陳芳霞，陳鵬

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熱敏型核酸酶在畢赤酵母中的分泌表達及催化特性

陳芳霞，陳鵬

西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

核酸酶在生物工程領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值。本研究在優(yōu)化北極蝦核酸酶 (Shrimp nuclease，SNU) 基因序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建SNU的畢赤酵母分泌表達載體SNU-pPICZα A并轉(zhuǎn)化酵母，以高拷貝整合轉(zhuǎn)化子為基礎(chǔ)，優(yōu)化酶表達的條件，并對該酶的催化特性進行分析，結(jié)果顯示SNU可在畢赤酵母SMD1168H中高效分泌表達，最佳誘導(dǎo)表達條件為：培養(yǎng)基BMMY pH 6.0，甲醇濃度為1%，誘導(dǎo)時間為72 h，誘導(dǎo)后粗酶液比活力為1.4×105U/mL。經(jīng)過DEAE Sephadex陰離子交換層析可純化獲得高純度的目標蛋白，每升菌液可純化15 mg目標蛋白，比活力達到6.291×106U/mg，該酶表觀分子量為50 kDa，PNGaseF酶切證實該酶存在糖基化現(xiàn)象。二價金屬離子Ca2+、Mn2+、Co2+、Mg2+及還原劑DTT、β-ME能顯著地提高其水解活性，但Zn2+、Cu2+、SDS、高濃度NaCl抑制該酶的活性，SNU為Ca2+/Mg2+依賴型核酸酶。70 ℃處理10 min可使該酶不可逆的失活。

北極蝦Ca2+/Mg2+依賴型核酸酶，畢赤酵母，分泌表達優(yōu)化，催化特性

重組蛋白技術(shù)的成熟與發(fā)展為生物醫(yī)藥和生物學(xué)研究提供了非常高效的手段，但在蛋白生產(chǎn)過程中仍存在諸多技術(shù)性難題。在重組蛋白純化過程中菌體裂解釋放核酸產(chǎn)生高粘度的裂解液，影響下游的操作和層析純化。蛋白粗提液過量的核酸將導(dǎo)致純化產(chǎn)品的核酸污染，因此在蛋白純化上游步驟除去核酸意義重大。酶法除去核酸是現(xiàn)今蛋白質(zhì)粗提液處理最主要的途徑。商業(yè)化產(chǎn)品DNase I是最為常用的去除核酸的酶制劑[1]，但存在催化活力低、價格昂貴等缺點，來源于靈桿菌商品化核酸酶Benzonase endonuclease (Merck) 由于具有高的催化效率，使之成為生物化學(xué)和藥物制劑領(lǐng)域重要的核酸污染控制用酶[2-4]。但Benzonase酶穩(wěn)定性極高、滅活難，在后續(xù)蛋白純化過程中，需要采用較為復(fù)雜的色譜技術(shù)去除微量的核酸酶，使目標蛋白損失以及分離純化的成本明顯增加。因此篩選高活性且易熱失活的熱敏核酸酶對于蛋白純化工藝的優(yōu)化有重要的價值，特別是對生物學(xué)領(lǐng)域眾多嗜熱蛋白純化過程中，當(dāng)熱敏核酸酶除去核酸后，可以利用嗜熱蛋白的熱穩(wěn)定性，通過加熱失活的方式高效除去反應(yīng)后的核酸酶。另外核酸酶是生產(chǎn)食品添加劑和醫(yī)藥行業(yè)中重要原料——單核苷酸的重要酶制劑[5]，因此研究開發(fā)新的核酸酶，對于核苷酸生產(chǎn)工藝的改造有重要的實踐價值。

北極蝦胰臟中純化的核酸酶 (Shrimp nuclease，SNU) 是少有報道的一種熱敏核酸酶，其在65 ℃的活力半衰期為1 min，且熱失活表現(xiàn)為不可逆[6]，已有的研究都是從北極蝦胰臟中直接提取該核酸酶，關(guān)于北極蝦核酸酶的重組表達至今未有文獻報道。與之同源的熱敏型蟹核酸酶DSN及其突變體DSN-TL成功在宿主BL21 (DE3) 中重組表達[7-8]，其他一些非特異性核酸酶 (DNase Ι[9])，靈桿菌核酸酶[10-11]，NucA[12])也都已經(jīng)實現(xiàn)了在大腸桿菌周質(zhì)或培養(yǎng)基中的分泌表達，雖然利用原核表達系統(tǒng)胞內(nèi)高效表達核酸酶有零星的文獻報道，但是這些核酸酶的重組中往往存在對宿主細胞的高毒性，表現(xiàn)出宿主很難生長或者以無活性的包涵體形式表達等問題，加之多數(shù)核酸酶存在糖基化現(xiàn)象[13]，使利用原核系統(tǒng)表達核酸酶存在較大的技術(shù)障礙。畢赤酵母具有原核生物無法比擬的優(yōu)點，非常適合于對宿主高毒性核酸酶的重組表達。本研究利用重疊PCR優(yōu)化北極蝦核酸酶基因并構(gòu)建畢赤酵母分泌表達載體，在篩選高拷貝轉(zhuǎn)化菌的基礎(chǔ)上，構(gòu)建北極蝦核酸酶的重組表達體系，并對重組表達酶的催化特性進行分析，以期為該酶的分子改造及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌菌株TOP10、畢赤酵母SMD1168H和畢赤酵母表達載體pPICZα A均由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶與主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、蛋白Marker均購自Fermentas公司。IProof DNA聚合酶為Bio-Rad公司產(chǎn)品，pEasy Blunt Zero克隆載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PNGaseF、DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司。其他常用生化及分子生物學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。DEAE sephadex A-50為GE公司產(chǎn)品。引物合成及測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 核酸酶密碼子的優(yōu)化

參考GenBank報道的北極冷水蝦核酸酶蛋白質(zhì)序列 (GenBank Accession No. CBG22733)，去除N端的23個氨基酸殘基的信號肽序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，參考Sharp等[14]的方法對成熟蛋白的381個氨基酸殘基編碼的cDNA進行密碼子優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化序列合成32條引物用于優(yōu)化基因的拼接合成，其中N端和C端對應(yīng)的引物分別添加Ⅰ和Ⅰ的限制性內(nèi)切酶酶切位點。利用PCR拼接合成的基因序列克隆到pEasy Blunt Zero載體上，送北京奧科生物技術(shù)公司進行測序分析。

1.2.2 分泌表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：

分別參考Sambrook[15]的方法和Easy SelectTMExpression Kit的說明。

1.2.3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子鑒定及表達分析

轉(zhuǎn)化子鑒定：挑單克隆于20 μL 20 mmol/L NaOH溶液中，煮沸10 min，10 000 r/min離心2 min，取1 μL上清作為模板，用AOX PCR擴增確定目的基因是否整合到酵母中。

高Zeocin抗性菌株SNU插入拷貝數(shù)測定：參考李凱等[16]的方法進行，目的基因SNU和內(nèi)參基因GAPDH引物設(shè)計見表1。

表1 本研究所用引物

Table 1 Primers used in this study

Underlined letters indicateⅠⅠdigestion sites.

表達分析：挑取數(shù)個單菌落接種于5 mL BMGY培養(yǎng)基中，250 r/min、30 ℃培養(yǎng)過夜直到600為2–6。經(jīng)BMGY培養(yǎng)的5 mL菌液5 000 r/min離心10 min，用BMGY培養(yǎng)基重懸菌體于50 mL BMMY培養(yǎng)基中，250 r/min、30 ℃培養(yǎng)，每24 h補加甲醇一次至終濃度為1%，并于24、42、78、96 h分別取樣1 mL，離心，取上清，加終濃度至10%的三氯乙酸沉淀蛋白，沉淀用預(yù)冷80%丙酮洗滌2–3次，SDS-PAGE分析目標蛋白的表達水平。篩選獲得的目標蛋白表達量高的克隆用于后續(xù)的研究。

1.2.4 表達條件的優(yōu)化

選擇表達量最高的克隆，參考1.2.3的步驟，分別在不同誘導(dǎo)時間 (24、48、72、96 h)，不同甲醇誘導(dǎo)濃度 (體積分數(shù)為1%，0.5%) 下進行表達條件的優(yōu)化。

1.2.5 表達蛋白的純化

經(jīng)最優(yōu)培養(yǎng)條件誘導(dǎo)獲得的畢赤酵母培養(yǎng)液離心后，上清經(jīng)溶液A (10 mmol/L Tris-HCI，pH 7.0，50 mmol/L NaCl) 4 ℃透析過夜后上樣于預(yù)先平衡的DEAE Sephadex A-50離子交換柱上，然后用溶液A除去未結(jié)合的蛋白，用含0–1.0 mol/L NaCl的溶液A進行線性梯度洗脫，分步收集洗脫液并進行酶活測定。將各活性管合并于10 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 7.0) 4 ℃透析過夜，經(jīng)PEG6 000濃縮后進行電泳檢測。蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍G250法，用牛血清蛋白制作標準曲線。

1.2.6 PNGaseF分析核酸酶糖基化

根據(jù)PNGaseF說明書進行[17]。10 μg純化酶液中加入10 μL變性緩沖液，100 ℃保溫3 min使酶蛋白變性以暴露所有的糖基化位點，然后加入穩(wěn)定劑緩沖液5 μL，1 U PNGaseF，去離子水補足體積至30 μL，37 ℃反應(yīng)18 h后進行SDS-PAGE分析。

1.2.7 核酸酶酶活性的測定

參照Ko等的方法[18]進行。酶活力單位定義為每分鐘生成的核苷酸量在260 nm處的吸光值⊿=1.0時為1 U。以20 μg pEASY-Blunt Zero質(zhì)粒DNA 為底物。反應(yīng)體系為：2 μL緩沖液 (100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L MgSO4)，10 μg pEASY-Blunt Zero質(zhì)粒載體，1 U純化的核酸酶，用ddH2O補充至終體積為20 μL，混勻，37 ℃保溫10 min。反應(yīng)結(jié)束后，加1/4體積1 mol/L HCl，25% TCA終止反應(yīng)。上清用滅菌ddH2O稀釋，在260 nm處測定光吸收值。

1.2.8 不同反應(yīng)時間、溫度、pH、金屬離子及還原劑對核酸酶活性的影響

參考1.2.7的方法，分析不同反應(yīng)時間和溫度 (0、4、28、37、50、60 ℃) 對水解活性的影響，同時分析了不同pH (4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0) 和0、1、5、10 mmol/L金屬離子 (Mg2+、Ca2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+) 對水解活性的影響。同時測定了1、10 mmol/L DTT/β-巰基乙醇，0.1%、1%的表面活性劑Triton X-100/Tween-20/SDS以及50、100、200、300、400 mmol/L NaCl對核酸酶活性的影響，反應(yīng)完畢后立即用10 μL 250 mmol/L EDTA終止反應(yīng)，1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.9 核酸酶的不可逆熱失活分析

為了確定核酸酶的不可逆失活溫度，參考1.2.7的方法，反應(yīng)體系預(yù)先不加底物于50、60、70 ℃分別保溫10 min，加熱后的溶液冰上放置 30 min后，加入底物，37 ℃反應(yīng)30 min，電泳檢測是否存在水解活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

通過32條引物重疊延伸PCR獲得了去除信號肽的核酸酶編碼區(qū)序列，電泳分析顯示在1 200 bp左右有一特異DNA擴增帶，經(jīng)克隆測序顯示含有1 176 bp的目標編碼區(qū) (含畢赤酵母Kex2 signal及Ste13 signal 切割序列)，與預(yù)期結(jié)果一致。優(yōu)化合成的核酸酶基因經(jīng)ⅠⅠ雙酶切連接至pPICZα A載體，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗證，插入片段與預(yù)期大小一致，說明重組表達載體pPICZα A -SNU構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白表達條件的優(yōu)化

通過Zeocin抗性水平，篩選酵母高拷貝整合轉(zhuǎn)化子[19]，然后PCR鑒定正確的6個克隆分別在pH 6.0，1%甲醇濃度下誘導(dǎo)表達，從蛋白表達水平再次篩選出目標蛋白表達量高的單克隆菌株，實時熒光定量PCR結(jié)果表明此高拷貝菌株有8個目的基因拷貝整合到酵母基因組。誘導(dǎo)96 h的培養(yǎng)液上清濃縮進行SDS-PAGE檢測，在50 kDa處出現(xiàn)明顯的條帶 (圖1)，略大于北極蝦核酸酶的理論分子量42 kDa。

從甲醇濃度和誘導(dǎo)時間對蛋白表達條件進行優(yōu)化，圖1中可以看出最佳組合為：1%的誘導(dǎo)甲醇濃度，72 h目的蛋白表達量達到最大值，可能是0.5%的甲醇濃度，不能滿足畢赤酵母所需的碳源，使得目的蛋白表達量略低。

圖1 不同甲醇誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間下SNU表達量的SDS-PAGE分析

2.3 重組核酸酶的純化

隨著酵母誘導(dǎo)時間的延長，營養(yǎng)的限制造成溶菌現(xiàn)象或蛋白的降解，SDS-PAGE分析檢測到蛋白種類增多 (圖1，泳道10)，研究選擇誘導(dǎo) 72 h的上清經(jīng)透析和陰離子交換層析進行純化，梯度洗脫活性管經(jīng)濃縮后進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示為單一條帶(圖2A)。

圖2 表達蛋白的純化 (A) 和糖基化分析 (B)

2.4 PNGase F分析核酸酶糖基化

SDS-PAGE分析純化后的SNU分子量大于理論分子量，推測可能存在翻譯后的糖基化修飾。經(jīng)PNGaseF處理的SNU SDS-PAGE分析顯示分子大小為48 kDa，比預(yù)期分子量仍偏大 (圖2B)，說明畢赤酵母表達的SNU可能存在非PNGase F可水解的其他糖基化修飾。

2.5 核酸酶SNU催化特性分析

2.5.1 不同反應(yīng)溫度和pH對酶活性的影響

為便于研究SNU的催化影響因素，在給酶量為1 U，10 μg質(zhì)粒為底物，反應(yīng)條件為37 ℃，pH 8.0的條件下，SNU水解核酸的時間進程測定實驗發(fā)現(xiàn)，以10 μg質(zhì)粒為底物最佳反應(yīng)時間為10 min。

在0–60 ℃范圍內(nèi)測定SNU水解核酸的活性，如圖3A所示，在0–60 ℃范圍內(nèi)SNU均具有水解活性，即使在0 ℃條件下也表現(xiàn)出一定的水解活性，溫度達到37 ℃酶的活性達到最大值，隨著溫度的升高，催化水解程度明顯降低。在pH 4–10范圍內(nèi)分析核酸酶SNU的水解活性，由圖3B所示，SNU在pH 5.0–9.0的酸堿范圍都保持一定的水解活性，最適pH范圍為6.0–8.0。

圖3 溫度 (A) 和pH (B) 對SNU酶活性的影響

2.5.2 金屬離子對酶活性的影響

SNU的水解活性需要二價金屬離子催化，實驗反應(yīng)體系中添加不同的金屬離子引起的效應(yīng)存在差異，Mg2+、Co2+、Ca2+、Mn2+能有效激活核酸酶水解反應(yīng)，Mg2+/Mn2+對核酸酶激活作用明顯大于Co2+和Ca2+，并且不同濃度的二價離子對核酸酶活性有著不同的促進作用，伴隨Mg2+和Mn2+濃度的增加 (≥5 mmol/L)，激活作用減弱，5 mmol/L Mg2+和 1 mmol/L Mn2+顯著提高水解效率，而核酸酶對Co2+和Ca2+濃度在5 mmol/L和10 mmol/L變化不敏感，表現(xiàn)為水解程度相差不大。但是低濃度和高濃度的Zn2+和Cu2+抑制了酶催化水解反應(yīng)。

2.5.3 不同還原劑、變性劑、表面活性劑和NaCl對核酸酶活性的影響

研究還原劑DTT、β-巰基乙醇、表面活性劑Triton X-100、Tween-20、SDS等因素對核酸酶的影響，與對照組相比額外添加一定濃度的DTT、β-ME、Triton X-100、Tween-20等都有效提高了酶的水解活性，而0.1% SDS完全抑制酶的活性。SNU的活性受鹽濃度明顯影響，NaCl濃度低于0.1 mol/L時，SNU表現(xiàn)高的活性，當(dāng)NaCl高于0.1 mol/L時即表現(xiàn)出對核酸酶活性的明顯抑制，當(dāng)反應(yīng)體系中NaCl增加至0.3 mol/L時核酸酶活性被完全抑制。

2.6 核酸酶的不可逆熱失活分析

酶的熱失活是終止酶切反應(yīng)的一種簡便易行的方法，缺失質(zhì)粒底物的酶切反應(yīng)體系分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃孵育10 min后，加入質(zhì)粒底物進行水解反應(yīng)，結(jié)果表明70 ℃預(yù)保溫10 min使SNU完全失活。

3 討論

自然生境的多樣性為分離不同催化特性的酶提供了基礎(chǔ)。從嗜冷生物中獲取熱敏感的酶已有較多成功的報道，如從北極蝦中分離的蝦堿性磷酸酶 (Shrimp alkaline phosphatase，SAP) 是基因工程操作過程使用的主要去磷酸化酶[20]；南極細菌TAB5中分離的堿性磷酸酶TAP (TAB5 alkaline phosphatase，TAP)在原核系統(tǒng)中可以實現(xiàn)重組表達而成為SAP的有效替代酶[[21]。從北極蝦胰臟中純化獲得的核酸酶SNU特異作用于雙鏈的DNA，核酸序列分析顯示其屬于RNA/DNA非特異性核酸酶，在Ca2+和Mg2+同時存在時，可能表現(xiàn)出RNase活性[6]。同時SNU與勘察加半島蟹胰臟中發(fā)現(xiàn)的雙鏈特異型核酸酶DSN具有相似的催化特性，在金屬離子Ca2+、Mg2+、Co2+等存在條件下，能夠有效切割雙鏈DNA，而無RNase活性[22]，這些特性為SNU在生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用提供了依據(jù)。

關(guān)于北極蝦核酸酶的重組表達至今尚未有文獻報道。本研究構(gòu)建了北極蝦核酸酶的畢赤酵母分泌表達載體SNU-pPICZα A，成功實現(xiàn)了北極蝦核酸酶SNU分泌表達，優(yōu)化了SNU最佳表達條件和純化方法，每升培養(yǎng)液可以純化15 mg高活性的SNU，依據(jù)Kunitz測定法對酶活力單位的定義，已報道的nuclease與DNase I的比活力分別為8.6×106U/mg和7.2×105U/mg[12]，本研究重組酶SNU的比活力達到6.291×106U/mg，屬于高活性的核酸酶。N-糖基化對蛋白的活性，結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性起到了重要的作用[23-24]，PNGaseF水解證明重組SNU存在糖基化現(xiàn)象。這些結(jié)果為后續(xù)規(guī)?；呙芏劝l(fā)酵生產(chǎn)該核酸酶奠定了基礎(chǔ)。

純化的SNU表現(xiàn)出70 ℃，10 min不可逆的失活，這與從天然原料中純化獲得的SNU (65 ℃不可逆失活15 min) 的特性較為接近，是一種典型的熱敏型核酸酶。Sugiyama等將核酸酶依據(jù)酶對輔因子和最適pH的不同分為兩類：Ca2+/Mg2+依賴型核酸酶和Zn2+依賴型核酸酶[25]，依據(jù)SNU催化特性證明其為Ca2+/Mg2+依賴型核酸酶。最適反應(yīng)條件分析顯示SNU可在寬泛的條件下保持其催化活性，且表現(xiàn)出對金屬離子的依賴性，非離子型去污劑，還原劑可明顯增加核酸酶的活性，不可逆熱失活及優(yōu)異的催化特性為該酶在細胞裂解液粘度的降低以及蛋白類生物藥物中核酸去除等生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Fangxia Chen, and Peng Chen

College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China

Nucleases is an important enzyme widely used in biotechnology. A codon optimized nuclease gene (SNU) from Northern Shrimps was inserted into pPICZα A vector, and expressed extracellularly in strain SMD1168H. On the basis of multi-copy recombinant strain, we further optimized the expression condition and characterized SNU. SNU was highly expressed and stable after 1% methanol induction for 72 h, yield reached 1.4×105U/mL. SDS-PAGE electrophoresis demonstrated that this is a N-linked glycoprotein of 50 kDa. It was purified by one step DEAE Sephadex chromatography to the purity of about 15 mg/L with a specific activity of 6.291×106U/mg. Functional analysis on the nuclease activity indicated that it was stimulated by bivalent iron, such as Ca2+, Mn2+, Co2+and Mg2+, but inhibited by Zn2+, Cu2+and high salt. Meanwhile, it was irreversibly inactivated at 70 ℃ for 10 min.

Northern Shrimp Mg2+/Ca2+-independent nuclease,, secretory expression optimization, catalytic characteristics

November 5, 2015; Accepted: January 25, 2016

陳芳霞，陳鵬. 熱敏型核酸酶在畢赤酵母中的分泌表達及催化特性. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(7): 991–995.

Chen FX, Chen P. Secretory expression and characterization of heat sensitive nuclease in. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 991–995.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 30400282, 31171606), Basic Science Research Fund in Northwest A&F University (No. 2452015214).

Corresponding author: Peng Chen. Tel/Fax: +86-29-87091637; E-mail: pengchen@nwsuaf.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 30400282，31171606)，西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費 (No. 2452015214) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)