譚從娥，黃祥云陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046

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基于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析右歸丸治療腎陽虛證的療效機制

譚從娥，黃祥云
陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046

摘要：目的建立右歸丸治療腎陽虛證療效相關(guān)的差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，探索右歸丸治療腎陽虛證的療效機制。方法對前期實驗取得的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)作進一步數(shù)據(jù)挖掘。首先篩選腎陽虛證患者經(jīng)右歸丸治療前后比較的差異表達蛋白，再采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，定位網(wǎng)絡中關(guān)鍵蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，并以AmiGO數(shù)據(jù)庫對聯(lián)系緊密的蛋白質(zhì)作Gene Ontology（GO）條目富集。結(jié)果篩選到7個差異表達蛋白質(zhì)（P＜0.05）。這7個蛋白質(zhì)與另外10個預測蛋白質(zhì)構(gòu)成的差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡包含17個節(jié)點（蛋白質(zhì)）、57條邊（相互作用關(guān)系），其中22個蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的綜合置信值＞0.7，其中C3、C5和CFH均為補體系統(tǒng)重要成分，其功能主要與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。結(jié)論右歸丸對腎陽虛證的調(diào)控作用包括補體激活、創(chuàng)傷愈合、體液水平調(diào)節(jié)等多個方面，其中對補體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用可能為右歸丸促進腎陽虛證免疫平衡的重要機制之一。

關(guān)鍵詞：腎陽虛證；右歸丸；蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

腎陽虛證臨床主要表現(xiàn)為腰膝酸軟、畏寒肢冷、夜尿頻多等，治法以溫補腎陽為主，臨床以右歸丸為代表方劑。右歸丸出自明代《景岳全書》，由熟地黃、炮附片、肉桂、山藥、山萸肉、菟絲子、鹿角膠、枸杞子、當歸、杜仲組成，主要功效為溫補腎陽、填精益髓，主治腎陽虛證。我們前期采用核素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)，對經(jīng)右歸丸治療的4例腎陽虛證患者者治療前后的蛋白質(zhì)組進行鑒定，獲得了一批差異表達達蛋白[1]。蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)不是孤立的，而是以蛋白白質(zhì)之間的相互作用為基礎(chǔ)。右歸丸對腎陽虛證療效的的發(fā)揮也是蛋白質(zhì)在一定時空下相互作用的結(jié)果。因因此，必須在整體、動態(tài)、網(wǎng)絡的水平上對蛋白質(zhì)進行行研究，才能對右歸丸療效的綜合性和復雜性有全面面和深入的認識。本研究采用生物信息學網(wǎng)絡建模方方法，對前期實驗數(shù)據(jù)進行挖掘，從蛋白質(zhì)相互作用關(guān)關(guān)系角度探索右歸丸治療腎陽虛證的分子機制。

1　資料與方方法

1.1數(shù)據(jù)來來源

數(shù)據(jù)來來源于前期實驗采用8通道iTRAQ蛋白質(zhì)組學技術(shù)檢檢測得到的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)[1]，對其中標記實驗中8個通通道均有定量信息的171個蛋白質(zhì)作進一步數(shù)據(jù)分析。

1.2差異表表達蛋白質(zhì)篩選

分別計計算各鑒定蛋白質(zhì)在治療前后表達量的平均值，采用用配對t檢驗比較治療前后差異，P＜0.05認為該蛋白白質(zhì)的表達差異有統(tǒng)計學意義。

1.3蛋白質(zhì)質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建

采用STRING（http://string-db.oorg）數(shù)據(jù)庫[2]構(gòu)建差異蛋白質(zhì)質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。STRINGG是用于搜尋已知蛋蛋白質(zhì)和預測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)，其采用的預預測方法有染色色體臨近、基因融合、系統(tǒng)進化譜和基于于芯片數(shù)據(jù)的基基因共表達等，系統(tǒng)利用打分機制對這些些方法得出的結(jié)結(jié)果給予一定權(quán)重，最終給出綜合得分。綜綜合得分越高高，則蛋白質(zhì)間相互關(guān)系越緊密。采用A miGO（http:///amigo.geneontology.org/rte）[3]對網(wǎng)絡中各蛋白質(zhì)模塊進進行Gene Ontology（GO）功能富集分析。

2　結(jié)果

2.1差異蛋白白質(zhì)篩選結(jié)果果

與治療前比較，有7個個蛋白質(zhì)的表達在治療后出現(xiàn)現(xiàn)明顯差異（PP＜0.05），其其中4個蛋白表達上調(diào)、3個個蛋白表達下調(diào)，見表1。

2.2蛋白質(zhì)相相互作用網(wǎng)絡絡

7個差異表表達蛋白質(zhì)和和另外10個個預測蛋白質(zhì)構(gòu)成成了差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)網(wǎng)絡（見圖11）。該網(wǎng)絡包含177個節(jié)點（蛋蛋白質(zhì)）、57條邊（相互互作用關(guān)系），其中有22個邊的的綜合置信值（confidencce value）＞0.7。

2.3相互作用用蛋白質(zhì)及其功能

將每個差異蛋白質(zhì)及其預測蛋白質(zhì)輸入AmiGO數(shù)數(shù)據(jù)庫，分別別從分子功能、細胞組分、生物學過程3個個方面對每個個差異蛋白質(zhì)及其預測蛋白質(zhì)作功能顯著著性分析，以P≤0.001為標準，獲得各差異蛋白質(zhì)及及其預測蛋白質(zhì)顯著性GOO類別，見表2。

表1　腎陽虛證患患右歸丸治療前后后血清差異表達蛋白質(zhì)

圖1　腎陽虛虛證差異表達蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

表2　與差異表達蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)及其功能富集（預測值＞0.7）

3　討論

右歸丸為治療腎陽虛證的經(jīng)典方劑，其臨床療效已被證實，但其療效機制還僅得到部分闡釋[4]。我們前期在右歸丸治療前后對照的4例腎陽虛證患者中成功鑒定出了236個血清蛋白，并對篩選的差異表達蛋白進行了初步的功能分析。然而，前期實驗只是對單個差異蛋白質(zhì)的功能進行了分析，而對蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系未作研究。在生物學過程中，蛋白質(zhì)之間的相互作用是介導生物體整體變化的基礎(chǔ)，其生物學意義顯然遠高于單個蛋白質(zhì)的變化[5]。從蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)出發(fā)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，并從中預測出與功能密切相關(guān)的模塊，已成為研究復雜科學的一種手段。為了進一步研究右歸丸對腎陽虛證干預效應的網(wǎng)絡化調(diào)節(jié)機制，本研究對前期實驗數(shù)據(jù)作進一步的數(shù)據(jù)挖掘，重點分析差異蛋白質(zhì)的功能網(wǎng)絡關(guān)系。要獲取蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，需借助生物信息學網(wǎng)絡建模方法。目前，可實現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的數(shù)據(jù)庫有Osprey[6]、InterViewer[7]、Pajek[8]、STRING[2]等。STRING數(shù)據(jù)庫是一個搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)。這種作用既包括蛋白質(zhì)之間直接的物理的相互作用，也包括蛋白質(zhì)之間間接的功能相關(guān)性，具有操作簡單、可視化效果明顯的特點。

借助STRING網(wǎng)絡建模數(shù)據(jù)庫，我們構(gòu)建了7個差異表達蛋白相互作用網(wǎng)絡。在該網(wǎng)絡中，7個差異表達蛋白和10個預測蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，共形成22對蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，說明右歸丸療效相關(guān)蛋白質(zhì)的作用并不是孤立的，而是相互聯(lián)系，彼此作用，共同發(fā)揮特定生物學功能。每個差異表達蛋白質(zhì)和其預測蛋白質(zhì)功能相似，構(gòu)成一個蛋白質(zhì)相互作用功能模塊，每個模塊都主導著其相應的生物學過程，主要涉及補體激活、創(chuàng)傷愈合、體液水平調(diào)節(jié)、血液凝固等。其中C3、C5和CFH均為補體系統(tǒng)重要成分。C3是補體系統(tǒng)的中心成分，處在補體激活的3條途徑樞紐位置，它既參與天然防御，同時還可觸發(fā)適應性免疫調(diào)節(jié)[9]。C5也是補體系統(tǒng)的一種重要組分，其裂解成分C5a對免疫應答有明顯增強作用，可誘導單核細胞分泌白細胞介素（IL）-l、IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子[10]等細胞因子，促進抗原及同種異體抗原誘導的T細胞增殖及B細胞產(chǎn)生抗體等。本研究結(jié)果顯示，腎陽虛證患者C3和C5經(jīng)右歸丸治療后均出現(xiàn)差異表達，而且與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中多個蛋白發(fā)生相互作用，并參與了多個功能的執(zhí)行，說明右歸丸對腎陽虛證的調(diào)控作用是多層次的，這和中醫(yī)理論強調(diào)的整體調(diào)節(jié)理念是一致的。本研究通過對網(wǎng)絡中重點蛋白質(zhì)節(jié)點的功能挖掘，得到了一些右歸丸療效相關(guān)的核心調(diào)控蛋白，如免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的蛋白如C3、C5、CFH等，提示在右歸丸治療腎陽虛證的眾多療效機制中，補體系統(tǒng)成分可能為其促進免疫平衡的分子基礎(chǔ)之一。

總之，本研究應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選右歸丸治療腎陽虛證的差異表達蛋白，從蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系角度，構(gòu)建差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，并分析網(wǎng)絡中蛋白模塊的功能，從宏觀角度分析右歸丸對腎陽虛證的分子調(diào)控路徑，為右歸丸治療腎陽虛證的臨床療效提供了依據(jù)。

參考文獻：

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（修回日期：2015-05-27；編輯：陳靜）

Analysis of Therapeutical Mechanism of Yougui Pills for Kidney-yang Deficiency SyndromeBased on Protein-protein Interaction Network

TAN Cong-e, HUANG Xiang-yun (Shaanxi University of TCM, Xianyang 712046, China)

Abstract:Objective To develop a protein-protein interaction network related to therapeutic effects of Yougui Pills on kidney-yang deficiency syndrome; To explore the therapeutical mechanism of Yougui Pills for treating kidney-yang deficiency syndrome. Methods The proteome data obtained from previous experiments were applied again to do further data mining: first, differentially expressed serum proteins between kidney-yang deficiency patients in pre-treatment and post-treatment of Yougui Pills were screened; second, a protein-protein interaction network of differentially expressed proteins with STRING database was constructed. The key proteins in the network were positioned and their functions were enriched in gene ontology (GO) terms with AmiGO database. Results Seven serum proteins were found expressed differentially. These differentially expressed proteins were interacted with 10 predicted proteins. The constructed protein-protein interaction network consisted of 17 nodes (proteins) and 57 edges (interactions). 22 edges reached high confidence of 0.7. The key network proteins of C3, C5 and CFH were important components of complement system, and their main functions were both involved in immune regulation. Conclusion Yougui Pills can regulate kidney-yang deficiency in many ways, including complement activation, wound healing, regulation of body fluid levels, etc. In these actions, the regulation on complement system may be one of the important mechanisms of Yougui Pills on kidney-yang deficiency syndrome.

Key words:kidney-yang deficiency; Yougui Pills; protein-protein interaction network

收稿日期：（2015-04-20）

基金項目：國家自然科學基金（81072731、81473559）；陜西省教育廳自然科學專項（2013JK0821）

中圖分類號：R228；R2-05

文獻標識碼：A

文章編號：1005-5304(2016)02-0030-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.009