喻 佳，陳銀芳，王金錢，王少軍(.江西省南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南昌0006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌0006；.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京00700)

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虎杖提取物對去卵巢小鼠下生殖道類雌激素樣作用研究

喻 佳1，陳銀芳2*，王金錢3，王少軍3(1.江西省南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南昌330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌330006；3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700)

摘要：目的研究虎杖提取物對去卵巢小鼠下生殖道的類雌激素樣作用。方法昆明種小鼠40只，體質(zhì)量22～26 g，清潔度II級，其中30只小鼠進(jìn)行動物造模后，將合格鼠隨機分為3組：虎杖提取物組(Em)、乙烯雌酚組(E2)和對照組即空白基質(zhì)組，另外10只小鼠不造模設(shè)為正常組。Em組和E2組，根據(jù)各鼠實際體質(zhì)量精密稱取虎杖提取物和乙烯雌酚，用眼科小鑷子或微量加樣器分別將藥物注入實驗鼠陰道深處，對照組同法給予相應(yīng)量的空白基質(zhì)栓，連續(xù)7 d，于給藥后5，6和7 d及最后1次給藥后24~48 h各作l～2次陰道涂片檢查，觀測小鼠陰道角化細(xì)胞陽性率、乳酸桿菌菌群變化、pH值變化及陰道黏膜組織病理學(xué)分級，以此4個指標(biāo)來研究虎杖提取物對去卵巢小鼠下生殖道類雌激素樣作用。結(jié)果虎杖提取物對去卵巢小鼠下生殖道有一定的類雌激素樣作用，與對照藥一樣能顯著提高陰道角化細(xì)胞陽性率，顯著增加陰道乳酸桿菌菌群數(shù)，恢復(fù)陰道酸性環(huán)境，改善陰道局部炎癥的病理變化。結(jié)論虎杖提取物具有類雌激素樣活性，有進(jìn)一步研發(fā)的價值。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；老年性陰道炎；虎杖植物雌激素

老年性陰道炎是絕經(jīng)后婦女的高發(fā)性疾病，其發(fā)病率國內(nèi)報道為30%~58.6%，國外報道高達(dá)98.5%[1]。其主要癥狀表現(xiàn)為陰道干澀、刺激感、陰道分泌物稀薄、呈淡黃色，嚴(yán)重者有血樣白帶、外陰瘙癢、陰道燒灼感；性交后出血、下墜感或伴有尿頻、尿急等泌尿道感染癥狀，嚴(yán)重影響老年患者的身心健康。本病由卵巢功能衰退、體內(nèi)雌激素水平下降所致，中醫(yī)總的病機為腎氣虛弱，濕濁內(nèi)乘。近年來，臨床研究資料顯示，雌激素替代療法在治療圍絕經(jīng)期綜合征疾病中不良反應(yīng)明顯，費用昂貴，且長期使用可增加子宮癌及乳腺癌的發(fā)病率。而植物雌激素作為一種天然化合物，不良反應(yīng)小，對生殖、骨骼、心血管等系統(tǒng)具有廣泛作用，備受人們關(guān)注。

天然白藜蘆醇作為植物雌激素，主要以虎杖苷的形式存在于虎杖的根和根莖中。本實驗以虎杖根粗提物對去卵巢小鼠下生殖道進(jìn)行類雌激素樣作用研究，旨在為虎杖在臨床上用于治療及預(yù)防老年性陰道炎及雌激素缺乏的相關(guān)疾病提供實驗依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇城西曉陽電子儀器廠；DFY-500克搖擺式高速中藥粉碎機，溫嶺市大德中藥機械有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R-201)、生物顯微鏡，上海生申科技有限公司；低溫冰箱，海爾電器；叮-II菌物培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司；ZT-12P生物組織自動脫水機、YB-6D生物組織石蠟包埋機，湖北孝感市亞光醫(yī)用電子公司。

1.2試藥虎杖，湖北毫州市永剛飲片廠；空白基質(zhì)

栓，江西中醫(yī)學(xué)院藥理實驗室；乙烯雌酚，合肥久聯(lián)制藥有限公司；蘇木精、蛋白胨、肉膏，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站試劑廠；伊紅、pH試紙，上海試劑三廠。

1.3動物健康、性成熟的清潔級雌性未孕小鼠40只，購自江西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(JXZY(贛)2008-9)，質(zhì)量22～26 g，喂養(yǎng)在江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥研究國家重點實驗室(實驗動物使用許可證號：JXXK(贛)2008-0024)。

2實驗方法

2.1實驗藥物的提取和配制

2.1.1 虎杖提取物制備 取虎杖原料200 g,粉碎成粗粉，過40目篩，精確稱取10 g粉末， 置于圓底燒瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇120 mL，置于水浴鍋上回流抽提2 h，水浴鍋溫度70 ℃，將提取物抽濾，得濾液Ⅰ待用；再重復(fù)提取1次，得濾液Ⅱ，合并2次濾液即為提取物。水浴低溫回收乙醇，將提取物置于56 ℃水浴鍋上蒸發(fā)至無醇味，減壓濃縮后得褐色浸膏，為虎杖提取物，待用。

2.1.2 乙烯雌酚制劑的配制 取2 mg藥片，充分研細(xì)，用20 mL 2 g·L-1的吐溫-80溶解，備用。

2.2 動物模型建立

2.2.1 動物模型 乙醚棉球吸入麻醉后，將小鼠腹位固定。在小鼠最末肋骨下、腋中線和距脊柱外側(cè)約2 cm交叉處剪除長毛，切開皮膚和背肌，有乳白色發(fā)亮的脂肪團，其中包埋著卵巢。用小鑷子輕夾脂肪團，拉出切口外，分離脂肪，即見粉紅色、黃紅色的卵巢。取一絲線將卵巢下輸卵管及脂肪一并結(jié)扎。剪下卵巢，將子宮角送回腹腔，然后摘取對側(cè)卵巢，縫合皮膚。在去卵巢后的第5~8日逐只進(jìn)行陰道涂片，每日1次，連續(xù)5~10 d，選取連續(xù)5 d呈現(xiàn)間情期(鏡下見大量多核白細(xì)胞，少量上皮細(xì)胞，無角化細(xì)胞)的小鼠為合格鼠[2]。

2.2.2 分組及給藥方法 將合格鼠隨機分為3組，虎杖提取物組(Em)、乙烯雌酚組(E2)和對照組，每組各10只小鼠，另設(shè)一組未做處理的成年小鼠，稱為正常組。虎杖提取物(60 mg·kg-1)、乙烯雌酚(0.06 mg·kg-1)和空白基質(zhì)栓，Em組和對照組用眼科小鑷子、E2組用微量加樣器分別將藥物送入實驗鼠陰道深處，每組每只鼠每天給藥1次，連續(xù)7 d，于給藥后5，6和7 d及最后1次給藥后24與48 h各做l~2次陰道涂片檢查.

2.3 各項觀察指標(biāo)的方法學(xué)

2.3.1 陰道涂片檢查方法 用左手背位固定小鼠，右手持吸管，其內(nèi)預(yù)先吸有生理鹽水0.1~0.2 mL，輕輕插入小鼠陰道2~3 mm，抽吸2~3次，滴1滴吸液置于載玻片上，HE染色，樹膠封片，再置于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。 評判標(biāo)準(zhǔn)：角化細(xì)胞占脫落細(xì)胞比例>50%為陽性反應(yīng)。

2.3.2 陰道分泌物乳酸桿菌培養(yǎng)法[3]用微量加樣器取100 μL生理鹽水，反復(fù)沖洗小鼠陰道8次，取60 μL的陰道沖洗液10倍系列稀釋至10-6，用微量加樣器接種于MRS選擇性培養(yǎng)基上，經(jīng)37 ℃、48 h培養(yǎng)后進(jìn)行活菌計數(shù)(cfu·mL-1)。

2.3.3 陰道pH值測定 精密pH試紙，保存干燥，檢查時右手戴一次性塑料手套，取pH試紙直接貼附于陰道側(cè)后壁，貼壁5 s，待變色后在自然光下讀取pH值。pH值評判標(biāo)準(zhǔn)：在無陰道感染的條件下，陰道pH值為3.5~4.5；細(xì)菌性陰道病時，陰道pH值>4.5；陰道pH值為5.0~6.0時，提示患者處于陰道感染或血清雌激素水平降低；陰道pH值為6.0~7.5時，提示陰道處于絕經(jīng)期。

2.3.4 陰道黏膜組織病理學(xué)分級 標(biāo)本獲?。翰捎妙i椎脫臼法處死小鼠，剖取陰道標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。按照小鼠陰道黏膜組織病理學(xué)分級，分為0~Ⅲ級，0級為黏膜上皮光滑，無壞死脫落，黏膜下無充血、水腫、出血、炎細(xì)胞浸潤，陰道內(nèi)無炎性滲出物；Ⅰ級為黏膜上皮無壞死脫落，黏膜下充血、水腫，陰道內(nèi)無炎性滲出物;Ⅱ級為黏膜上皮有灶性壞死脫落，黏膜下充血、水腫、點狀出血、少量炎細(xì)胞浸潤，陰道內(nèi)有少量炎性滲出物；Ⅲ級為黏膜上皮壞死脫落，黏膜下充血、水腫、片狀出血、炎細(xì)胞浸潤，陰道內(nèi)有大量炎性滲出物。0~Ⅰ 級屬正常陰道黏膜病理檢查結(jié)果；Ⅱ~Ⅲ級為異常陰道黏膜病理改變，提示陰道炎癥[4]。

3 實驗結(jié)果

所測得各組資料及統(tǒng)計結(jié)果見表1～5。

表13組小鼠陰道黏膜角化細(xì)胞陽性反應(yīng)率比較

Tab.1 Comparison of positive reaction rate of three groups mice vaginal mucosa keratinocytes

藥物劑量/mg·kg-1動物數(shù)/只陽性動物數(shù)/只陽性反應(yīng)率/%E20．061010100Em60．00109090＊＊對照組—1000正常組1010100

注： Em與E2組比較P=0.86，P>0.05；**Em與對照組比較P=0.008，P<0.01；Em與正常組比較P=0.86，P>0.05。

表2 角化細(xì)胞占陰道脫落細(xì)胞的比例

Tab.2 Keratinocytes specific scale of vaginal exfoliated cells

組別動物數(shù)/只角化細(xì)胞占脫落細(xì)胞比例/%E21072．51±2．74Em1069．00±6．86＊＊對照組100．00±0．00正常組1070．25±2．98

注： Em與E2組比較P>0.05；Em與對照組比較**P<0.01；Em與正常組比較P>0.05。

表3 陰道分泌物乳酸桿菌檢測比較

Tab.3 Comparison of vaginalLactobacillustest

組別動物數(shù)/只乳酸桿菌活菌數(shù)/105cfu·mL-1E2104．90±1．19Em104．50±1．35＊＊對照組100．90±0．56正常組104．60±1．28

注： Em與E2組比較P>0.05；Em與對照組比較**P<0.01；Em與正常組比較P>0.05。

表4用藥前、后陰道pH值變化

Tab.4 Vaginal pH change before and after the medication

組別動物數(shù)用藥前動物數(shù)/只用藥后動物數(shù)/只/只6．0～7．53．0～4．55．0～6．06．5～7．5E210101000Em1010910*對照組1010028正常組1010910

注： 陰道正常pH值<4.5。用藥前,4組pH值都在6.0~7.5之間，P>0．05；用藥后，Em與E2組比較P>0.05；Em與對照組比較**P<0.05；Em與正常組比較P>0.05。

表5去卵巢小鼠陰道黏膜病理分級

Tab.5Pathological classification of ovarian mouse vaginal mucosa

組別動物數(shù)/只病理分級后動物數(shù)/只0級Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級E2108200Em106310*對照組100064正常組1073

注： Em與E2組比較P>0.05； Em與對照組比較**P<0.05；Em與正常組比較P>0.05。

4 結(jié)論

陰道角化細(xì)胞>50%為陽性反應(yīng)：Em組有9只小鼠達(dá)標(biāo)(90%)，E2組及Em組的10只小鼠全部達(dá)標(biāo)(100%)，對照組無小鼠達(dá)標(biāo)(0)，Em組明顯高于對照組，二者比較有極顯著性差異(*P<0.01)，Em組與E2組比較無顯著性差異(P>0.05)，見表1；角化細(xì)胞占陰道脫落細(xì)胞比值比較，Em組與E2組比較，無顯著性差異(P>0.05)，Em與對照組比較，有極顯著性差異(*P<0.01)，見表2。

陰道分泌物乳酸桿菌計數(shù)比較：Em組乳桿菌數(shù)明顯多于對照組，有極顯著性差異(*P<0.01)；Em組與E2組比較，無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

造模后小鼠陰道pH值檢測：3組都在6.0~7.5之間，無顯著性差異；用藥后3組小鼠比較：pH值為3.0~4.5，Em組與E2組、正常組比較，無顯著性差異(P>0.05)，Em組與對照組比較，有顯著性差異(*P<0．05)，見表4。

用藥后小鼠陰道黏膜病理分級：Em與E2組、正常組比較無顯著性差異(P>0．05)，Em與對照組比較，有顯著性差異(*P<0.05)，見表5。

不良反應(yīng)：3組用藥過程中均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。

5 討論

虎杖中的二苯乙烯類化合物白黎蘆醇被證實是其主要雌激素活性成分。它能與17β-雌二醇競爭，結(jié)合于雌激素受體，并激活雌激素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。Bertelli等研究表明，每天4杯葡萄酒能有效增加絕經(jīng)女性的骨密度，該作用與白藜蘆醇能激活堿性磷酸酶(骨礦化的關(guān)鍵酶)有關(guān)，還可能與具有雌激素樣作用的白藜蘆醇抑制骨吸收有關(guān)。白黎蘆醇的分子結(jié)構(gòu)類似于雌激素受體-α的拮抗劑——二乙基己烯雌酚，其作用方式和作用強度與己烯雌酚或雌二醇等傳統(tǒng)雌激素相同。除此之外，白藜蘆醇還具有雌激素調(diào)節(jié)作用，在缺乏E2的條件下，其對乳癌細(xì)胞起雌激素與拮抗劑的雙重作用。

另外，虎杖中的蒽醌類化合物、大黃素和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等成分都被證實也具有雌激素活性。宋靜榮[5]的研究表明，虎杖提取物能顯著增加去卵巢大鼠陰道和子宮質(zhì)量、改善子宮萎縮狀況、增加去卵巢大鼠血清雌二醇含量和降低促黃體生成素含量。這對于調(diào)節(jié)絕經(jīng)后的內(nèi)分泌以及改善與促黃體生成素有關(guān)的絕經(jīng)期潮熱癥狀具有重要的意義。Matsuda等[6]研究發(fā)現(xiàn)， 中藥虎杖提取物中的大黃素和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷顯示了雌激素活性，可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞的增殖。

中國地大物博，中草藥種類繁多，虎杖雖被證實是含白藜蘆醇成分最高的中藥，但從目前可以參考的文獻(xiàn)來看，國內(nèi)還沒有對虎杖進(jìn)行陰道雌激素活性的動物實驗研究，故本課題用虎杖提取物對去卵巢小鼠下生殖道類雌激素樣作用做實驗研究，局部給藥,以陰道角化細(xì)胞陽性率、陰道乳酸桿菌數(shù)、陰道pH值和陰道病理組織分級作為觀察指標(biāo)，結(jié)果顯示， 虎杖提取物具有很強的雌激素活性，本實驗為中藥虎杖在預(yù)防和治療老年性陰道炎或雌激素相關(guān)疾病方面提供實驗依據(jù)，為這種價格低廉、取材廣泛的植物能夠得到更好的開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)。

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Study on the estrogen-like effect ofPolygonicuspidatisextracts on the lower genital tract of ovariectomized mice

YU Jia1,CHEN Yinfang2*,WANG Jinqian3,WANG Shaojun3(1. Integrative Medicine Hospital of Nanchang Jiangxi, Nanchang 330006, China;2. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006, China;3. Institute of Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing100700, China)

Abstract:ObjectiveTo study on the hornlogous estrogen effect of Polygoni cuspidatis extracts on the lower genital tract of ovariectomized mice. Method40 Kunming mice (Cleanness class II) weighting 22-26 g were used, in which 30 Kunming mice were ovariectomized and randomly divided into the following 3 groups: the control group, Polygoni cuspidatis extracts treatment group (Em), and diaethylstilbestroli treatment group (E2) .The rest 10 Kunming mice were not ovariectomized and used as normal group. Each group was treated with the vaginal suppository carrying Polygoni cuspidatis extracts (60 mg·kg-1·d-1), or diaethyls stilbestroli (0.06 mg·kg-1·d-1) .Within 7 days, vaginal smear examination was performed for 1-2 times on the 5th, 6th, 7th day after the treatment as well as 24-48 hours after the final medicine administration. The observing index was as follows: the positive rate of the vaginal diversification cells, the variation of lactobacillusflora, the variation of pH value and the pathological grade of vaginal mucosa.ResultsThe Polygoni cuspidatis extracts simulated the estrogen effects on the lower genital tract of ovariectomized mice with a significant improvement of the positive rate of vaginal diversification cells. Polygoni cuspidatis extracts significantly increased the number of lactobacillusfloras, recovered the acidic environment of vagina, and improved the pathological changes of local inflammation in the vagina. Conclusion This is the first report about the estrogen functions of Polygoni cuspidatis extracts on the lower genital tract in ovariectomized mice, providing the potential value for further research and development in menopause-related diseases.

Key words:resveratrol; Polygoni cuspidatis for senile vaginitis; phyto-oestrogens

(收稿日期：2015-06-24)

*通信作者：陳銀芳，女，講師

作者簡介：喻佳,女，主治醫(yī)師

中圖分類號：R965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0164-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.016