張錦捷，曾慶祝（廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣東廣州510006）

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瓊脂糖- Zn（II）親和層析分離純化羅非魚水解多肽初探

張錦捷，曾慶祝*
（廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：以廣州大學(xué)生化課題組自制瓊脂糖微球?yàn)檩d體、環(huán)氧氯丙烷（ECH）為活化劑、亞氨基二乙酸（IDA）為螯合配基、Zn（II）為螯合金屬制備瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質(zhì)。最佳活化工藝：DMSO 6 mL、ECH 10 mL、活化溫度35℃、活化時(shí)間3.0 h；最佳螯合工藝：IDA 0.9 g、反應(yīng)時(shí)間4.0 h、ZnSO4濃度0.25 mol/L，Zn2+螯合量達(dá)到最大值。通過用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，有效地分離純化羅非魚水解多肽，得到適合與Zn（II）螯合的目標(biāo)多肽組分，并制備出多肽-Zn（II）配合物。

關(guān)鍵詞：瓊脂糖-Zn（II）；金屬螯合親和層析（IMAC）；多肽；分離純化；多肽-Zn（II）

定化金屬螯合親和層析（Immobilized Metal Ion AffinityChromatography，IMAC）是由PorathJ等[1]于1975年首次提出，利用蛋白質(zhì)表面暴露的一些氨基酸殘基與載體上的金屬離子之間相互作用而進(jìn)行的分離純化技術(shù)。某些蛋白質(zhì)或氨基酸對一些過渡態(tài)金屬離子如Cu2+、Zn2+、Mn2+等具有特異親和力，因此可以根據(jù)金屬螯合物與蛋白質(zhì)的親和力不同，選擇性地分離純化蛋白質(zhì)[2-3]。由于IMAC的配基簡單、吸附量大、交換載量大、分離條件溫和、通用性強(qiáng)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品的分離純化，逐漸成為最有效的技術(shù)之一[4-5]。

羅非魚魚肉含有多種不飽和脂肪酸和豐富的蛋白質(zhì)，具有高蛋白、低脂肪，營養(yǎng)全面豐富、容易被人體吸收等特點(diǎn)[6-7]。肽類是氨基酸通過肽鍵結(jié)合連接形成的化合物，其實(shí)質(zhì)可以看作是構(gòu)成蛋白質(zhì)的片段，肽類作為生命活動的調(diào)節(jié)物質(zhì)，擔(dān)負(fù)著十分重要的角色[8]。鋅是人體必需微量元素，是多種酶的成分或酶的激活劑，對機(jī)體的生長發(fā)育、組織再生、增強(qiáng)免疫功能等多方面都有重要作用。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多肽比氨基酸更易被人體吸收，而且微量元素（鋅）可以通過肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來轉(zhuǎn)運(yùn)，具有毒性更小、易消化吸收、生物活性高等特殊優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)價(jià)值較大[9-10]。歐洲食品安全局（EFSA）和動物營養(yǎng)科學(xué)委員會（SCAN）的相關(guān)部門對氨基酸-鋅螯合物[Zn（x）1-3·nH2O，其中，x=大豆蛋白水解得到的多肽或氨基酸陰離子，分子量不超過1 500 Da]進(jìn)行了系統(tǒng)評估，認(rèn)為氨基酸-鋅螯合物是一種安全的有效鋅資源，可以應(yīng)用于所有畜禽的飼料中，并且氨基酸-鋅螯合物的使用對環(huán)境和水質(zhì)都不會產(chǎn)生負(fù)面的影響，并建議將氨基酸-鋅螯合物應(yīng)用于飼料添加劑中[11-12]。

本研究以瓊脂糖為原料制備微球，以環(huán)氧氯丙烷為活化劑進(jìn)行活化，再以亞氨基二乙酸為螯合活性介質(zhì)與Zn（II）進(jìn)行螯合制備瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質(zhì)，并初步探究將該介質(zhì)用于分離純化羅非魚水解多肽，篩選出適合與Zn（II）螯合的多肽組分，并制備得到多肽-Zn（II）配合物。

1材料與方法

1.1試劑

瓊脂糖：西班牙BIOWEST公司；液體石蠟、司班80（Span80）、乙酸乙酯、石油醚、NaOH、環(huán)氧氯丙烷（ECH）、二甲基亞砜（DMSO）、亞氨基二乙酸（IDA）、硫酸鋅：所用試劑均為分析純，購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JJ-6數(shù)顯六聯(lián)電動攪拌器、THZ-82水浴恒溫振蕩器：金壇市華歐實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH-4C數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市鴻科儀器廠；HL-2S恒流泵、HD-5電腦紫外檢測儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3方法

1.3.1瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質(zhì)的制備

1.3.1.1微球的制備

稱取一定量瓊脂糖加入蒸餾水中，水浴加熱至95℃使之溶解；在燒杯中分別加入液體石蠟、Span80、乙酸乙酯，攪拌約20 min后，緩慢加入上述瓊脂糖溶液，用恒溫水浴鍋將體系升溫至42℃，在420 r/min速度下攪拌30 min；攪拌結(jié)束后于迅速降溫，常溫放置6 h；抽濾，用石油醚、無水乙醇洗滌后再用蒸餾水反復(fù)沖洗，抽干，收集備用。

1.3.1.2微球的活化

稱取一定量上述制得的微球，依次加入一定量的DMSO、ECH、NaOH溶液，將上述混合液置于35℃的恒溫水浴中振蕩反應(yīng)2 h；反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水反復(fù)沖洗，直至濾液中無環(huán)氧基檢出，抽干，收集備用。

1.3.1.3配基的鍵合

稱取一定量活化后的微球，加入一定量DMSO/ IDA混合溶液，在恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水反復(fù)沖洗，抽干，收集備用。

1.3.1.4鋅離子的螯合

稱取一定量鍵合配基后的微球，加入適量ZnSO4溶液，在常溫下振蕩反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水反復(fù)沖洗，抽干，即得瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質(zhì)。

1.3.2環(huán)氧基修飾密度的定量分析

環(huán)氧基修飾密度采用硫代硫酸鈉滴定法[13]測定。稱取0.5 g活化后的微球于磨口錐形瓶中，加入約5 mL 1.3 mol/L硫代硫酸鈉與1滴~2滴酚酞指示劑，在室溫下振蕩反應(yīng)30 min后用0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，由式（1）計(jì)算環(huán)氧基修飾密度：

式中：S為環(huán)氧基修飾密度，mmol/g；MHCl為HCl的濃度，mol/L；V0、V1為滴定前、后HCl的體積，mL；W為介質(zhì)的質(zhì)量，g；ρ為介質(zhì)的密度，g/mL。

1.3.3 Zn2+螯合量的測定[14]

稱取一定量鍵合配基后的微球，加入25 mL ZnSO4溶液，在常溫下振蕩反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，收集濾液并定容至一定體積，用原子吸收分光光度計(jì)在324.7 nm處測定濾液的吸光值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算Zn2+螯合量。

1.3.4羅非魚水解多肽的制備

稱取適量的魚靡，以1∶3（g/L）固液比加去離子水混勻，在55℃水浴預(yù)熱5 min，加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為9、溫度為55℃，水解1.5 h，水解結(jié)束后在100℃水浴滅活、冷卻、離心、抽濾、超濾、濃縮備用。

1.3.5分離純化

將制得的瓊脂糖微球與瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質(zhì)分別裝柱（1.0 cm×40 cm），用5倍體積蒸餾水平衡；加入2 mL上述制得的多肽液，繼續(xù)用蒸餾水平衡，同時(shí)用電腦紫外檢測儀監(jiān)測，控制流速為1 mL/min；用蒸餾水洗脫至吸光度回歸基線后，改用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，收集洗脫峰，超濾管脫鹽濃縮，干燥后收集備用。

1.3.6多肽-Zn配合物的制備

取一定量分離純化后的多肽配成多肽液與適量ZnCl2溶液混合，調(diào)節(jié)pH，在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間；加入無水乙醇后產(chǎn)生沉淀，離心后收集沉淀物，干燥，收集備用。

2結(jié)果與分析

2.1活化條件的考察

2.1.1 DMSO用量對環(huán)氧基修飾密度的影響

其他條件不變，分別加入2、4、6、8、10 mL DMSO進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 DMSO用量對環(huán)氧基修飾密度的影響Fig.1 Effect of DMSO dosage on epoxy group density

由圖1可知，DMSO在反應(yīng)中起到促進(jìn)活化的作用，它能消除環(huán)氧氯丙烷與瓊脂糖微球在溶液中形成的相界面。隨著DMSO用量增加，環(huán)氧基修飾密度先增大后減小；當(dāng)DMSO用量為6 mL時(shí)，環(huán)氧基修飾密度達(dá)到最大值。

2.1.2 ECH添加量對環(huán)氧基修飾密度的影響

其他條件不變，分別加入4.0、6.0、8.0、10、12 mL ECH進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 ECH添加量對環(huán)氧基修飾密度的影響Fig.2 Effect of ECH dosage on epoxy group density

由圖2可知，環(huán)氧基修飾密度隨著ECH添加量的增加而增大，當(dāng)添加量為10 mL時(shí)，環(huán)氧基修飾密度趨于平穩(wěn)，繼續(xù)增大ECH添加量，環(huán)氧基修飾密度無明顯增加。

2.1.3活化溫度對環(huán)氧基修飾密度的影響

其他條件不變，活化溫度分別為30、35、40、45、50℃，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，溫度對環(huán)氧基修飾密度影響較大，溫度過高時(shí)環(huán)氧基修飾密度下降趨勢明顯，可能由于溫度過高會導(dǎo)致部分環(huán)氧基開環(huán)；當(dāng)活化溫度為35℃時(shí)環(huán)氧基修飾密度達(dá)到最大值。

圖3活化溫度對環(huán)氧基修飾密度的影響Fig.3 Effect of activation temperature on epoxy group density

2.1.4活化時(shí)間對環(huán)氧基修飾密度的影響

其他條件不變，活化時(shí)間分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，結(jié)果如圖4所示。

圖4活化時(shí)間對環(huán)氧基修飾密度的影響Fig.4 Effect of activation time on epoxy group density

由圖4可知，環(huán)氧基修飾密度隨時(shí)間增加先增大后減小，在3.0 h時(shí)達(dá)到最大值。這是由于環(huán)氧基在堿性條件下會發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，時(shí)間越長開環(huán)越嚴(yán)重，導(dǎo)致環(huán)氧基修飾密度下降。

2.2螯合條件的考察

2.2.1 IDA用量對Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，分別加入0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g IDA進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 IDA用量對Zn2+螯合量的影響Fig.5 Effect of IDA dosage on the adsorption of Zn2+

由圖5可知，Zn2+螯合量隨著IDA用量的增加而增大，當(dāng)IDA用量為0.9 g時(shí)，Zn2+螯合量趨于平穩(wěn)，說明反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡。

2.2.2反應(yīng)時(shí)間對Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，反應(yīng)時(shí)間分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，結(jié)果如圖6所示。

圖6反應(yīng)時(shí)間對Zn2+螯合量的影響Fig.6 Effect of activation time on the adsorption of Zn2+

由圖6可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，Zn2+螯合量先增大后減小，可能是部分已經(jīng)與瓊脂糖反應(yīng)的IDA在堿性條件時(shí)間過長而降解，最終連接在介質(zhì)上的IDA減少而導(dǎo)致Zn2+螯合量減小。

2.2.3 ZnSO4濃度對Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，ZnSO4濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mol/L，結(jié)果如圖7所示。

圖7 ZnSO4濃度對Zn2+螯合量的影響Fig.7 Effect of ZnSO4concentration on the adsorption of Zn2+

由圖7可知，隨著ZnSO4濃度增大，Zn2+螯合量先增大后趨于平穩(wěn)，在濃度為0.25 mol/L時(shí)，Zn2+螯合量達(dá)到最大值，反應(yīng)達(dá)到平衡。

2.3瓊脂糖-Zn（II）親和層析圖譜分析

未螯合鋅離子的瓊脂糖微球?qū)游鰣D譜如圖8所示。

層析過程只有一個(gè)峰值，在18 min左右出現(xiàn)峰值，說明開始有多肽被洗脫下來；在31 min左右峰值達(dá)到最大，且吸光度達(dá)到0.94；在50 min左右吸光度回歸基線再用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，無峰值出現(xiàn)；說明用蒸餾水已經(jīng)將多肽全部洗脫下來，多肽未與瓊脂糖微球發(fā)生作用。

圖8瓊脂糖微球?qū)游鲎V圖Fig.8 Chromatography spectra of sepharose microspheres

瓊脂糖-Zn（II）介質(zhì)層析譜圖如圖9所示。

圖9瓊脂糖-Zn（II）介質(zhì)層析譜圖Fig.9 Chromatography spectra of Sepharose-Zn（II）

層析過程出現(xiàn)兩個(gè)峰值，第一個(gè)峰值出現(xiàn)在18 min左右，在31 min左右峰值達(dá)到最大，與未螯合鋅離子的瓊脂糖微球?qū)游鰣D譜出峰時(shí)間相同，且最大吸光度為0.89，比未螯合鋅離子的瓊脂糖微球?qū)游鰣D譜的最大吸光度小，說明有部分多肽未被洗脫；在56 min左右吸光度回歸基線后再用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，在96 min左右出現(xiàn)第二個(gè)峰值，說明用0.05 mol/L EDTA緩沖液將未被洗脫的多肽組分洗脫下來，與第一個(gè)峰值吸光度較小解釋相吻合，即該多肽組分與瓊脂糖-Zn（II）介質(zhì)發(fā)生了親和作用，為適合與Zn（II）螯合的目標(biāo)多肽組分。

2.4多肽與多肽-Zn配合物紅外光譜分析

多肽與多肽-Zn配合物紅外光譜如圖10所示。

圖10多肽（a）與多肽-Zn（II）（b）紅外光譜圖Fig.10 FT-IR spectra of Peptide（a）and Peptide-Zn（II）（b）

由圖10多肽（a）與多肽-Zn（II）（b）紅外光譜圖可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多肽上的氨基酸殘基與金屬離子結(jié)合后，能觀察到多肽的紅外圖譜發(fā)生變化[15-16]。首先觀察光譜的官能團(tuán)區(qū)，多肽（a）在3 349 cm-1處由酰胺的N-H的伸縮振動引起的一個(gè)寬吸收峰，在形成多肽-Zn（II）配合物（b）后移至較低波數(shù)3 294 cm-1處，紅移了54.50 cm-1。多肽（a）在2 959 cm-1處由-CH3伸縮振動引起的吸收峰，在多肽-Zn（II）配合物（b）中轉(zhuǎn)變到2 964 cm-1處，藍(lán)移了5.30 cm-1，強(qiáng)度也減弱了，并且多肽-Zn（II）配合物（b）在3 077 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰，說明多肽與Zn（II）結(jié)合后，多肽的結(jié)構(gòu)構(gòu)型發(fā)生了改變。多肽（a）在1 650 cm-1附近有伸縮振動酰胺I帶的特征譜峰，這是由酰胺的C=O伸縮振動引起的。多肽與Zn （II）結(jié)合后，這個(gè)譜帶位置變換到了1 655 cm-1，藍(lán)移了5.30 cm-1。多肽（a）在1 596 cm-1處有一個(gè)吸收峰，可能是由C=N、C=C伸縮振動引起的，與Zn（II）結(jié)合后這個(gè)峰消失了。多肽（a）在多肽吸收帶1 400 cm-1處附近有伸縮振動酰胺III帶的特征譜峰，這是由酰胺的NH彎曲振動或C-N的伸縮振動引起的，在多肽-Zn（II）配合物（b）的吸收帶變換到1398cm-1，紅移了2.27cm-1。接著觀察光譜的指紋區(qū)，多肽（a）在1 113 cm-1和1 048 cm-1處分別有一個(gè)由C-O伸縮振動引起的特征峰，而多肽-Zn（II）配合物（b）中這兩個(gè)譜峰均消失了。多肽（a）在多肽吸收帶652 cm-1處有附近有一個(gè)由NH面外變形振動引起的寬吸收峰，在與Zn（II）結(jié)合后這個(gè)譜帶位置變換到669 cm-1，藍(lán)移了16.65 cm-1。以上這些結(jié)果表明分離純化得到的多肽是適合與Zn（II）螯合的目標(biāo)多肽組分，多肽與Zn（II）的配合位置可能在N-H的氮原子與C=O或C-O的氧原子上。

3　結(jié)論

以瓊脂糖為原料制備微球，以環(huán)氧氯丙烷為活化劑進(jìn)行活化，再以亞氨基二乙酸為螯合活性介質(zhì)與Zn2+進(jìn)行螯合制備瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質(zhì)，并對親和層析介質(zhì)的活化與螯合過程的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1）活化工藝：DMSO與ECH的添加量分別為6 mL 和10 mL，在35℃下恒溫水浴振蕩反應(yīng)3.0 h，環(huán)氧基修飾密度達(dá)到最大值。

2）螯合工藝：IDA用量為0.9 g，在恒溫水浴中反應(yīng)4.0 h后與0.25 mol/L硫酸鋅溶液進(jìn)行螯合，Zn2+螯合量達(dá)到最大值。

3）分離純化：通過對比未螯合鋅離子的瓊脂糖微球與瓊脂糖-Zn（II）親和層析圖譜，表明自制的瓊脂糖-Zn（II）親和層析介質(zhì)能有效地分離純化羅非魚水解多肽，通過用0.05 mol/L EDTA緩沖液洗脫，得到適合與Zn（II）螯合的目標(biāo)多肽組分，并制備出多肽-Zn （II）配合物，為制造出一種免疫增強(qiáng)和促進(jìn)機(jī)體健康生長的生物活性物質(zhì)—羅非魚蛋白多肽-Zn配合物作為飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。

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Purification of Tilapia Hydrolysis Polypeptide by Sepharose-Zinc（II）Affinity Chromatography

ZHANG Jin-jie，ZENG Qing-zhu*
（College of Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Abstract：The Sepharose-zinc（II）affinity chromatography chelating with Zn（II）using self-made sepharose microspheres as substrate. The iminodiacetic acid（IDA）was attached onto chitosan microspheres activated by epichlorohydrin（ECH）. The results indicated that the optimal activation process was achieved at 10 mL epichlorohydrin as activating accelerator in the solution consisting of 6 mL DMSO at 35℃for 3.0 h. The study on linkaging of IDA demonstrated that the support was synthesized in the solution with 0.9 g IDA for 4.0 h，then synthesized in the solution with 0.25 mol/L ZnSO4whose adsorption of Zn2+was up to the maximum. The tilapia hydrolysis polypeptide had been effectively purified，then got the component which was suitable for chelating with Zinc（II）and the preparation of peptide-Zinc complexes by using 0.05 mol/L EDTA buffer.

Key words：sepharose-Zinc（II）；IMAC；polypeptide；purification；peptide-Zinc

收稿日期：2014-08-20

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.004

*通信作者：曾慶祝，男（漢），教授。

作者簡介：張錦捷（1989—），男（漢），碩士，研究方向：食品加工副產(chǎn)物的高值化利用。

基金項(xiàng)目：廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（12C12011620）；廣州市科信局重大專項(xiàng)（2012Y2-00008）