楊學(xué)云，王　蒴，吳建勇，王登峰，李建軍（新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆　烏魯木齊　830000）

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無(wú)乳鏈球菌Sip基因的克隆與原核表達(dá)

楊學(xué)云，王蒴，吳建勇，王登峰，李建軍
（新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000）

摘要：無(wú)乳鏈球菌表面免疫相關(guān)蛋白（Surface immunogenic proteins,Sip）具有高度保守性，是無(wú)乳鏈球菌疫苗研究的重要靶標(biāo)。通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增Sip基因，將其插入pET-22b載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b-Sip，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、PCR鑒定及測(cè)序;轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，檢測(cè)重組蛋白的大小及反應(yīng)原性。結(jié)果表明，所擴(kuò)增Sip基因大小為1 300bp，與GeneBank參考序列同源性為99.16%；蛋白分析表明，目的蛋白大小為50KDa，具有良好的反應(yīng)原性，為無(wú)乳鏈球菌的免疫預(yù)防提供依據(jù)和基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：無(wú)乳鏈球菌；表面蛋白；Sip基因；克隆與表達(dá)

10.16863/j.cnki.1003-6377.2016.01.009

無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是引起奶牛乳腺炎的主要傳染性病原之一，對(duì)奶牛養(yǎng)殖及牛奶衛(wèi)生安全具有重要的意義[1,2]。根據(jù)其莢膜多糖抗原性的不同，分為10種血清型，分別為Ⅰa,Ⅰb,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ, Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ,Ⅷ，Ⅸ型[3]。但是各個(gè)血清型之間沒(méi)有交叉保護(hù)力[4]，這給無(wú)乳鏈球菌的免疫預(yù)防帶來(lái)困難。篩選出各個(gè)血清型之間都具有保守性的候選抗原是免疫預(yù)防的關(guān)鍵。Sip蛋白是暴露于無(wú)乳鏈球菌表面的一種免疫相關(guān)蛋白，具有高度保守性，廣泛存在于人源和牛源的多個(gè)血清型無(wú)乳鏈球菌株中，并與細(xì)菌的黏附和定植有關(guān),因此是研究新型疫苗的良好的候選靶抗原[5，6，7]。本文通過(guò)基因工程技術(shù)，成功克隆了無(wú)乳鏈球菌Sip基因，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、表達(dá)條件優(yōu)化及蛋白反應(yīng)原性的鑒定，為無(wú)乳鏈球菌的免疫預(yù)防提供依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1　材料和方法

1.1菌株與載體

無(wú)乳鏈球菌KT639株分離自新疆奎屯奶牛場(chǎng)乳腺炎奶樣中；E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；E.coilBL21(DE3)購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；原核表達(dá)載體pET-22b由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑

DNA Marker D、D15000 DNA Marker、2XTaq PCR MasterMix、HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG抗體、大量DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒均購(gòu)自天根生物公司；氨芐青霉素、TMB、IPTG、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白分子量Marker（低）、BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶均購(gòu)自Takara公司；預(yù)染Marker購(gòu)自Fermentas公司；HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG抗體購(gòu)自Earthox公司；丙烯酰胺、雙丙烯酰胺購(gòu)自Pharmacia公司；TEMED購(gòu)自Fluka公司；SDS、考馬斯亮藍(lán)R-250，甘氨酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3引物

根據(jù)GenBank發(fā)表的無(wú)乳鏈球菌Sip基因序列（AF151361.1），設(shè)計(jì)一對(duì)引物，核苷酸序列為：

P1：5'-CCCGGATCCTAAAATGAATAAAAAGGTACTATTG-3'；

P2：5'-CCCAAGCTTTTTGTTAAATGATACGTGAAC-3'；

引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4無(wú)乳鏈球菌基因組DNA的制備

將無(wú)乳鏈球菌分離株KT639接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。次日取菌液1.5 mL，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。

1.5無(wú)乳鏈球菌Sip基因的PCR擴(kuò)增

50μL PCR反應(yīng)體系：PCR Master Mix 25 μL，上下游引物（20 μmoL/L）各0.5 μL，基因組DNA 2 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件：①94℃預(yù)變性5 min，②94℃變性1 min，③59℃退火45 s，④72℃延伸1 min，②～④循環(huán)30次，然后72℃終末延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)[8]。

1.6表達(dá)載體的構(gòu)建

用Amp抗性的LB培養(yǎng)基對(duì)含pET-22b質(zhì)粒的菌種進(jìn)行培養(yǎng)，37℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)（12～16）h，然后取培養(yǎng)液用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。用BamHⅠ和HindⅢ分別對(duì)Sip基因片段和pET-22b質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后用DNA回收試劑盒對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。將Sip基因與pET-22b載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化到E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)重組質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-22b-Sip交由上海生工測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-22b-sip/BL21(DE3)及空載體pET-22b/BL21(DE3)菌液接種于5 mL含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)加入IPTG至菌液終濃度為1.0mmoL/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.8重組菌最佳表達(dá)條件

將重組菌接種于含有氨芐青霉素（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0 mmoL/L，分別誘導(dǎo)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h；加入IPTG至終濃度為1.0 mmoL/L，分別在25℃、30℃、37℃下培養(yǎng)至最佳誘導(dǎo)時(shí)間；分別加入IPTG至終濃度為0.25 mmoL/L、0.5 mmoL/L、0.75 mmoL/L、1.0 mmoL/L、1.25 mmoL/L、1.5 mmoL/L、2.0 mmoL/L、2.5 mmoL/L、3.0 mmoL/L，在最佳誘導(dǎo)溫度下，振蕩培養(yǎng)至最佳誘導(dǎo)時(shí)間。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)的產(chǎn)物進(jìn)行蛋白電泳分析，從而確定重組菌最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件。

1.9表達(dá)蛋白的免疫印跡鑒定

將表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜并進(jìn)行western blotting檢測(cè)，兔抗無(wú)乳鏈球菌免疫血清為一抗，HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG抗體為二抗，用TMB進(jìn)行染色。

2　結(jié)果

2.1無(wú)乳鏈球菌Sip基因擴(kuò)增結(jié)果

以無(wú)乳鏈球菌分離株KT639的DNA為模板，用PCR方法成功擴(kuò)增出1300 bp的目的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

2.2重組質(zhì)粒的鑒定

對(duì)重組質(zhì)粒pET-22b-Sip分別進(jìn)行PCR鑒定和BamHⅠ和HindⅢ的雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的片段大小約為1 300 bp，與目的片段大小相近；經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切得到的兩條特異性片段，其中一條大分子量片段與pET-22b位置相同，約在5 500 bp左右；另一條片段分子量約為1 300 bp，與目的基因Sip大小一致（圖2），表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果表明，測(cè)序所得的1305個(gè)堿基中有11個(gè)堿基發(fā)生變化，核苷酸序列同源性為99.16%；有4個(gè)氨基酸發(fā)生變化，氨基酸序列同源性達(dá)到99.08%。

圖1　無(wú)乳鏈球菌Sip基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2　重組質(zhì)粒pET-22b-Sip的PCR及雙酶切鑒定

2.3重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)SDS蛋白電泳分析，在50 KDa附近出現(xiàn)重組目的蛋白條帶；Sip重組蛋白一部分以可溶形式表達(dá)，一部分以包涵體形式表達(dá)（圖3），經(jīng)Bandcan軟件分析，可溶性蛋白占菌體總蛋白的37.6%。

2.4重組菌最佳表達(dá)條件

2.4.1不同誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化

對(duì)誘導(dǎo)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后的表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)時(shí)間為3 h時(shí)蛋白表達(dá)量最高（圖4），確定誘導(dǎo)最佳時(shí)間為3 h。

圖3　表達(dá)產(chǎn)物的蛋白電泳分析

圖4　不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

2.4.2不同誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

在25℃、30℃、37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)3 h，分別進(jìn)行蛋白電泳分析。結(jié)果顯示，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)，蛋白的表達(dá)量相對(duì)最高（圖5），因此確定最佳誘導(dǎo)溫度為25℃。

2.4.3不同IPTG濃度優(yōu)化

經(jīng)Bandcan軟件檢測(cè)后，IPTG濃度在1.25 mmoL/L時(shí)表達(dá)量相對(duì)較高（圖6），因此將1.25 mmoL/L作為IPTG的最佳濃度。

圖5　不同誘導(dǎo)溫度下蛋白的表達(dá)量

圖6　不同濃度的IPTG對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

2.5重組表達(dá)蛋白的免疫印跡鑒定

對(duì)Sip重組表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，約在50KDa處出現(xiàn)一條明顯的條帶（圖7），重組表達(dá)的Sip蛋白可與無(wú)乳鏈球菌免疫血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明Sip蛋白具有較好的反應(yīng)原性。

3　討　論

圖7　重組蛋白的免疫印跡分析

目前研究證實(shí)，包括無(wú)乳鏈球菌在內(nèi)的鏈球菌屬全菌體滅活苗對(duì)奶牛的保護(hù)力較弱，而研究較多的莢膜多糖疫苗、結(jié)合疫苗也缺乏廣泛保護(hù)力，免疫保護(hù)效果都不理想[9,10]。這可能由于（1）該菌缺乏抗原生態(tài)學(xué)特異性；（2）滅活后抗原活性降低或消失；（3）無(wú)乳鏈球菌本身抗原結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，已確定的10種血清型之間缺乏交叉保護(hù)力。通常情況下，無(wú)乳鏈球菌的毒力因子和抗原因子在同一個(gè)靶標(biāo)組分上，而靶標(biāo)蛋白只有在細(xì)菌細(xì)胞保持完整活狀態(tài)下才能發(fā)揮其毒力作用，而其抗原性在亞單位狀態(tài)下仍會(huì)存在。因此，將亞單位有效靶標(biāo)蛋白作為重點(diǎn)研究對(duì)象，已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

Sip基因存在于無(wú)乳鏈球菌的多個(gè)血清型中，且具有高度保守性和良好的免疫原性[11]。已有研究者對(duì)無(wú)乳鏈球菌sip全基因組進(jìn)行克隆并測(cè)定其核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，sip基因由1305個(gè)核苷酸組成，是一個(gè)開(kāi)放的閱讀框，編碼434個(gè)氨基酸，分子量為45.5KDa，存在1個(gè)由25個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。本研究依據(jù)GenBank中已發(fā)表的sip基因序列（AF151361.1）及表達(dá)載體pET-22b的多克隆位點(diǎn)，在sip片段的上下游設(shè)計(jì)引物，于P1引物上游添加BamHⅠ酶切位點(diǎn)，P2引物上游添加HindⅢ酶切位點(diǎn)，并在每個(gè)酶切位點(diǎn)前添加三個(gè)保護(hù)性堿基以增強(qiáng)其特異性。本研究克隆的無(wú)乳鏈球菌分離株KT369的Sip基因與GenBank公布的Sip基因（AF151361.1）比對(duì)顯示，核苷酸及氨基酸同源性均在99%以上，與Brodeur報(bào)道[5]的無(wú)乳鏈球菌不同分離株間核苷酸同源性在98%以上相一致，說(shuō)明無(wú)乳鏈球菌新疆分離株sip基因與GenBank登錄的sip基因序列差異極小，具有共同的進(jìn)化來(lái)源。

由于pET-22b是高效表達(dá)載體，表達(dá)的重組蛋白通常以包涵體形式存在，而包涵體不具有天然構(gòu)象，沒(méi)有生物活性，并且需要變性、復(fù)性等處理，操作復(fù)雜并且耗時(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)重組蛋白進(jìn)行可溶性分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的sip重組蛋白一部分以可溶性形式存在，為了提高可溶性蛋白的表達(dá)水平，對(duì)誘導(dǎo)溫度、時(shí)間及IPTG濃度進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，最終獲得了較高表達(dá)的可溶性蛋白。通過(guò)對(duì)重組表達(dá)的蛋白進(jìn)行了Western blotting鑒定分析，結(jié)果表明Sip蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為進(jìn)一步開(kāi)展基因工程亞單位疫苗的研制提供了數(shù)據(jù)支持和依據(jù)。

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Cloning and Prokaryotic Expression of Streptococcus Agalactiae Sip Gene

YANG Xue-yun,WANG Shuo，WU Jian-yong,WANG Deng-feng,LIJian-jun
(Institute of Veterinary Medicine,Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi830000,China)

Abstract:Streptococcus Agalactiae surface immunogenic protein (Sip)is a highly conservative important target for the study of Streptococcus Agalactiae vaccine.The Sip gene was amplified by PCR and be inserted into vector pET-22b from a recombinant vector pET-22b-Sip.After identified by PCR,restriction enzyme digestion and sequencing methods,the recombinant plasmid was transformed into BL21 (DE3)and induced to express by IPTG.The size and reactionogenicity of recombinant protein was detected.The results showed that the sip gene was 1300bp and was 99.16% in homology with reference sequence of GeneBank. The recombinant protein was found to be about 50KDa as expected and showed good reactionogenicity.This research provided the basis and foundation for the immunization against Streptococcus Agalactiae.

Key words:streptococcus agalactiae;surface protein;sip gene;cloning and expression

收稿日期：2015-12-15修回日期：2015-12-24

作者簡(jiǎn)介：楊學(xué)云（1978-），男，副研究員，從事牛羊疫病防治研究。E-mail:yangxyxj@163.com

基金項(xiàng)目：新疆自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013211B29）

中圖分類號(hào)：S917

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-6377（2016）01-0036-06