢測。通過實驗可以獲得選定的前體離子的特征碎片，從而對其進(jìn)行鑒別。在中性丟失掃描模式中，第一級四極桿中的所有離子都可以進(jìn)入碰撞室，在第三級四極桿檢測器中，只有能丟失特定碎片的母離子才可被記錄。中性丟失在代謝物研究中具有重要作用，因為代謝物在體內(nèi)的II相代謝產(chǎn)物包括葡萄糖醛酸、硫酸等綴合物，所以中性丟失在鑒別這類化合物時具有不可替代的優(yōu)勢。Xing等[11]在QqQ/MS的產(chǎn)物離子掃描方式和中性丟失掃描方式的基礎(chǔ)上，建立了結(jié)合多產(chǎn)物離子過濾技術(shù)和中性丟失過濾技術(shù)的分析方法。利用對照品獲得皂苷類化合物特征產(chǎn)物離子，及特征中性丟失質(zhì)量，從而成功對大鼠糞便中三七皂苷的原型藥物及代謝物進(jìn)行鑒別。

4　結(jié)　論

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高，專屬性強，準(zhǔn)確度高，分析速度快的特點，其在中藥體內(nèi)代謝研究中的廣泛應(yīng)用，為探索中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，研究中藥作用機(jī)制和安全性評價提供了重要信息，從而促進(jìn)中藥現(xiàn)代化與國際化。

[1]李萍,齊煉文,聞曉東,等.中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究的思路與方法[J].中國天然藥物,2007,5(1):1-9.

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[3]邱峰.淺談中藥成分體內(nèi)代謝研究[J].國際藥學(xué)研究雜志,2010,37(5):321-328.

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[9]楊杰,黃丹雪,鹿秀梅,等.小柴胡湯化學(xué)成分及其在抑郁模型大鼠體內(nèi)代謝成分的分析[J].中草藥,2012,43(9):1691-1698.

[10]張靜澤,王磊,金兆祥,等.中藥胃腸安丸給藥后木香烴內(nèi)酯及去氫木香內(nèi)酯藥代動力學(xué)研究[J].中國中藥雜志,2015,40(6):1173-1178.

[11]Rong X,Zhou L,Lin X,et al.Development of a systematic approach to rapid classification and identification of notoginsenosides and metabolites in rat feces based on liquid chromatography coupled triple time-of-flight mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2015,867:56-66.

Methods and Technologies for Metabolism Study of Traditional Chinese Medicine*

WANG Juan-juan1,FENG Fang1,2

(1 Department of Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical University,Jiangsu Nanjing 210009; 2 Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance (Ministry of Education),Jiangsu Nanjing 210009,China)

Traditional Chinese medicine (TCM) has been used in china for a long history.But the activity compounds and action mechanism are not clear.The metabolism research of TCM is important for exploring activity compounds,understanding metabolic pathways and evaluating drug safety.The constituents in vivo are complex and in low quantity,and a sensitive,special and accurate method is needed.The method of sample pretreatment as well as separation and detection technology applied in metabolism study of TCM was introduced by referring to literatures published recently.

TCM; metabolism; methods; technologies

國家自然科學(xué)基金資助項目 (No:81274063)。

王娟娟，碩士在讀。

馮芳，教授，從事現(xiàn)代藥物質(zhì)量研究及評價。

R917

A

1001-9677(2016)011-0001-02