詹長(zhǎng)生，夏小雨

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基于CRISPR-Cas9技術(shù)的基因治療研究進(jìn)展

詹長(zhǎng)生，夏小雨

上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，上海 200025

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌在與噬菌體抗?fàn)幍倪M(jìn)化過程中產(chǎn)生的一種抵御外源DNA入侵的機(jī)制，能有效識(shí)別并剪切外源DNA?；谄渥R(shí)別切除外源DNA的原理，CRISPR-Cas9系統(tǒng)被開發(fā)成為新一代基因編輯工具。與ES打靶、ZFN、TALEN等技術(shù)途徑相比，CRISPR-Cas9系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便、效率高、成本低，有著極其廣闊的應(yīng)用前景。本文整理了近年內(nèi)有關(guān)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的最新文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)該系統(tǒng)工作原理以及針對(duì)基因治療的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

CRISPR-Cas9技術(shù)，基因編輯，疾病模型，基因治療，個(gè)性化醫(yī)療

經(jīng)典的基因打靶技術(shù)是基于DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源基因片段替代靶基因片 段[1]，但是這種打靶技術(shù)在體細(xì)胞中的成功率極低[2]。之后發(fā)展出的ZFN (Zinc finger nucleases)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases) 等技術(shù)，是基于DNA雙鏈斷裂 (Double strand broken, DSB) 修復(fù)的非同源末端連接機(jī)制 (Non homologous end-joining，NHEJ)，通過蛋白-DNA相互作用識(shí)別特定DNA序列，在修復(fù)過程中引入外源DNA從而引起移碼突變[3]，但是此類技術(shù)的局限性在于構(gòu)建融合蛋白的工作量大、成本高[4]。2013年，、、等雜志幾乎同時(shí)報(bào)道了一種新型的基因組編輯手段—CRISPR-Cas9技術(shù) (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats—CRISPR associated system)。與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)相比，該系統(tǒng)具有良好的靶向性、構(gòu)建簡(jiǎn)單、可同時(shí)操作多條基因等優(yōu)點(diǎn)。自該技術(shù)問世以后，迅速成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)，并引發(fā)新一輪的基因治療研究熱潮。本文整理了最新文獻(xiàn)報(bào)道，從CRISPR-Cas9的技術(shù)原理與研究進(jìn)展、用于基因治療的可行性等多個(gè)方面進(jìn)行 綜述。

1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)工作原理

1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)基本原理

在很多細(xì)菌中，CRISPR系統(tǒng)作為獲得性免疫系統(tǒng)對(duì)抗外源病毒或質(zhì)粒DNA的入侵[5-6]，其序列由CRISPR序列和CRISPR相關(guān)蛋白 (CRISPR-associated system，Cas) 的編碼基因組成[7]。其中，Cas基因在CRISPR序列的上游，表達(dá)產(chǎn)物為核酸酶、聚合酶、解旋酶等[5]。CRISPR序列由前導(dǎo)區(qū) (Leader)、重復(fù)序列區(qū) (Repeat) 和間區(qū) (Spacer) 組成[6]。前導(dǎo)區(qū)被認(rèn)為是CRISPR序列的啟動(dòng)子；重復(fù)序列區(qū)是由21–48 bp的高度保守的重復(fù)序列組成，相鄰重復(fù)序列之間由間區(qū)分隔開；間區(qū)長(zhǎng)度26–72 bp，可能是來自進(jìn)化過程中所俘獲的外源入侵DNA片段[6,8]。CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄加工產(chǎn)物稱為crRNA，它與另一種非編碼的反式激活CRISPR RNA (Trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA) 通過堿基配對(duì)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步與Cas蛋白結(jié)合形成靶向切割復(fù)合體，對(duì)外源DNA進(jìn)行特異性識(shí)別和切割[9]。需要指出的是，在間區(qū)形成過程中，對(duì)外源DNA片段的捕獲并非隨機(jī)進(jìn)行，在被捕獲序列的下游常有一段序列保守的特殊結(jié)構(gòu)，被稱為“前間區(qū)鄰近基序” (Proto-spacer adjacent motifs，PAM)。PAM位點(diǎn)的存在可能是CRISPR系統(tǒng)區(qū)分自身DNA與外源DNA、避免發(fā)生自身免疫的機(jī)制之一[10]。而對(duì)于CRISPR-Cas復(fù)合體來說，PAM位于與crRNA互補(bǔ)識(shí)別的靶基因片段的上游。有研究指出，CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的切割功能并不受DNA位點(diǎn)甲基化的影響[11]。

目前，從化膿性鏈球菌中發(fā)展出來的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛，因?yàn)槠湎到y(tǒng)組分最為簡(jiǎn)單，切割DNA雙鏈僅需Cas9這一種蛋白。CRISPR-Cas9系統(tǒng)的一大改進(jìn)是，將crRNA：tracrRNA所組成的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)改造成為發(fā)夾樣的單鏈導(dǎo)向RNA (Single-guide RNA，sgRNA/gRNA)。其中，gRNA5′端的前20個(gè)核苷酸相當(dāng)于crRNA序列，可以與靶基因片段互補(bǔ)結(jié)合，gRNA同樣能夠指導(dǎo)Cas9蛋白特異切割雙鏈DNA，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的操作環(huán)節(jié)[12]。在Cas9蛋白切割所造成的DSB修復(fù)的過程中，即可以引入新的基因突變[13]。更重要的是，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)多條基因進(jìn)行操作[14]。目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)已成功應(yīng)用于包括靈長(zhǎng)類在內(nèi)的許多物種，例如細(xì)菌、酵母、煙草、擬南芥、高粱、水稻、線蟲、果蠅、斑馬魚、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、家兔、豬、食蟹猴等，以及包括腫瘤細(xì)胞系和多能干細(xì)胞系在內(nèi)的各種人類細(xì)胞[15]。

1.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)研究進(jìn)展

CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用的最大瓶頸在于其脫靶 (off-target) 效應(yīng)，影響脫靶效應(yīng)的主要因素有PAM的堿基組成[16]、gRNA的長(zhǎng)度[17]、細(xì)胞類型[18]等。針對(duì)脫靶效應(yīng)，許多研究組提出了各自的改進(jìn)方案。例如，Cho等在設(shè)計(jì)的gRNA的5′端額外增加兩個(gè)鳥嘌呤核苷酸，可以顯著提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的特異性[19]。Ran 等所建立的雙切口策略 (Double-nicking strategy) 從改造Cas9蛋白入手，所得到的突變性Cas9n只能切割DNA單鏈，只有在一對(duì)尾端配對(duì)的gRNA的指導(dǎo)下，才會(huì)將靶位點(diǎn)切割為DNA雙鏈斷裂，而其余脫靶位點(diǎn)處只能造成單鏈缺口，無法形成DSB引入突變[20]。Tsai等和Guilinger等所開發(fā)的fCas9系統(tǒng) (FokⅠ-dCas9) 將Cas9改造失去催化活性，然后將改造后的dCas9與FokⅠ核酸酶形成融合蛋白 (FokⅠ- dCas9)， FokⅠ核酸酶以二聚體形式發(fā)揮酶切作用，只有在一對(duì)gRNA的指引下，兩個(gè)FokⅠ- dCas9融合蛋白單體彼此靠近形成二聚體時(shí)才會(huì)發(fā)生DNA雙鏈斷裂[21-22]。

還有一些研究組致力于提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的效率，或者開發(fā)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的其它用途。目前，對(duì)人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因 (Telomerase reverse transcriptase，TERT) 的編輯效率很低，Xi等開發(fā)了一種“pop-in/pop out”兩步法CRISPR-Cas9技術(shù)，可以單堿基為單位精確的編輯基因位點(diǎn)，此項(xiàng)研究提供了一種將CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于低靶向效率的基因位點(diǎn)的新方法[23]。Arbab等發(fā)展出一種新技術(shù)——自我克隆性CRISPR-Cas9系統(tǒng) (Self-cloning CRISPR-Cas9，scCRISPR)，利用scCRISPR技術(shù)，可以在短短幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成對(duì)基因組靶位點(diǎn)的突變編輯或轉(zhuǎn)基因敲入，scCRISPR系統(tǒng)的突變效率高達(dá)88%，而費(fèi)用降低至原來的1/6，大大拓展了CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用前景[24]。Kleinstiver等基于生物信息學(xué)設(shè)計(jì)改造編碼Cas9蛋白的基因，從而巧妙調(diào)控其對(duì)PAM序列的識(shí)別，使CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以應(yīng)用于更多的物種甚至特定細(xì)胞類型，并進(jìn)一步降低脫靶效應(yīng)[25]。Friedland等鑒定、開發(fā)了金黃色葡萄球菌中的Cas9蛋白，與源自鏈球菌的Cas9蛋白不同，Cas9蛋白可以識(shí)別額外的PAM序列，并且因其編碼序列簡(jiǎn)短，可與多條gRNA一同包裝在單個(gè)腺病毒相關(guān)病毒 (Adeno-associated virus，AAV) 載體中，簡(jiǎn)化了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的操作[26]。最近，Richardson等深入研究了Cas9蛋白與DNA靶片段之間的相互作用，他們發(fā)現(xiàn)，切割完成后，Cas9蛋白大約經(jīng)過6 h方從DNA靶片段上解離，而這一漸進(jìn)過程首先會(huì)釋放出切口處的3′末端，因此，他們針對(duì)這一現(xiàn)象開發(fā)了可以進(jìn)行同源重組修復(fù) (Homology-directed repair，HDR) 的工具系統(tǒng)；此外，甚至在切割并未發(fā)生的情況下，Cas9蛋白的結(jié)合也可以引發(fā)特定位點(diǎn)的同源重組修復(fù)，這一有趣的發(fā)現(xiàn)拓展了我們對(duì)基因組行為的認(rèn)識(shí)[27]。

除了基因組編輯，CRISPR-Cas9系統(tǒng)還可以用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄。其大致原理是，構(gòu)建核酸酶活性缺陷的Cas9基因 (dCas9)，再將其與一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制或者轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白可以在gRNA的引導(dǎo)下特異性識(shí)別和結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并招募相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制或激活靶基因的表達(dá)，這種技術(shù)手段稱為CRISPRi (CRISPR interference)[28-29]，或者CRISPR-ON系統(tǒng)[30]，同樣可以同時(shí)操作一條以上的基因。一方面，這一操作并不涉及基因序列的改變；另一方面，與RNAi技術(shù)相比，CRISPR系統(tǒng)作用于轉(zhuǎn)錄階段，因此調(diào)控基因表達(dá)的效率更高。

2 CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于基因治療的研究思路

CRISPR-Cas9提供了一種簡(jiǎn)便、高效、多樣化的基因組編輯方式，在基因功能研究、動(dòng)植物育種等方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。而其中最具有吸引力的，當(dāng)屬對(duì)人類疾病基因治療的研究，包括高通量篩選致病基因、致病基因功能研究、構(gòu)建疾病的細(xì)胞/動(dòng)物模型、基因治療遺傳性疾病與病毒感染性疾病等。在下文中，我們將對(duì)CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于基因治療的研究思路進(jìn)行歸納。

2.1 CRISPR-Cas9技術(shù)在治療遺傳性疾病方面的應(yīng)用

目前，已有CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于地中海貧血[31-32]、鐮狀細(xì)胞性貧血[33]、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不 良[34-35]、基因突變引發(fā)的白內(nèi)障[36-37]、囊性纖維化[38]、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥[39]、遺傳酪氨酸血癥Ⅰ型[40]等遺傳性疾病的研究報(bào)道。在動(dòng)物水平的研究中，研究者們可以通過CRISPR-Cas9技術(shù)編輯合子或早期胚胎中的基因組，構(gòu)建基因修飾的新個(gè)體[36]；或者改造生殖干細(xì)胞中的基因組，從而穩(wěn)定遺傳至子代[34,37]。然而，上述策略如果應(yīng)用于人類，勢(shì)必會(huì)引發(fā)倫理爭(zhēng)議。CRISPR-Cas9技術(shù)未來的臨床應(yīng)用，更有可能是與人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù) (Human induced pluripotent stem cell，hiPSC) 相結(jié)合[31-32,35]，采用基于患者定制的個(gè)性化治療方案。

目前，人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建系技術(shù)已相當(dāng)成熟，制約其應(yīng)用的主要因素在于定向誘導(dǎo)分化步驟。其中，向造血系細(xì)胞分化的研究最為深入，技術(shù)平臺(tái)相對(duì)穩(wěn)定。因此，以hiPSC為材料，CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于遺傳性疾病的研究也是從血液類疾病開始的。Song等報(bào)道了通過CRISPR-Cas9技術(shù)治療β-地中海貧血 (Beta-thalassemia，β-Thal)，首先將患者來源的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)分化為誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞 (β-Thal-iPSCs)，再用CRISPR-Cas9技術(shù)修復(fù)血紅蛋白β-球蛋白 (Hemoglobin beta，HBB) 基因。結(jié)果顯示，基因修正后的細(xì)胞核型正常，在向造血細(xì)胞分化的過程中，可以高比例的生成各類造血祖細(xì)胞，并表達(dá)正常的β-球蛋白[31]。而在另一項(xiàng)研究中，Huang等用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)鐮狀細(xì)胞性貧血 (Sickle-cell anemia) 患者的iPSCs細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，基因修正后的iPSCs可以成功地分化至網(wǎng)織紅細(xì)胞階段，并表達(dá)正常的β-球蛋白[33]。

而對(duì)于血液系統(tǒng)之外的其他器官系統(tǒng)，在受累于基因突變所引發(fā)的疾病時(shí)，可以將CRISRP-Cas9技術(shù)應(yīng)用于改造成體組織干細(xì)胞、或者具有增殖活性的細(xì)胞，從而達(dá)到功能上的部分或全部的修復(fù)，這是基因治療的另一種可行途徑。例如，杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良綜合征 (Duchenne muscular dystrophy，DMD) 源于基因的突變，突變使肌細(xì)胞中的抗肌萎縮蛋白 (Dystrophin) 表達(dá)缺失。目前已有多項(xiàng)研究報(bào)道將CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于DMD的治療。例如，在Ousterout等的研究中，他們通過CRISPR-Cas9技術(shù)成功地糾正了DMD患者成肌細(xì)胞 (Myoblast) 中的基因突變，基因編輯后的成肌細(xì)胞可以在體外及體內(nèi)條件下表達(dá)正常的抗肌萎縮蛋白[41]。

更進(jìn)一步的，Long等利用腺病毒相關(guān)病毒 (AAV9) 在新生DMD小鼠模型的心肌或骨骼肌細(xì)胞中特異性表達(dá)CRISRP-Cas9系統(tǒng)組分，從而成功阻斷了DMD的進(jìn)展[42]。這項(xiàng)研究成果證明，如果側(cè)重于功能重建而非基因糾正， CRISRP-Cas9系統(tǒng)同樣可以應(yīng)用于特定的分化終末的體細(xì)胞類型，從而大大拓展了該系統(tǒng)的臨床應(yīng)用前景?；蛟S在不久的將來，CRISPR-Cas9技術(shù)就能用于重建DMD病人的肌肉功能，改善很大一部分病人的生存狀況。

2.2 CRISPR-Cas9技術(shù)在癌癥研究方面的應(yīng)用

對(duì)于致病基因已知 (或部分已知) 的癌癥，可以運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的基因突變的細(xì)胞或動(dòng)物水平模型，以便進(jìn)行癌癥進(jìn)展機(jī)制、治療手段及效果方面的研究[43-44]。例如，在一項(xiàng)對(duì)肺腺癌的研究中，Platt等采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)分別構(gòu)建了、、基因突變的小鼠模型，模型鼠發(fā)展出了肉眼可見的肺腺癌病理表征[45]。這項(xiàng)研究支持了、、基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

而對(duì)于致病機(jī)制尚不清楚的癌癥類型，則可以通過CRISPR-Cas9技術(shù)研究特定基因在疾病進(jìn)程中的作用，明確新的原癌基因或抑癌基因。例如，骨肉瘤是骨骼系統(tǒng)最惡性也最常見的腫瘤之一，目前，對(duì)于轉(zhuǎn)移性骨肉瘤和復(fù)發(fā)性骨肉瘤缺乏理想的治療手段。有研究認(rèn)為，基因產(chǎn)物對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞的生存是必需的。因此，F(xiàn)eng等利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系KHOS和U-2OS中的基因進(jìn)行了有效地沉默。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因沉默的骨肉瘤細(xì)胞生存和增殖能力都顯著減弱，遷移性和侵襲性均顯著降低[46]。類似的，Kawamura等通過CRISPR-Cas9技術(shù)突變了前列腺癌細(xì)胞系DU145中的和基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變后的細(xì)胞系成瘤性大大降低，表明/基因在前列腺癌發(fā)生中具有重要作用[47]。上述兩項(xiàng)研究也為骨肉瘤及前列腺癌治療提供了新的分子靶標(biāo)。

2.3 CRISPR-Cas9技術(shù)在治療病毒感染性疾病方面的應(yīng)用

對(duì)于病毒感染性疾病，其基因治療大致可分為兩種思路：或者改造病毒宿主細(xì)胞使其免于感染；或者靶向病毒使其不能完成復(fù)制和傳播。以HIV病毒所致AIDS的研究為例，HIV感染CD34+的淋巴細(xì)胞需要通過表面受體CCR5 (Chemokine (C-C motif) receptor 5) 或CXCR4 (Chemokine (C-X-C motif) receptor 4) 的介導(dǎo)。因此，可以將HIV感染者的骨髓干細(xì)胞分離出來，通過CRISPR-Cas9技術(shù)在體外將骨髓干細(xì)胞的或受體基因失活，再將受體基因失活后的骨髓干細(xì)胞回輸給該患者，重建其免疫功能[48]。例如，有研究顯示，基因發(fā)生32 bp的刪除 (△32) 可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)HIV-1感染的抗性。Ye等用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)正常hiPSCs進(jìn)行了△32突變，結(jié)果顯示，33%的細(xì)胞發(fā)生了雙等位基因的定向突變，在將突變后的hiPSCs誘導(dǎo)分化為單核/巨噬細(xì)胞后，這些細(xì)胞顯示出對(duì)HIV感染的抗性[49]。這項(xiàng)研究提供了一種可行的抗HIV-1感染的基因治療方案。

在靶向病毒DNA、使其失去原致病力的思路下，Hu等利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建靶向HIV-1的區(qū)的gRNA，該gRNA可以引導(dǎo)Cas9核酸酶識(shí)別并切除已經(jīng)整合到HIV-1感染者基因組中的病毒前基因組DNA，從而成功地抑制了HIV-1病毒在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、幼單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中的擴(kuò)增[50]。

同樣的，對(duì)EB病毒、人類乳頭瘤病毒 (HPV) 等病毒感染所致疾病的基因治療也不斷取得新進(jìn)展。例如，EB病毒感染可致伯奇氏淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma)，Wang等用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)伯奇氏淋巴瘤細(xì)胞株中的EB病毒基因組進(jìn)行靶向編輯，可使細(xì)胞增殖阻滯、病毒載量大大降低[51]。HPV與宮頸癌的相關(guān)性早已成為共識(shí)，Zhen等用CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向高致癌性的HPV-16病毒的E6/E7啟動(dòng)子區(qū)，顯著抑制了HPV-16陽性的宮頸癌SiHa細(xì)胞系的增殖與成瘤能力[52]。在針對(duì)病毒設(shè)計(jì)基因編輯的靶標(biāo)時(shí)，應(yīng)選取與人類基因組同源性低的片段，從而減少脫靶突變的機(jī)率。

采取類似思路，已有多個(gè)研究組在乙型肝炎病毒 (HBV) 感染的細(xì)胞系中靶向切割HBV的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)，成功地抑制了HBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[53]。鑒于目前中國(guó)仍有大量的乙肝病毒攜帶者，乙肝的傳播流行仍舊是中國(guó)公共衛(wèi)生管理中的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展給以乙肝為代表的病毒感染性疾病的治療帶來了新的機(jī)遇。

2.4 CRISPR-Cas9技術(shù)的其他應(yīng)用

PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) 是一種肝臟細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)，作為低密度脂蛋白受體 (Low density lipoprotein receptor，LDLR) 拮抗物，其過表達(dá)可引起高膽固醇血癥，并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于PCSK9蛋白功能性突變的個(gè)體，其血液中低密度脂蛋白水平比正常人群低30%–80%，成為此類個(gè)體免患心血管疾病的保護(hù)性因素。受此啟發(fā)，Ding等用CRISPR-Cas9系統(tǒng)定向突變小鼠肝臟細(xì)胞中的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變小鼠血漿中的膽固醇水平降低了35%–40%[54]。這項(xiàng)研究結(jié)果提示，CRISPR-Cas9技術(shù)不僅可以應(yīng)用于疾病的治療，還可以應(yīng)用于“治未病”，即疾病的預(yù)防。

3 CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用前景

CRISPR-Cas9技術(shù)在基因編輯方面有著巨大的潛力。但是，在其用于臨床之前，必須確保CRISPR-Cas9作用的位點(diǎn)特異性和高效性，因此需要慎重的選擇靶標(biāo)位點(diǎn)、并在全基因組中搜索可能的脫靶位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上對(duì)gRNA進(jìn)行精妙設(shè)計(jì)。

此外，對(duì)人類胚胎基因組的編輯引發(fā)了廣泛的倫理討論[55-56]，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 (NIH) 重申了其關(guān)于涉及人類胚胎基因編輯研究的禁令。因此，怎樣回避胚胎或生殖細(xì)胞操作，而將CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功高效地運(yùn)用于在體條件下的各種體細(xì)胞類型，將是這一領(lǐng)域的集中發(fā)展方向。

CRISPR-Cas9技術(shù)無疑是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的里程碑事件，正經(jīng)歷著日新月異的飛速發(fā)展。相信隨著此技術(shù)自身的不斷完善、以及相關(guān)法律法規(guī)的制定實(shí)施，CRISPR-Cas9技術(shù)必將在物種基因改造與人類疾病基因治療中發(fā)揮巨大作用。

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Research progress of CRISPR-Cas9 system for gene therapy

Changsheng Zhan, and Xiaoyu Xia

,,200025,

The clustered regulatory interspaced short palindromic repeat-Cas9 (CRISPR-Cas9) system is the part of the prokaryotic immune system, which could recognize and delete the exogenous sequences originated from virus or plasmid. Based on its mechanism, CRISPR-Cas9 system was developed into the new generation of gene editing tool. Compared to the existed technologies such as ES targeting, ZFN or TALEN, CRISPR-Cas9 system is a more efficient, economical and promising approach to manipulate the genome. In this review, we summarize the research progress about CRISPR-Cas9 technology, especially the latest applications in gene therapy studies of human diseases.

CRISPR-Cas9 technology, gene editing, disease model, gene therapy, personalized medicine

December 22, 2015; Accepted: March 3, 2016

詹長(zhǎng)生, 夏小雨. 基于CRISPR-Cas9技術(shù)的基因治療研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(7): 861–869.

Zhan CS, Xia XY. Research progress of CRISRP-Cas9 system for gene therapy. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 861–869.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81501308)，Shanghai Municipal Bureau of Health (No. 20134Y169).

Corresponding author: Xiaoyu Xia. Tel: +86-21-63846590-776692; E-mail: zpxiaxy@shsmu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81501308)，上海市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目 (No. 20134Y169) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-14 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160414.1436.001.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)