齊玲倩，劉秀，丁夢璇，劉遠(yuǎn)遠(yuǎn)，柯潤輝，尹建軍（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

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植物油DNA提取和基因檢測研究進(jìn)展

齊玲倩，劉秀*，丁夢璇，劉遠(yuǎn)遠(yuǎn)，柯潤輝，尹建軍
（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

摘要：基因檢測方法以其快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確的特點而廣泛應(yīng)用在植物油真實性和轉(zhuǎn)基因成分鑒定中。但植物油大都經(jīng)過精制加工，DNA含量極少且完整度低，這對植物油的基因提取和檢測造成了極大的困擾。本文對植物油DNA提取和基因檢測進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對以后的發(fā)展進(jìn)行了展望，以期為研究者提供一定的理論參考。

關(guān)鍵詞：植物油；DNA提??；基因檢測

植物油是人類日常生活的重要組成部分，但是近年來植物油市場出現(xiàn)了較多的摻假植物油和轉(zhuǎn)基因植物油，例如摻雜大豆油、棕櫚油的花生油，摻雜榛子油、杏仁油、玉米油的橄欖油和轉(zhuǎn)基因大豆油，轉(zhuǎn)基因菜籽油等[1-2]，這嚴(yán)重?fù)p害了消費者的利益，侵犯了消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)。

為了保障消費者的利益和權(quán)利，迫切需要對植物油的真實性和轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行鑒定。目前，植物油真實性的鑒定方法主要有色譜分析法、光譜分析法[3]和分子生物學(xué)方法，但是色譜分析法和光譜分析法都是基于理化成分的分析，容易受到季節(jié)、產(chǎn)地、生產(chǎn)條件等因素的影響，同時檢測限度較高（≥5 %），而分子生物學(xué)方法則更能反映原料的真實性，且快速、靈敏、準(zhǔn)確，因此在植物油真實性鑒定中應(yīng)用廣泛[4]。而植物油轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法也主要是分子生物學(xué)方法。分子生物學(xué)方法有基于蛋白質(zhì)和基于DNA的方法，但因為DNA有較高的熱耐受性和酸堿耐受性，且在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，所以目前所使用的主要為基于DNA的分析方法。

但是，經(jīng)過復(fù)雜的加工處理后，植物油的DNA降解為大小不一的碎片，且含量極低，這給植物油的基因提取和檢測造成了極大的困難[5-7]。近年來很多研究者對此進(jìn)行研究，并取得了一定的進(jìn)展，本文對這些進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，以期為研究者提供一定的理論參考。

1植物油DNA的提取

國內(nèi)外關(guān)于植物油DNA提取的報道，大多數(shù)采用試劑盒法提取[8-12]，但是因為精煉植物油中DNA含量少且完整度低，所以目前采用的試劑盒法均經(jīng)過改良，而改良一般針對油樣的前處理，目前研究較多的改良方法為乳化法、濃縮法及離心法。白立群等[13]先用等體積的無菌水對20 mL大豆油進(jìn)行振蕩乳化，接著利用冷凍干燥的方法進(jìn)行濃縮，結(jié)果成功檢測到大豆的Lectin基因。程紅梅等[8]利用實驗室自制試劑盒提取大豆油的DNA時，首先用10 mL的正己烷對油樣進(jìn)行乳化，結(jié)果從10 mL大豆油中提取出0.4 μg高純度的DNA。Pasqualone[14]、Montemurro[15]、Alba[16]等在試劑盒提取之前都對橄欖油樣品進(jìn)行了離心分離，效果良好。

根據(jù)何景[4]和Joana Costa[17]的報道，在國外，應(yīng)用在植物油DNA提取中的試劑盒主要有the Qiagen QIAamp DNA stool extraction kit、the Nucleospin food kit、the Wizard Magnetic DNA Purification System（Promega）for food，其中，the Wizard Magnetic DNA Purification System（Promega）Kit是應(yīng)用的較為廣泛的一種方法，主要原理是磁珠法，利用磁珠的磁性吸附核酸分子，而與油中的蛋白、脂肪、色素等雜質(zhì)分離開。但是對于完全精制的植物油，Costa等[18]比較了the Nucleospinfood kit和the Wizard Magnetic DNA Purification System （Promega）for food的DNA提取效果，發(fā)現(xiàn)the Nucleospin food kit能從所有精制油樣中提取出可擴(kuò)增的DNA，而the Wizard Magnetic DNA Purification System （Promega）for food則不能，這與Zhang等[19]報道的利用the Wizard Magnetic DNA Purification System（Promega）for food不能提取出精煉大豆油的DNA相符。而在國內(nèi)，應(yīng)用在植物油DNA提取中的試劑盒主要為Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）。覃文等[9]利用改良的Wizard Genomic DNA Purification Kit （Promega）從市售的玉米胚芽油，大豆色拉油中及混合油脂中提取出DNA，并擴(kuò)增出相應(yīng)的內(nèi)源基因。何偉麗等[10]也利用改良的Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）從大豆色拉油中提取出了可擴(kuò)增出Lectin基因（118bp）的DNA。

雖然現(xiàn)有的研究大多集中于各種試劑盒法提取植物油中的DNA，但是，試劑盒法造價較貴，因此出現(xiàn)了一些提取的新方法。白立群等[13]建立了一種有效的精煉大豆油DNA提取新方法-冷凍干燥法，他們將該方法的DNA提取效果與改良的the Wizard Magnetic DNA Purification System（Promega）for food的DNA提取效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥法的DNA富集效果以及檢測的靈敏度都高于試劑盒法。姚菲等[20]建立了一種有效的菜籽油DNA提取新方法-改進(jìn)的DNA法，他們將該改進(jìn)的DNA提取方法與冷凍干燥法、高鹽低pH法、改良SDS法、試劑盒法的DNA提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該改進(jìn)方法提取的DNA（OD260/OD280）純度為1.7~2.0，濃度達(dá)到10 ng/μL，且適合實時熒光定量PCR檢測，效果最好。

關(guān)于植物油DNA的提取，各種方法層出不窮，但是沒有一個公認(rèn)的、高效通用的提取方法。因此，發(fā)展高效通用的植物油DNA提取方法需要進(jìn)行更深層次的研究。

2植物油DNA的檢測

基因檢測技術(shù)在植物油方面的應(yīng)用主要集中在2個研究方向：轉(zhuǎn)基因成分鑒定和真實性鑒定，植物油的真實性鑒定又包括摻假成分鑒定和原料品種鑒定2個方面[4]。

2.1植物油轉(zhuǎn)基因成分和摻假成分鑒定

植物油轉(zhuǎn)基因成分和摻假成分鑒定中常用的基因檢測技術(shù)有定性PCR法、PCR-Gene Scan法、實時熒光定量PCR法、多重巢式PCR法及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）法[4-5]。

2.1.1定性PCR法

定性PCR法以其靈敏度高、簡便快捷的特點而廣泛應(yīng)用于植物油的轉(zhuǎn)基因和摻假成分鑒定上[5]。程紅梅等[8]針對市場上出售的10種精煉大豆油DNA進(jìn)行35S、Nos、Epsps、Lectin基因的PCR檢測，其中，Lectin基因在10種大豆油中的擴(kuò)增結(jié)果均呈陽性，其余3種基因在10種大豆油中也有陽性結(jié)果出現(xiàn)，這說明定性PCR法可以檢測到植物油的外源基因。金紅等[21]針對兩個大豆色拉油品種的DNA進(jìn)行35S、Nos、Epsps、Lectin基因的PCR擴(kuò)增，結(jié)果這4種基因都出現(xiàn)了相應(yīng)的擴(kuò)增條帶，且與轉(zhuǎn)基因大豆一致。王德蓮等[2]利用定性PCR法對摻有大豆油和棕櫚油的花生油進(jìn)行檢測，結(jié)果當(dāng)摻入的大豆油和花生油體積百分比達(dá)到10%時，該方法可以檢測到大豆油和棕櫚油的內(nèi)源基因。

雖然定性PCR法靈敏簡便，但是其分辨率低、容易污染、較難實現(xiàn)自動化，而且凝膠電泳時使用有毒試劑（EB、GoldWell等），同時也無法進(jìn)行定量，這些方面限制了其在植物油轉(zhuǎn)基因成分和摻假成分鑒定中的應(yīng)用。

2.1.2 PCR-GeneScan法

PCR-GeneScan法是在特異性擴(kuò)增反應(yīng)后，用測序儀器對產(chǎn)物進(jìn)行GeneScan掃描，可以區(qū)分相差一個堿基的DNA片段，省去了凝膠電泳檢測，方便、快捷。覃文等[9]針對市售的大豆油、玉米油及混合油進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測，應(yīng)用PCR-GeneScan法，以大豆、玉米的內(nèi)源基因（Lectin、IVR）為質(zhì)控，檢測出了外源的CryIA（b）和Epsps基因。

相比于定性PCR法，該方法靈敏度較高，但是對操作人員及儀器設(shè)備的要求較高，普遍適用性不強(qiáng)。

2.1.3實時熒光定量PCR法

實時熒光定量PCR法（簡稱qPCR），是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累來對整個PCR進(jìn)程進(jìn)行實時監(jiān)控，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比來達(dá)到對未知模板定量的要求。白立群等[13]對5種品牌大豆油的DNA進(jìn)行Lectin、CaMV35S和Nos基因的qPCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陽性，與商標(biāo)標(biāo)識一致。蔡翠霞等[22]對11種植物油的DNA進(jìn)行CaMV35S的qPCR擴(kuò)增，結(jié)果7種植物油的擴(kuò)增結(jié)果呈陽性，與樣品的成分標(biāo)識一致。王德蓮等[2]利用qPCR法對摻有大豆油和棕櫚油的花生油進(jìn)行檢測，結(jié)果當(dāng)摻入的大豆油和花生油體積百分比達(dá)到10 %時，該方法可以檢測到大豆油和棕油的內(nèi)源基因。

qPCR法靈敏度高、特異性強(qiáng)、再現(xiàn)性好，與定性PCR相比，交叉污染幾率小、快捷、準(zhǔn)確，其最低檢測線可以達(dá)到pg級。但是，精準(zhǔn)定量不理想，對儀器設(shè)備要求較高，檢測費用較高。

2.1.4多重巢式PCR法

多重巢式PCR法結(jié)合了巢式PCR的高靈敏度和多重PCR的快速、簡便和高特異性的特點，在植物油轉(zhuǎn)基因成分檢測中有一定的應(yīng)用。王澎等[23]對轉(zhuǎn)基因大豆油進(jìn)行檢測，單獨用二重巢式PCR的3對引物進(jìn)行擴(kuò)增時并無明顯片段，經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增后則獲得目的片段，證明二重巢式PCR可將含量較低的片段純化，提高反應(yīng)的特異性和靈敏性。敖金霞等[24]建立了五重巢式PCR對轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻進(jìn)行PCR檢測，檢測靈敏度達(dá)到0.000 5 %。

多重巢式PCR具有高通量、高特異性、高靈敏性的特點，但是其擴(kuò)增2次，很容易出現(xiàn)交叉污染而導(dǎo)致假陰性結(jié)果[4]。

2.1.5環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）法是一種恒溫核酸擴(kuò)增的新方法，該方法在恒溫條件下，利LAMP法比普通PCR法高2個~5個數(shù)量級[4]，對儀器要求較低，檢測成本少，操作及結(jié)果判定簡單，但是該方法引物設(shè)計比較復(fù)雜，處理擴(kuò)增產(chǎn)物時容易造成DNA污染，同時，蔡翠霞等[22]研究發(fā)現(xiàn)，對于食用植物油，LAMP檢測存在產(chǎn)生假陰性結(jié)果的可能。

2.2植物油原料品種的鑒定

分子標(biāo)記法具有共顯性、多態(tài)性高、數(shù)量多等優(yōu)點，被廣泛用在植物油原料品種的鑒定上。對于植物油原料品種的鑒定，目前研究最多的植物油為橄欖油。據(jù)報道，應(yīng)用在橄欖油原料品種鑒定上的分子標(biāo)記主要有：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD），擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP），簡單重復(fù)序列（SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）[17]。但是考慮到精制植物油中DNA完整度極低，需要對這些方法進(jìn)行選擇，以確定高效的應(yīng)用于精制植物油原料品種鑒定的分子標(biāo)記。

2.2.1 RAPD

RAPD操作簡單，花費少，需要的植物基質(zhì)的量比較少，被廣泛應(yīng)用在植物研究中，近年來也有研究報道了其在橄欖油真實性鑒定中的應(yīng)用。然而，Muzzalupo，Perri[26]利用RAPD對橄欖葉和橄欖油沉淀中的DNA進(jìn)行分子標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉中和油沉淀中的RAPD的結(jié)果并不一致。同樣，Martins-Lopes等[27]用RAPD引物對9個品系的橄欖油DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示7個品系的橄欖油DNA具有多態(tài)性，多態(tài)性水平為78 %。對此，Joana Costa等[17]認(rèn)為可能是由于橄欖油中DNA的完整度比較低，不能擴(kuò)增出足夠的指紋標(biāo)記來對其真實性進(jìn)行鑒定。由此看來，RAPD分子標(biāo)記對于精煉植物油中DNA完整度低的問題，并不能夠有效克服。

2.2.2 AFLP

AFLP是一種有效的多位點分子標(biāo)記，無需基因組的序列信息，具有較高的多態(tài)性和可靠性，被廣泛應(yīng)用在大量作物和野生物種的基因型分析。Busconi等[28]用AFLP對單品種橄欖油中的DNA進(jìn)行分析，結(jié)果顯示油中的DNA與從相同品系葉子中提取的DNA有高度的一致性。但是，AFLP技術(shù)操作極其復(fù)雜，而且很難分析獲得的大量條帶，不適合混合品種的橄欖油鑒定。同時，Pafundo等[29]強(qiáng)調(diào)了DNA的低完整性，會對AFLP的再現(xiàn)性產(chǎn)生較大的影響。這使得該技術(shù)在精煉植物油真實性鑒定中的應(yīng)用受到一定的限制。

2.2.3 SSR

SSR屬于第三代分子標(biāo)記，多態(tài)性高，廣泛分布在植物基因組，辨別力強(qiáng)，是最可靠的分子標(biāo)記之一，應(yīng)用也最廣泛。Rayda Ben-Ayed等[30]研究得出：利用SSR分子標(biāo)記建立的檢測方法可以對22種橄欖油品系進(jìn)行鑒定。Alba等[16]對橄欖葉的SSR指紋與相應(yīng)油的進(jìn)行比較時，發(fā)現(xiàn)SSR片段有85.7 %的成功率，90 %的試驗結(jié)果顯示了葉和油SSR標(biāo)記的良好一致性。但是，SSR標(biāo)記所應(yīng)用的擴(kuò)增片段一般都比較短（小于300 bp），而較長的片段則不總是被擴(kuò)增，使得其在較長片段上的應(yīng)用受到了限制。

2.2.4 SNP

SNP是近年來發(fā)展起來的第三代分子標(biāo)記，與其他分子標(biāo)記相比，遺傳穩(wěn)定性高，位點豐富且分布廣泛，能區(qū)分個體間的微小不同，可有效應(yīng)用在橄欖油真實性鑒定上[31]。Consolandi等[32]利用SNP分子標(biāo)記，設(shè)計了結(jié)合多重PCR與LDR-UA（連接酶測試反應(yīng)-通用芯片）的技術(shù)，利用該技術(shù)，他們可以區(qū)分49個橄欖品種。因此，SNP分子標(biāo)記有結(jié)合高通量技術(shù)的可能性，在進(jìn)行多樣品快速鑒定時，具有很大的優(yōu)勢。但是，SNP分子標(biāo)記的發(fā)展需要結(jié)合基因組序列信息的發(fā)展，而目前可用的序列信息量較少[33]。

3總結(jié)和展望

綜上所述，植物油DNA的質(zhì)量影響基因檢測的效率問題，是國內(nèi)外研究的熱點。對于DNA的提取，應(yīng)用較多的為改良試劑盒法，但改良試劑盒法造價貴，且通用性差，一些DNA提取新方法花費的成本雖少，但也存在通用性差的特點，而行標(biāo)法雖屬于通用的植物油DNA提取方法，但是其有效性不理想，因此，需要對其進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。對于DNA的檢測，在轉(zhuǎn)基因成分和摻假成分的鑒定方面，定性PCR法、PCRGeneScan法、qPCR法的檢測結(jié)果容易受到精煉植物油DNA低含量和低完整度的影響，而出現(xiàn)假陰性，多重巢式PCR法和LAMP法靈敏度高，但多重巢式PCR容易出現(xiàn)交叉污染，LAMP法引物設(shè)計復(fù)雜，擴(kuò)增產(chǎn)物處理時易污染，因此，靈敏度高、特異性好、操作簡單快捷、精準(zhǔn)定量、成本低的檢測技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。在植物油原料品種的鑒定上，分子標(biāo)記法具有共顯性、多態(tài)性高、數(shù)量多等優(yōu)點，被廣泛用在在植物油真實性鑒定上，其中RFLP和AFLP的再現(xiàn)性容易受到DNA低完整性的影響，SSR標(biāo)記的辨別力強(qiáng)，但是再現(xiàn)性容易受到大片段基因不總是被擴(kuò)增的影響，SNP標(biāo)記能區(qū)別個體間的微小不同，而且能夠結(jié)合高通量技術(shù)，可以適應(yīng)快速檢測的需要，是最實用的植物油DNA檢測的分子標(biāo)記。但是，目前，結(jié)合高通量技術(shù)的SNP分子標(biāo)記技術(shù)以及多種檢測方法結(jié)合或并用的技術(shù)還不成熟，需要進(jìn)行更深層次的研究。

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Advances in DNA Extraction and Gene Detection for Vegetable Oils

QI Ling-qian，LIU Xiu*，DING Meng-xuan，LIU Yuan-yuan，KE Run-hui，YIN Jian-jun
（China National Research Institute Food & Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：Methods for gene detection have been widely used in the authentication and GMO detection for vegetable oils because of their rapidity，efficiency，sensitivity and accuracy. While，as for vegetable oils，the low quantity and integrity of DNA caused by being refined increase the difficulties of DNA extraction and gene detection. In this paper，we review the progress of DNA extraction and gene detection for vegetable oils and make some respect for their future，so as to provide theoretical reference for the researchers in some degree.

Key words：vegetable oils；DNA extraction；gene detection

收稿日期：2014-12-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.053

*通信作者：劉秀（1979—），男（漢），高級工程師，研究方向：食品真實性檢測。

作者簡介：齊玲倩（1989—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：食品真實性的分子鑒別方法。