蔣文莉 ，唐　杰 ，王月香

(1.解放軍總醫(yī)院超聲科，北京　100853；2.北京醫(yī)院超聲科，北京　100730)

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低強度超聲促進周圍神經(jīng)修復的研究進展

蔣文莉1,2，唐杰1，王月香1

(1.解放軍總醫(yī)院超聲科，北京100853；2.北京醫(yī)院超聲科，北京100730)

摘要：周圍神經(jīng)損傷后的修復一直是醫(yī)學界研究的熱點和難點。雖然顯微外科學的發(fā)展以及組織工程的出現(xiàn)，為周圍神經(jīng)損傷后的修復帶來了佳音，但是目前其臨床療效仍不十分理想。低強度超聲波作為物理治療的一種方式，被研究認為能促進周圍神經(jīng)損傷的修復。低強度超聲主要利用超聲波的機械效應，提高細胞膜和細胞壁的通透性，增強細胞的新陳代謝，促進細胞生長。低強度超聲治療最早在臨床上主要應用于促進骨折愈合、肌腱愈合及軟骨、椎間盤等組織的愈合中。早期人們也研究過低強度超聲在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，爭論的焦點主要在連續(xù)超聲或脈沖超聲方式的選擇以及熱效應是否發(fā)揮作用上。初步研究表明：低強度超聲可以促進雪旺細胞增生以及在大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷、坐骨神經(jīng)截斷傷、神經(jīng)導管修復缺損坐骨神經(jīng)等神經(jīng)損傷過程中的修復和再生。對于其作用的機制的研究也從細胞學、分子生物學、酶學、離子通道等多個角度進行了探索。作為無創(chuàng)便捷的治療方法，低強度超聲雖然還有很多方面的問題尚待商榷研究，其未來廣闊的臨床應用空間是值得肯定和期待的。

關鍵詞：周圍神經(jīng)損傷；再生和修復；低強度超聲

當今社會由于自然災害、交通事故、戰(zhàn)爭及意外創(chuàng)傷等造成的周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生率相當可觀，在歐洲每年有30萬的周圍神經(jīng)損傷病例[1]。周圍神經(jīng)損傷后的修復一直是醫(yī)學界研究的熱點和難點。1997年Terzis等[2]提出了自體神經(jīng)移植術，自此自體神經(jīng)移植一直被認為是周圍神經(jīng)損傷后治療的“金標準”，自體移植后周圍神經(jīng)缺損病例臨床功能恢復率達80%[3]。但是由于供體神經(jīng)來源有限，需要二次手術及供體部位功能缺失、易發(fā)并發(fā)癥等原因，自體神經(jīng)移植的發(fā)展受到了限制。雖然近年來組織工程的發(fā)展為周圍神經(jīng)缺損的修復提供了新的材料和思路，但是顯微外科手術后神經(jīng)功能的恢復時間仍很長，且效果并不十分理想。進一步研究促進軸突再生的技術方法，將有助于推進周圍神經(jīng)損傷后修復的研究進展，具有重要的臨床意義。近年來許多物理治療方法，如激光、電刺激、磁場及超聲波等被應用到促進周圍神經(jīng)損傷后的修復和再生中來，并證實確實有效[4]。

1低強度超聲波的物理作用機制

超聲波是物體的機械振動在介質(zhì)中傳播時形成的機械振動波，能進入和穿過生物組織，以其特有的機械效應、熱效應及空化效應，正廣泛應用于臨床診斷和治療的各個方面。

當超聲波進入人體組織后，組織將會吸收一定數(shù)量的聲波，使組織溫度升高。溫度升高的幅度與聲波的強度及照射時間等都有直接的關系。這就是超聲波的熱效應。機械效應是超聲波最基本的作用。超聲波是一種機械振動波，當聲強較低時，生物組織在超聲波作用下能產(chǎn)生彈性振動，其振幅和超聲波聲強的平方根成正比，當聲強較高時，組織的振動會超過其彈性極限，造成組織斷裂或者破壞。超聲手術刀和超聲碎石等都是利用這一效應進行工作。在組織中會存在一些小氣泡，在超聲的作用下，小氣泡的振動會增強，甚至破裂，伴隨局部的高溫、高壓，從而引起生物學反應。這就是超聲的空化效應。在超聲治療過程中，主要利用上述幾種效應通過超聲能量的變化來促進生物組織反應，達到治療目的。目前臨床上超聲治療的應用主要有如下一些方面：超聲碎石、超聲理療、超聲手術刀、高強度超聲聚焦治療、超聲美容、超聲白內(nèi)障乳化、超聲藥物透入療法、超聲霧化吸入療法、超聲潔牙等。超聲劑量學的產(chǎn)生讓超聲治療應用中的劑量選擇有了更多的研究依據(jù)。不同頻率不同劑量的超聲照射可能會帶來不同的生物學效應。在一定范圍內(nèi)，超聲治療引起的生物效應是安全的有效的。一旦超過安全閾值，可能會帶來不可逆的生物學破壞。

而小于3 W·cm-2的低強度脈沖超聲,主要利用超聲波的機械效應來對病變進行治療。低強度脈沖超聲能增強細胞膜、細胞壁附近或細胞液內(nèi)液態(tài)介質(zhì)點的運動，從而增強細胞膜及細胞壁的能量傳遞，加速反應底物與催化酶的作用及作用產(chǎn)物的釋放，提高生物反應的速度。另外低強度脈沖超聲在傳播過程中能產(chǎn)生有規(guī)律的穩(wěn)態(tài)空化效應，空化泡的振動能對其他微粒產(chǎn)生剪切作用。低強度脈沖超聲主要是依靠這種機械振動及穩(wěn)態(tài)空化效應，使胞內(nèi)質(zhì)流動，并且提高細胞膜及細胞壁的通透性，從而促進細胞新陳代謝[5]。

2低強度超聲在促進骨折愈合、肌腱愈合等其他領域的研究現(xiàn)狀

低強度脈沖超聲被證實對很多組織損傷有治療修復作用。1983年Duarte[6]首先將強度分別為49.6 mW·cm-2和57 mW·cm-2脈沖重復頻率為1 MHz的低強度超聲應用到假性關節(jié)和骨折的治療中。大量臨床研究亦證實了低強度脈沖超聲對新鮮骨折和骨不連的促進作用。對于術后延遲愈合和骨不連患者，低強度超聲輻照可作為首選治療方法，在術后6個月內(nèi)治療可取得較好療效。隨著低強度脈沖超聲波對骨折和骨不連治療效果的深入而廣泛的研究，此項技術在運動醫(yī)學和骨科康復領域逐漸進入臨床。

美國食品藥品監(jiān)督管理局分別于1994年10月和2000年2月相繼批準低強度脈沖超聲能促進新鮮骨折的愈合及治療陳舊性骨不連[7]。許多學者也證實強度小于等于100 mW·cm-2的低強度脈沖超聲能影響許多生物過程，比如：患有糖尿病大鼠的皮膚愈合,慢性靜脈曲張潰瘍的修復,慢性炎癥過程,成骨不全的康復[8]等。低強度超聲還能增強各種軟組織的愈合，比如軟骨、椎間盤等。它還能通過影響軟骨組織而影響骨—肌腱連接處，從而促進肌腱的愈合[9]。

3低強度超聲在神經(jīng)系統(tǒng)的研究狀況

在超聲生物效應研究的早期階段，人們就開始關注超聲對神經(jīng)系統(tǒng)的作用。1929年Harvey等報道神經(jīng)肌肉準備好的青蛙坐骨神經(jīng)受到超聲刺激時，其腓腸肌發(fā)生擺動，而用箭毒處理的肌肉卻不能擺動。1939年Pohlman團隊第一次報道超聲能成功治療坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)功能紊亂。1942年和1952年Scholtz和Stuhilfuth分別證實超聲在神經(jīng)組織的臨床療效中發(fā)揮重要作用[10]。1988年Hong等[11]首次觀察了強度0.5 W·cm-2，頻率1.0 MHz連續(xù)脈沖超聲對損傷神經(jīng)再生的加速作用。從此很多動物實驗及臨床研究用來研究其作用機制。但是這些研究大多集中在對連續(xù)性脈沖超聲上，機制研究也主要在爭論是熱效應還是非熱效應。目前強度在0.05～0.5 W·cm-2之間的超聲被廣泛應用于影像方面。

4低強度超聲在周圍神經(jīng)損傷后修復中的研究現(xiàn)狀

4.1低強度超聲對周圍神經(jīng)損傷后的修復的作用

4.1.1低強度脈沖超聲對離體雪旺細胞的作用雪旺細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中重要的膠質(zhì)細胞,是周圍神經(jīng)微環(huán)境中促進軸突再生的最關鍵因素，對神經(jīng)的再生和成熟起著至關重要的作用，主要表現(xiàn)為：分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)生長因子且均能顯著地促進神經(jīng)軸突的生長；表達細胞黏附分子，如層黏連蛋白、纖黏連蛋白、神經(jīng)細胞黏附分子等；清除遠端殘干處軸突殘片，形成神經(jīng)內(nèi)膜鞘層，從而支持和引導軸突生長等。研究表明，低強度超聲可促進雪旺細胞增生、防止細胞死亡，從而促進神經(jīng)恢復，并可促進雪旺細胞NT-3基因的表達[12-15]。

4.1.2低強度超聲對大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷的作用坐骨神經(jīng)擠壓傷后，應用低強度超聲對神經(jīng)損傷部位進行輻照后，在超聲輻照后不同時間段(2、4、6、8周)治療組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、感覺神經(jīng)傳導速度、神經(jīng)生長因子及有髓鞘神經(jīng)纖維密度、髓鞘厚度等均顯著高于對照組。研究認為損傷后早期應用低強度脈沖超聲可促進受損神經(jīng)的恢復，而神經(jīng)生長因子上調(diào)可能是低強度超聲促進損傷神經(jīng)修復的作用機制[16]。

4.1.3低強度超聲對坐骨神經(jīng)截斷傷的作用研究顯示坐骨神經(jīng)截斷傷后局部應用低強度超聲可顯著促進損傷處神經(jīng)組織的增生[8]。

4.1.4低強度超聲對大鼠神經(jīng)導管修復神經(jīng)的作用研究顯示，經(jīng)過超聲輻照作用的porous PLGA/Pluronic F127神經(jīng)導管內(nèi)軸突的生長速度(每天0.71 mm)顯著高于未經(jīng)超聲輻照的神經(jīng)導管內(nèi)軸突生長速度(每天0.48 mm)，且治療組的軸突面積、直徑和髓鞘厚度均顯著高于對照組，提示低強度超聲對神經(jīng)導管內(nèi)的軸突再生起到良好的促進作用[13]。

4.2不同強度不同頻率的低強度脈沖超聲對周圍神經(jīng)損傷的修復作用 盡管有很多研究證實低強度脈沖超聲能加速周圍神經(jīng)的修復，但是各家所用的強度與頻率卻并不一致。Mourad等[16]應用強度0.25 W·cm-2，頻率2.25 MHz的低強度脈沖超聲，在術后第3天開始治療大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷，每周3次，共60 s。治療14 d后足部功能試驗證實治療組與對照組坐骨神經(jīng)功能改善狀況有統(tǒng)計學意義。Crisci等[8]應用強度16 mW·cm-2，頻率1.5 MHz的脈沖超聲治療神經(jīng)離斷術后24 h的大鼠，每天20 min，連續(xù)12 d，然后證實大鼠坐骨神經(jīng)功能明顯改善。Chang等[12]分別應用強度0.3 W·cm-2，頻率1.5 MHz以及強度為0.2 W·cm-2，頻率1 MHz的低強度超聲治療離體雪旺細胞及神經(jīng)導管修復的神經(jīng)缺損處，每天5 min，連續(xù)2周后證實雪旺細胞增殖分化增強而坐骨神經(jīng)功能改善。

4.3低強度脈沖超聲促進周圍神經(jīng)損傷修復可能的機制雖然對于低強度脈沖超聲促進周圍神經(jīng)損傷修復的機制目前尚不完全清楚，但是學者們已經(jīng)從細胞學、分子生物學、酶學、離子通道等多個角度對此進行了探索。

Zhang等[14]利用1 MHz，100 mW·cm-2的低強度脈沖超聲照射雪旺細胞，每天5 min，研究結(jié)果顯示低強度脈沖超聲能促進雪旺細胞標記物S-100的增殖分化，而且能通過提高NT-3和BDNF的mRNA的表達來促進雪旺細胞增殖。Tsuang等[15]研究推測：低強度超聲能影響細胞膜Ca2+-ATP酶、H+-ATP酶和其他離子通道的活性，這些對細胞的存活和增殖都非常重要。低強度超聲能增強酶的活性，增加細胞膜的通透性和選擇性，增強細胞膜的流動性，從而加快細胞代謝。但是同時他們也觀察到過長時間或者過大強度的超聲照射卻適得其反，能破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，使很多酶失活，細胞代謝破壞，導致很低的細胞存活率和增殖率。低強度脈沖超聲的這個作用他們實驗損壞較嚴重的組中出現(xiàn)得更早。從而進一步研究得出結(jié)論：低強度脈沖超聲能在24 h內(nèi)上調(diào)IL-6基因的表達而在48 h內(nèi)下調(diào)IL-6的表達，8 h內(nèi)下調(diào)IL-1和TNF-α基因表達并下調(diào)P0，48 h內(nèi)上調(diào)IL-1基因表達。Raso等[4]研究后認為低強度超聲促進神經(jīng)再生可能的機制包括：熱效應能促進血管擴張，增加新生血管的形成，增加局部營養(yǎng)；神經(jīng)發(fā)芽刺激神經(jīng)纖維密度增加；激活雪旺細胞恢復神經(jīng)管；化學因子或調(diào)解因子的釋放能刺激軸突的生成。Kusuyama等[17]通過對多分化潛能的間充質(zhì)干細胞及祖細胞系的研究發(fā)現(xiàn)低強度脈沖超聲能通過抑制PRARγ2通過ROCK-Cot/Tpl2-MEK-ERK通道，從而抑制間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化而促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。Lv等[18]研究證實：低強度脈沖超聲能促進iPSCs源性神經(jīng)嵴干細胞的增殖分化。

4.4低強度脈沖超聲促進周圍神經(jīng)損傷修復的主要研究方式 外周神經(jīng)損傷后的再生包括兩個部分的變化：一部分是損傷側(cè)近端神經(jīng)的生長錐類似結(jié)構(gòu)的形成，另一部分是損傷側(cè)遠端Wallerian變性過程中雪旺細胞增殖誘導作用[19]。目前對于低強度脈沖超聲促進周圍神經(jīng)再生的研究主要包括體外細胞培養(yǎng)和體內(nèi)動物實驗兩大部分。

(1)體外實驗主要是以神經(jīng)膠質(zhì)細胞—雪旺細胞和多分化潛能間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)研究為主，通過細胞生物學技術、分子生物學技術等從形態(tài)上、數(shù)量上及基因表達方式等方面，評估低強度脈沖超聲治療后細胞的增殖分化狀況，并初步探討其作用機制。

(2)體內(nèi)實驗主要以大鼠或新西蘭兔的坐骨神經(jīng)、腓神經(jīng)、動眼神經(jīng)[20]病變模型為主。所應用的動物模型包括：坐骨神經(jīng)擠壓傷模型、周圍神經(jīng)缺損模型、神經(jīng)導管修復缺損周圍神經(jīng)模型等，坐骨神經(jīng)自體神經(jīng)翻轉(zhuǎn)移植模型通常是作為對照組來研究。體內(nèi)實驗中對于神經(jīng)損傷再生的評估方法主要包括：功能評價：即坐骨神經(jīng)指數(shù)和電生理檢測，及形態(tài)學評價：包括骨骼肌橫截面積的評估，有髓鞘軸突的數(shù)目及髓鞘厚度，超微結(jié)構(gòu)的觀察等。而對于靶器官的檢測主要是形態(tài)學檢測，如肌肉濕重比、肌肉纖維橫截面積估算等，并未涉及功能檢測。目前該研究尚未進入臨床試驗階段。

5目前存在的問題

盡管對低強度脈沖超聲在周圍神經(jīng)損傷中的研究比較多比較廣泛，已經(jīng)達到分子生物學水平，其對周圍神經(jīng)損傷后修復和再生的促進作用機制，目前報道的并不是很多，對于該機制的研究才剛剛起步，其具體機制、治療強度頻率周期、臨床應用等問題仍然值得商榷。

尚待解決的問題主要有如下幾個方面：(1)低強度脈沖超聲促進周圍神經(jīng)細胞尤其是雪旺細胞增殖的分子生物學機制需要進一步證實；(2)急需找出低強度脈沖超聲生物學效應的基因激活及表達調(diào)控機制，有待明確基因激活或抑制與蛋白表達產(chǎn)物的關系及細胞信號轉(zhuǎn)導方面的作用機制；(3)有待尋找低強度脈沖超聲治療周圍神經(jīng)損傷修復的最佳刺激時間及強度頻率周期等治療參數(shù)，并早日應用于臨床；(4)需要進一步探索低強度脈沖超聲對自體神經(jīng)翻轉(zhuǎn)移植術后的神經(jīng)是否有促進作用，以利于接軌于臨床輔助治療；(5)需要探索更多更新無創(chuàng)評價靶器官功能恢復狀況的方法。

6展望

作為無創(chuàng)便捷、耐受性好、無不良并發(fā)癥的治療方法，低強度脈沖超聲聯(lián)合組織工程技術、多能分化潛能干細胞技術在周圍神經(jīng)損傷中的治療，以及聯(lián)合超聲微泡造影靶向藥物治療的應用前景值得期待。

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The research progress of low-intensity pulsed ultrasound to promote peripheral nerve repair and regeneration

JIANG Wen-li1,2,TANG Jie1,WANG Yue-xiang1

(1.DepartmentofUltrasound,ChinesePeople'sLiberationArmyGeneralHospital,Beijing100853China；

2.DepartmentofUltrasound,BeijingHospital,Beijing100730,China)

Abstract:Nowadays,peripheral nerve injury is becoming the focus of social attention. Although microsurgery and tissue engineering provide new methods for repair and regeneration of peripheral nerve，their clinic effects are far from ideal. In recent years,different methods have been used to improve peripheral nerve recovery,such as physical stimulus like laser,electricity magnetic field,shock waves and ultrasound. And promising results have been achieved. Mechanical effect was recognized as main effect in the biologic action of low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) while thermal mechanisms were not. Micromechanical stimulation and cavitation mechanisms played an important role. Mechanical strains may result in increasing enzyme activity and modifying cell metabolism. Studies showed that LIPUS could promote the permeability and selectivity of cell membrane and cell wall,enhance mass transfer and increase absorbing of nutritional elements. LIPUS has been proved to have therapeutic effect on a lot of tissue damage. The US Food and Drug Administration approved LIPUS for accelerating fresh fracture healing in 1994 and for the treatment of existing nonunions in 2000 separately. LIPUS could also promote healing in various soft tissues such as cartilage,intervertebral disc,etc. It could improve bone-tendon junction through effect on osseous tissue. The ultrasonic effect on the nervous system was first concerned in the early stage of the ultrasonic biological effect. Many studies have been performed to identify the potential mechanisms. Those studies mainly concentrated on continuous -ultrasound and the mechanisms were argued at thermal or non-thermal effects. Previous studies demonstrated that the therapeutic effect of LIPUS on Schwann cells or damaged rat sciatic nerve and explained the mechanism of LIPUS on peripheral nerve regeneration.As a noninvasive and convenient treatment,although low-intensity ultrasound still has many problems to be researched,its future and broad space for clinical application is confirmed.

Key words:peripheral nerve;regeneration and repair;low-intensity pulsed ultrasound

(收稿日期：2015-10-27，修回日期：2015-12-18)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.002

通信作者：唐杰，男，主任醫(yī)師，博士生導師，研究方向：腹部與小器官疾病的超聲診斷和介入治療，E-mail：txiner@vip.sina.com

基金項目：國家自然科學基金(No 81327003)；國家自然科學青年科學基金(No 81100922)