王月珍，汪巖，馬千里，劉志紅，牛艷秋（長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林長(zhǎng)春130031）

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響應(yīng)面法優(yōu)化酶解提取花生根莖中白藜蘆醇

王月珍，汪巖，馬千里，劉志紅，牛艷秋
（長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林長(zhǎng)春130031）

摘要：對(duì)酶解法提取花生根莖中的白藜蘆醇工藝進(jìn)行研究，確定最佳酶解提取工藝。以纖維素酶用量、酶解時(shí)間、料液比為自變量，以白藜蘆醇提取率為因變量，通過(guò)對(duì)自變量的不同水平進(jìn)行多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化白藜蘆醇提取工藝，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明：酶解法提取花生中白藜蘆醇的最佳工藝為：纖維素酶用量50mg/g，酶解時(shí)間20h，料液比1∶12（g/mL）。

關(guān)鍵詞：花生；纖維素酶酶解；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；白藜蘆醇

花生又稱(chēng)落花生、番果和長(zhǎng)壽果，為一年生草本植物，來(lái)源于豆科[1]。在我國(guó)，花生年產(chǎn)量約12 000 kt[2]高居世界第二。花生多以其種子食用，其根、莖、葉多被廢棄在田間地頭，或者被作為牲畜的草料和生活柴草，從而造成資源的極大浪費(fèi)。現(xiàn)代藥學(xué)研究表明：白藜蘆醇在花生根中含量最高，花生莖中次之，其后依次為花生紅衣和花生仁[3]，可見(jiàn)花生根、莖是提取白藜蘆醇的天然植物資源。

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）又稱(chēng)芪三酚，是一種含有芪類(lèi)結(jié)構(gòu)的非黃酮類(lèi)多酚類(lèi)化合物，于1939年首次從毛葉藜蘆植物中提取得到，1976年Ingham首次從花生中分離得到該物質(zhì)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)該成分具有抗癌、抗病毒、抗氧化、抗誘變、保肝、抑菌及降血脂等功效[4]，所以在食品、藥品、保健品中的應(yīng)用廣泛，隨著市場(chǎng)需求的不斷加大，建立一套行之有效的白藜蘆醇提取工藝開(kāi)始被人們所關(guān)注。目前，白藜蘆醇的提取方法有多種[5]，王鳳舞等用纖維素酶酶解法提取花生紅衣中白藜蘆醇[6]，其中因其高效性而成為該提取工藝的研究重點(diǎn)，雖比傳統(tǒng)工藝優(yōu)越很多，但因纖維素酶的不穩(wěn)定性及周?chē)h(huán)境的復(fù)雜性，在進(jìn)行酶解提取后，白藜蘆醇提取率卻是千差萬(wàn)別，重復(fù)性較差。并且酶解法提取花生根、莖中白藜蘆醇鮮見(jiàn)報(bào)道，故本研究采用酶解法進(jìn)行白藜蘆醇的提取工藝研究，以花生根、莖為原料，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化白藜蘆醇的提取工藝，從而建立花生根、莖的白藜蘆醇最佳提取工藝，為白藜蘆醇的規(guī)?；崛〖巴貙挵邹继J醇提取的植物來(lái)源提供科學(xué)的參考。

1　材料

Agilent 1100高效液相色譜儀、DAD檢測(cè)器、Agilent色譜工作站：美國(guó)安捷倫；KQ2200E型超聲清洗機(jī)：中國(guó)昆山儀器有限公司；ALC211014電子天平：國(guó)華電器有限公司；電熱真空干燥箱：上海精宏；WK-4008高速中藥粉碎機(jī)：青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司。

白藜蘆醇對(duì)照品：由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（批號(hào)111535-200502）；花生（四粒紅）根、莖：采自吉林省樺甸市靖宇縣，經(jīng)鑒定為豆科植物落花生屬花生的干燥根和莖；纖維素酶（1 000 U/g）：上海紫一試劑廠；提取用乙醇為分析純，水為蒸餾水；HPLC含量測(cè)定用乙腈為色譜純，水為超純水；處理供試品和對(duì)照品用試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1白藜蘆醇的含量測(cè)定

2.1.1色譜條件

色譜柱：大連伊利特分析儀器有限公司產(chǎn)4.6 mm× 250 mm，5 μm C18柱；流動(dòng)相：乙腈-水（40：60，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：303 nm。2.1.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取干燥至恒重的白藜蘆醇對(duì)照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加適量乙腈定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3供試品溶液制備

稱(chēng)取花生根、莖提取物10 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL容量瓶中加乙腈定容至刻度，超聲5 min，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取白藜蘆醇對(duì)照品溶液分別稀釋成100、200、300、400、500 μg/mL的溶液，依次進(jìn)樣，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定。以濃度（Y）為縱坐標(biāo)，峰面積（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得回歸方程：Y= 35.148 X-0.73，r=0.999 7。表明白藜蘆醇在100 μg/mL～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度試驗(yàn)

按照“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件試驗(yàn)，取同一濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算精密度。RSD為2.6 %，表明精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液，分別在0.5、1、4、8、12 h測(cè)含量，結(jié)果樣品在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為2.9 %。

2.1.7重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批花生根、莖提取物的粉末5份，每份0.1 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備和“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，RSD為3.2 %。

2.1.8加樣回收率

精密稱(chēng)取己知白藜蘆醇含量的花生提取物粉末5份，每份0.05 g精密加入白藜蘆醇儲(chǔ)備液0.1 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備和“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。白藜蘆醇的平均回收率為99.8 %，RSD為3.2 %。

2.1.9含量測(cè)定

按照2.1.3所述方法將試驗(yàn)中各樣品制成供試品，分別取過(guò)0.45 μm微孔濾膜的各供試液續(xù)濾液10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定各組白藜蘆醇的含量，計(jì)算白藜蘆醇提取率。

2.2白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化

2.2.1單因素試驗(yàn)

根據(jù)報(bào)道[7]可知白藜蘆醇對(duì)光熱敏感易分解，會(huì)影響其提取率，故在試驗(yàn)時(shí)注意保持在室溫下避光酶解，選取纖維素酶添加量（10、30、50 mg/g）、酶解時(shí)間（6、18、30 h）、料液比[1∶4、1∶8、1∶12（g/mL）]作為考察因素，觀察其對(duì)花生根莖中白藜蘆醇提取率的影響，結(jié)果白藜蘆醇提取率分別為0.82 %、0.97 %、0.89 %、0.94 %、1.03 %、0.98 %、0.87 %、0.99 %、1.07 %。說(shuō)明3個(gè)因素均為影響白藜蘆醇提取率的主要因素。

2.2.2星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

根據(jù)2.2.1的試驗(yàn)結(jié)果，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法建立試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以主要影響因素為自變量，白藜蘆醇提取率為因變量，每個(gè)因素設(shè)計(jì)5個(gè)水平，分別為：-α，-1，0，1，α，其中α=1.628。因素水平見(jiàn)表1；試驗(yàn)星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1白藜蘆醇的提取工藝星點(diǎn)試驗(yàn)因素水平Table 1 The extraction process of resveratrol for factor levels

表2白藜蘆醇的提取工藝星點(diǎn)試驗(yàn)安排Table 2 The extraction process of resveratrol for experiment planning

續(xù)表2白藜蘆醇的提取工藝星點(diǎn)試驗(yàn)安排Continue table 2 The extraction process of resveratrol for experiment planning

根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，運(yùn)用Design-Expert.8.05軟件分析響應(yīng)面，以白藜蘆醇提取率（Y）為響應(yīng)值分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸二項(xiàng)式方程擬合，擬合模型為：Y =1.02 +0.13A +8.32B +0.05C +2.50AB +0.02AC + 5.00BC+0.04A2+3.36B2+0.02C2（R2=0.955 0），對(duì)模型采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3白藜蘆醇提取率星點(diǎn)設(shè)計(jì)F檢驗(yàn)方差分析Table 3 The resveratrol extraction yield design for F test of variance analysis

由方差分析表可知，所選取的因素對(duì)白藜蘆醇提取率的影響為：A>C>B，即加酶量對(duì)提取率的影響最為顯著，其次為提取溶劑用量和酶解時(shí)間。提取率與提取各因素之間關(guān)系見(jiàn)圖1。

運(yùn)用Design-Expert.8.05軟件對(duì)二項(xiàng)式回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到的白藜蘆醇最佳提取工藝為：酶添加量50 mg/g，酶解時(shí)間30 h，料液比1∶12（g/mL），此時(shí)預(yù)測(cè)得到白藜蘆醇的提取率為1.28 %。按所得到的最佳工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果顯示白藜蘆醇的提取率平均值為1.25 %，與預(yù)測(cè)值的偏差為0.03 %，且試驗(yàn)重現(xiàn)性較好。但考慮實(shí)際的操作性，建議對(duì)影響因素較小的酶解時(shí)間進(jìn)行合理控制，最后確定最佳提取工藝為：酶添加量50 mg/g，酶解時(shí)間20 h，料液比1∶12（g/mL）。

圖1各因素對(duì)花生根、莖白藜蘆醇提取率的影響Fig.1 The factors of the effects that extraction yield of resveratrol from the root and stalk of the peanut注：a為酶添加量與料液比的交互作用；b為酶添加量與酶解時(shí)間的交互作用；c為酶解時(shí)間與料液比的交互作用。

3　討論

1）研究結(jié)果表明，優(yōu)化后的工藝條件明顯改善了原有的酶解法所存在的提取率不穩(wěn)定、提取時(shí)間不確定及提取劑浪費(fèi)等問(wèn)題，優(yōu)化后的提取工藝使提取率保持在1.25 %以上，且提取效果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，避免了試劑與提取時(shí)間的浪費(fèi)。

2）試驗(yàn)過(guò)程中避光和室溫的選擇也為以后花生根、莖中的白藜蘆醇的工業(yè)規(guī)?；崛√峁┝艘欢ǖ默F(xiàn)實(shí)數(shù)據(jù)支撐，保證了工藝實(shí)施推廣的可行性。

3）目前，我國(guó)白藜蘆醇的提取原料主要來(lái)自于葡萄、虎杖等植物?；ㄉ⑶o中白藜蘆醇提取工藝的建立擴(kuò)大了白藜蘆醇提取原料的取材范圍，使花生植物物盡其用，提升了花生植物資源的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為農(nóng)民創(chuàng)收的同時(shí)避免了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，減少了農(nóng)作物秸稈的季節(jié)性燃燒，為進(jìn)一步提升空氣質(zhì)量起到了一定的積極作用。

參考文獻(xiàn)：

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Optimize for Enzymatic Hydrolysis Extraction of Resveratrol from Peanut Rhizoma by Central Composite Design and Response Surface Methodology

WANG Yue-zhen，WANG Yan，MA Qian-li，LIU Zhi-hong，NIU Yan-qiu
（Changchun Medical Collage，Changchun 130031，Jilin，China）

Abstract：To make sure the best enzymolysis extraction process，enzymatic hydrolysis extraction of resveratrol from peanut rhizoma was investigated. Taking cellulose dosage，emzymolysis time and solid-liquid ratio as independent variables，overall extraction of resveratrol from peanut rhizoma as dependent variable，each level of

independent variables was fitted by multiple linear regression and binomial formula fitting，extraction prosess was optimized by response surface method，and prediction was carried out through comparing the observed and predicted value.The results showed that the optimum conditions for enzymolysis were：cellulose dosage 50 mg/g，20 h for enzymolysis and solid-liquid ratio 1∶12（g/mL）.

Key words：peanut；cellulose degradation；CCD；resveratrol

收稿日期：2015-09-11

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.031

作者簡(jiǎn)介：王月珍（1978—），女（漢），講師，碩士，研究方向：中藥學(xué)、藥用資源質(zhì)量評(píng)價(jià)。