張智敏，葉娟英，龍海飛，洪玥，陸平利

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玉米早期花藥蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組分析

張智敏*，葉娟英*，龍海飛，洪玥，陸平利

復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200438

蛋白質(zhì)磷酸化修飾是調(diào)控其功能的一種重要方式。植物有性生殖過(guò)程在農(nóng)作物產(chǎn)量形成和物種繁衍過(guò)程中起著重要作用。作為植物雄性生殖器官的花藥，其正常生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于保證形成功能性配子 (花粉) 以及完成雙受精過(guò)程至關(guān)重要。本研究以重要農(nóng)作物玉米 (B73) 為材料，利用Nano UHPLC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)對(duì)玉米早期發(fā)育的花藥在蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組水平進(jìn)行全面分析，以探究玉米花藥發(fā)育過(guò)程中的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和磷酸化修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，共鑒定到了3 016個(gè)多肽，匹配到1 032個(gè)蛋白質(zhì)上。通過(guò)MapMan分析，預(yù)測(cè)到了一些和花藥發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如受體激酶 (GRMZM2G082823_P01、GRMZM5G805485_P01等)。另外，在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，通過(guò)對(duì)TiO2親和層析富集到的磷酸化多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，檢測(cè)到了257個(gè)磷酸化多肽，匹配到 210個(gè)蛋白質(zhì)上。我們的數(shù)據(jù)揭示了玉米花藥發(fā)育過(guò)程中的 223個(gè)磷酸化位點(diǎn)。與已發(fā)現(xiàn)的玉米中的86個(gè)磷酸化蛋白質(zhì) (植物蛋白磷酸化數(shù)據(jù)庫(kù) (P3DB)：http://www.p3db.org/organism.php) 相比，其中203個(gè)磷酸化蛋白和218個(gè)磷酸化位點(diǎn)為首次揭示。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析表明：磷酸化在14-3-3蛋白質(zhì)、激酶、磷酸酶、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)介導(dǎo)的玉米早期花藥發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用?？傊?，本研究首次在蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究了玉米早期花藥發(fā)育的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不僅豐富了玉米蛋白質(zhì)和磷酸化修飾蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，并為利用遺傳學(xué)和生物化學(xué)手段深入研究玉米花藥發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

玉米花藥，蛋白質(zhì)組，磷酸化，激酶，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

玉米，是世界上最廣泛的農(nóng)作物之一，是一種重要的糧食來(lái)源。玉米的育性直接影響其產(chǎn)量和繁衍，研究其生殖發(fā)育有助于提高糧食作物的產(chǎn)量以應(yīng)對(duì)日益嚴(yán)峻的人口增長(zhǎng)帶來(lái)的糧食短缺問(wèn)題[1]。此外，玉米在植物遺傳的科學(xué)研究中，也是一種重要的模式植物。隨著玉米全基因組測(cè)序的完成[2]，玉米相關(guān)的研究取得了進(jìn)一步發(fā)展。

花藥是開(kāi)花植物的雄性生殖器官，大多數(shù)開(kāi)花植物的花藥在發(fā)育初期是由3層細(xì)胞構(gòu)成的，由外而內(nèi)分別是L1、L2和L3[3]。L1層細(xì)胞最終分化為表皮層；L2層細(xì)胞最終分裂分化為內(nèi)皮層、中間層、絨氈層和小孢子母細(xì)胞，小孢子母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成小孢子，隨后分裂形成花粉，絨氈層為花粉的形成和發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)；L3層細(xì)胞最終發(fā)育成藥室間隔和維管束等組織[3]。成熟的花藥含有4個(gè)藥室，每個(gè)藥室都由5層細(xì)胞構(gòu)成，外面的4層是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，最內(nèi)層是生殖細(xì)胞，由外而內(nèi)依次是：表皮層 (Epidermis)、內(nèi)皮層 (Endothecium)、中間層 (Middle layer)、絨氈層 (Tapetum) 和小孢子母細(xì)胞 (Microsporocyte)[3]。以往的分子和遺傳學(xué)研究表明，玉米中的一些基因影響花藥發(fā)育過(guò)程[4-5]。隨著基因芯片和新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已有一些轉(zhuǎn)錄水平上的玉米花藥研究報(bào)道[6-8]，但是蛋白質(zhì)表達(dá)水平和蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平上的研究還較少。

蛋白質(zhì)作為細(xì)胞功能的基本單位，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，基因與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系極為復(fù)雜，同一個(gè)基因可能編碼多個(gè)蛋白質(zhì)，同一個(gè)蛋白質(zhì)也可能有不同的形式和功能[9]。因此，對(duì)蛋白質(zhì)的研究有助于透徹了解生物過(guò)程。中心法則以及近代蛋白質(zhì)的功能研究揭示了從基因到蛋白質(zhì)，中間有很多復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，例如，轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾[10]。前體蛋白質(zhì)需要經(jīng)過(guò)一系列翻譯后修飾 (PTM) 才能形成有功能活性的蛋白質(zhì)。翻譯后修飾在改變前體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，酶的活性，底物的特異性，介導(dǎo)蛋白質(zhì)與核酸、脂類、蛋白質(zhì)以及其他分子之間的相互作用，調(diào)控蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，蛋白復(fù)合物的形成以及蛋白質(zhì)的降解等過(guò)程中具有重要作用[10]。蛋白質(zhì)翻譯后修飾種類較多，目前研究比較熱門的修飾主要包括磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化、泛素化等多種修飾過(guò)程[10]。蛋白質(zhì)磷酸化修飾是目前研究最多也是功能研究相對(duì)透徹的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾(http://selene.princeton.edu/PTMCuration/)。磷酸化過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的可逆過(guò)程，由相應(yīng)的激酶 和磷酸酶分別催化磷酸化過(guò)程和去磷酸化過(guò) 程[11]?？赡媪姿峄揎椩诨ㄋ幇l(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用[12-13]。此外，磷酸化對(duì)機(jī)體的代謝、生長(zhǎng)、分裂和分化等過(guò)程也發(fā)揮著重要的作用[10,14]。在真核生物中，蛋白質(zhì)磷酸化通常發(fā)生在絲氨酸 (Ser)，蘇氨酸 (Thr) 和酪氨酸 (Tyr) 殘基上，也有報(bào)道，在原核生物中，磷酸化發(fā)生在組氨酸 (His)、天冬氨酸 (Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)殘基上[15]。研究表明在真核生物中，磷酸化發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上的比例大致為1 800∶200∶1[16]。

在植物蛋白磷酸化數(shù)據(jù)庫(kù) (Plant protein phosphorylation data base，P3DB) 中，收錄了86個(gè)玉米磷酸化蛋白質(zhì)(http://www.p3db. org/ organism. php)，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，鑒定到了1 242個(gè)蛋白質(zhì)，其中磷酸化蛋白質(zhì)有210個(gè)，并對(duì)鑒定到的玉米早期花藥蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的功能分析。本文的結(jié)果不僅可以豐富植物磷酸化數(shù)據(jù)庫(kù)，也能完善玉米蛋白質(zhì)功能注釋，促進(jìn)玉米花藥發(fā)育和磷酸化功能的研究。

1 材料與方法

1.1 玉米早期花藥獲取

將生長(zhǎng)在大田中的B73系列玉米植株的雄穗剝出，放在冰上保鮮。取小穗放在載玻片上并滴加一定量的Mili-Q水保鮮，在立體顯微鏡下剝開(kāi)，選取花藥長(zhǎng)度在1.5 mm左右的時(shí)期[17]，迅速放入液氮中冷凍，然后儲(chǔ)存到–80 ℃冰箱中備用。

1.2 蛋白質(zhì)提取和蛋白酶消化

加入液氮，將玉米早期花藥研磨成粉末狀，加入10倍體積的蛋白裂解液6 mol/L 尿素， 2 mol/L 硫脲和 0.1 mol/L NH4HCO3(終濃度)懸浮，之后超聲35 min (2 s超聲5 s間歇)，超聲后14 000 r/min離心20 min，取上清。然后將蛋白質(zhì)溶液在37 ℃條件下用0.005 mol/L 二硫代蘇糖醇 (Dithiothreitol，DTT) 還原45 min，0.015 mol/L 碘代乙酰胺在室溫條件下暗室烷基化45 min。用0.005 mol/L DTT淬滅多余的碘代乙酰胺。還原烷基化后的蛋白質(zhì)用Lys-C (1 μg酶可以處理100 μg蛋白質(zhì)混合物)在室溫條件下消化4 h，再用6倍體積的Mili-Q水稀釋之后，在37 ℃條件下用胰蛋白酶 (1 μg酶對(duì)應(yīng)100 μg蛋白質(zhì)混合物) 過(guò)夜消化肽段混合物。

1.3 TiO2親和層析富集磷酸化肽段

肽段混合物酸化，離心，去除色素，上清液凍干。磷酸化肽段富集采用Thingholm等[18]的方法：用TiO2加樣緩沖液 (含有80% 乙腈，1%三氟乙酸的1 mol/L 巰基乙酸) 重懸真空干燥的肽段，并使混合物緩慢的流過(guò)TiO2微柱。用20 μL上樣緩沖液洗4次，20 μL清洗緩沖液 (80%乙腈，1%巰基乙酸) 洗2次，之后用15 μL洗脫緩沖液1 (2 mol/L NH3·H2O) 和2 μL洗脫緩沖液2 (含有40%乙腈的1 mol/L NH3·H2O) 各洗脫1次。

1.4 Nano UHPLC-MS/MS分析

樣品采用液質(zhì)聯(lián)用的Easy nano-LC 1 000 LTQ-Orbitrap Elite (ThermoFisher) 進(jìn)行分離和分析，液相溶劑是0.1% FA 溶解在Mili-Q水里面 (Solvent A) 和 0.1 % FA溶解在 90 % 乙腈里面 (Solvent B)。結(jié)合在分析柱上的肽段分3步分離洗脫：2%–35% solvent B 200 min，35%–90% solvent B 10 min，90% solvent B 5 min。然后90%–2% solvent B 2 min，2% solvent B 13 min平衡分析柱。進(jìn)入質(zhì)譜的肽段離子在Orbitrap中進(jìn)行一級(jí)掃描，然后峰值最高的15個(gè)母離子 (>5 000 counts) 被選取，在線性離子阱 (LTQ) 中以MSA的碎裂模式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析 (MS/MS)[19]。

1.5 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和數(shù)據(jù)解析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Proteome discoverer software (Version 1.4, Thermo Fisher, Germany)處理后用in-house Mascot server (Version 2.3.02，Matrix Science, London，UK)進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，搜庫(kù)比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(FASTA數(shù)據(jù)下載自ftp://ftp.plantbiology.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_projects
/Z_mays/annotation_dbs/pseudomolecules/version 7.0/all.dir/all.pep; 2010; 66–495 sequences)。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索參數(shù)設(shè)置為：胰蛋白酶漏切位點(diǎn)不超過(guò)2個(gè)；一級(jí)MS的質(zhì)量誤差不超過(guò)10 ppm，二級(jí)MS/MS 碎片離子的質(zhì)量誤差不超過(guò)0.6 Da；半胱氨酸上的烷基化作為一種固定修飾；蛋白質(zhì)N末端乙?；?，甲硫氨酸的氧化，絲氨酸 (Serine)、蘇氨酸 (Threonine)和酪氨酸 (Tyrosine) 的磷酸化作為可變修飾。肽段鑒定需要滿足以下要求：<0.05，選取Mascot search engine (Matrix Science)排名第一位的肽段；肽段的假陽(yáng)性率 (FDR)<1%；鑒定到的肽段通過(guò)Target Decoy PSM validator進(jìn)一步驗(yàn)證，磷酸化位點(diǎn)通過(guò)phosphoRS3.0進(jìn)一步準(zhǔn)確定位。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用NCBI protein Blast在線軟件對(duì)鑒定到的玉米早期花藥蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行同源搜索，找到擬南芥中Score值最高且E-Value值最小的同源蛋白質(zhì) (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)。利用在線MapMan分析軟件 (http://mapman. mpimp- golm.mpg.de/general/ora/ora.shtml)對(duì)玉米早期花藥蛋白質(zhì)進(jìn)行功能聚類分析，<0.01的類目為顯著富集的類目[20]。利用ClueGO軟件對(duì)玉米磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行生物過(guò)程、分子功能和通路途徑分析[21]。利用MEGA 6.0對(duì)同源蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米早期花藥蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)概述

經(jīng)過(guò)Nano UHPLC-MS/MS分析及數(shù)據(jù)解析，本研究鑒定到了3 016個(gè)肽段，分布于1 032個(gè)蛋白質(zhì)中 (附表1，具體數(shù)據(jù)作為附件，可在網(wǎng)絡(luò)版中下載)。通過(guò)TiO2親和層析，富集到257個(gè)磷酸化肽段，包含223個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分布于210個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)中 (附表2，具體數(shù)據(jù)作為附件，可在網(wǎng)絡(luò)版中下載)。在真核生物中，染色體的結(jié)構(gòu)能夠影響基因的表達(dá)、復(fù)制和修復(fù)過(guò)程，在機(jī)體的發(fā)育過(guò)程中也具有重要作 用[22]。DEK蛋白質(zhì)最初在染色體易位導(dǎo)致的骨髓性白血病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。體外生化研究顯示，DEK蛋白質(zhì)在DNA復(fù)制、DNA雙鏈斷裂修復(fù)過(guò)程、mRNA剪接和轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中都發(fā)揮重要作用，此外DEK蛋白質(zhì)還具有組蛋白分子伴侶的功能，對(duì)保持異染色質(zhì)的完整性尤為重 要[23]。在擬南芥中，4個(gè)基因編碼DEK蛋白質(zhì)：、、和4[24]。DEK3已被證明是植物染色體蛋白，調(diào)控基因表達(dá)過(guò)程，也是擬南芥中的1種抗逆調(diào)控因子[23]。擬南芥中的AT3G48710.1是1種DEK蛋白質(zhì)，鑒定到的磷酸化蛋白質(zhì)GRMZM2G139617_P01是其同源蛋白質(zhì)。以GRMZM2G139617_P01肽段IIEDVINSMSDDEGEEGSEDEAEDDGKADNLK譜圖為例，在肽段磷酸化位點(diǎn)S10處y23離子以及靠近肽段C末端的其他離子 (y24、y25、y26等) 處可以看到丟失 (98 Da，一個(gè)磷酸) 的峰，證明了鑒定到的磷酸化位點(diǎn)的可靠性 (圖1)。

圖1 玉米早期花藥中鑒定到的GRMZM2G139617_P01肽段質(zhì)譜圖分析

表1 與P3DB相同的磷酸化蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)對(duì)比

Table 1 The phosphorylated sites of phosphoproteins maize phosphoproteins in P3DB and this study with the same sequence

210個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)包含的223個(gè)磷酸化位點(diǎn)中，80% (190個(gè)) 的位于絲氨酸 (Ser) 殘基上，14% (33個(gè)) 位于蘇氨酸(Thr)殘基上，磷酸化同時(shí)發(fā)生在Ser殘基和Thr殘基上的蛋白質(zhì)有13個(gè)，占磷酸化位點(diǎn)總數(shù)的8% (圖2A)。磷酸化Thr殘基的蛋白質(zhì)中，82% (27個(gè)) 的蛋白質(zhì)僅含有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)，15% (5個(gè)) 的蛋白質(zhì)含有2個(gè)，僅有1個(gè)蛋白質(zhì)含有3個(gè)磷酸化位點(diǎn) (圖2B)。磷酸化Ser殘基的蛋白質(zhì)，77% (146個(gè)) 的蛋白質(zhì)只含有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)，17% (32個(gè)) 的蛋白質(zhì)含有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，含有3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)磷酸化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)分別有3個(gè)，占總數(shù)的1.5%，1.5% (3個(gè)) 的蛋白質(zhì)有6–7個(gè)位點(diǎn)被磷酸化 (圖2C)。

圖2 玉米早期花藥蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組概述

在玉米早期花藥中，本研究總共鑒定到 1 242個(gè)蛋白質(zhì)，其中有210個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組并不是簡(jiǎn)單的包含關(guān)系，鑒定到的玉米早期花藥蛋白質(zhì)組特有的蛋白質(zhì)有997個(gè)；鑒定到的玉米早期花藥磷酸化蛋白質(zhì)組特有的蛋白質(zhì)有172個(gè)；P3DB收錄的玉米磷酸化蛋白質(zhì)特有的蛋白質(zhì)有77個(gè) (圖3A)。與P3DB中收錄的86個(gè)磷酸化蛋白質(zhì) (http://www.p3db.org/organism.php) 相比，鑒定到的210個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)中，僅有7個(gè)蛋白質(zhì)是P3DB收錄的 (圖3B)。此外，7個(gè)相同蛋白質(zhì)中僅有2個(gè)蛋白質(zhì)具有完全相同的磷酸化位點(diǎn) (圖3C)。這2個(gè)蛋白質(zhì)是GRMZM2G151285_P01和GRMZM2G057642_P02，磷酸化位點(diǎn)分別是S97/T99和S179。GRMZM2G151285_P01在NCBI里面顯示為hypothetical protein，GRMZM2G057642_P02是uncharacterized protein。另外5個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)鑒定到了新的磷酸化位點(diǎn)，其中GRMZM2G478709_P01，數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為pre-mRNA-splicing factor prp45，鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S144，P3DB報(bào)道的是S236/S244；GRMZM2G106133_P02，注釋為high mobility group I/Y-2，鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S108/S155/S157/S159/S169，P3DB報(bào)道的是S108/T150；GRMZM2G701221_P01，是水稻蛋白LOC100282555的同源蛋白，鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S7/T9/T38，P3DB報(bào)道的是T38/S39；

圖3 玉米早期花藥蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組和P3DB重疊圖

GRMZM2G062373_P01是未知功能的水稻蛋白LOC100192770的同源蛋白，鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S29，P3DB報(bào)道的是S45；AC233895.1_FGP001，數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為proliferation-associated protein 2G4，鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S2，P3DB報(bào)道的S3。綜上所述，我們鑒定到的玉米早期花藥磷酸化蛋白質(zhì)和位點(diǎn)不僅驗(yàn)證了P3DB中的部分?jǐn)?shù)據(jù)，更重要的是進(jìn)一步豐富了P3DB中的數(shù)據(jù)。

2.2 玉米早期花藥蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)

為了明確鑒定到的玉米早期花藥蛋白質(zhì)在花藥發(fā)育過(guò)程中的功能，通過(guò)NCBI Protein Blast找到擬南芥中具有最佳匹配的 (最高Score值和最小E-Value值) 同源蛋白質(zhì) (附表3，具體數(shù)據(jù)作為附件，可在網(wǎng)絡(luò)版中下載)。利用在線MapMan分析軟件對(duì)玉米早期花藥蛋白質(zhì)進(jìn)行了分子功能預(yù)測(cè)。玉米早期花藥蛋白質(zhì)富集的 (<0.01) MapMan分子功能類目主要包括：信號(hào) (209個(gè))、RNA (166個(gè))、轉(zhuǎn)運(yùn) (163個(gè))、逆境 (163個(gè))、細(xì)胞壁 (133個(gè))、細(xì)胞 (114個(gè))、氧化還原 (98個(gè))、氨基酸代謝 (88個(gè))、DNA (86個(gè))、二級(jí)代謝 (70個(gè))、TCA (63個(gè))、ATP合成 (57個(gè))、光系統(tǒng) (47個(gè))、糖酵解 (43個(gè))、主要的CHO代謝 (40個(gè))、核苷酸代謝 (37個(gè))、次要的CHO代謝 (32個(gè))、N-代謝 (15個(gè))、異生物素降解 (14個(gè))、C1-代謝 (13個(gè))、發(fā)酵 (8個(gè))、OPP(8個(gè))、乙醛酸循環(huán) (6個(gè)) (圖4)。通過(guò)對(duì)玉米早期花藥蛋白質(zhì)分子功能分類，富集的最多的是信號(hào)，比如鑒定到的受體激酶(GRMZM2G174708_P01，GRMZM2G176394_P03，GRMZM2G151738_P01，GRMZM2G099295_P01，GRMZM2G333811_P01，GRMZM2G149201_P01，GRMZM2G070322_P01，GRMZM2G025105_P01，GRMZM2G145440_P01，GRMZM2G038051_P01，GRMZM2G334181_P01，GRMZM2G063392_P01，GRMZM2G082823_P01，GRMZM5G805485_P01)。在擬南芥中，受體激酶 (EMS1、SERK1、SERK2、BAM1、BAM2、ER、ERL1、ERL2和RPK2) 被報(bào)道在花藥發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[3,25]。因此，鑒定到的玉米早期花藥蛋白質(zhì)有助于推動(dòng)玉米花藥發(fā)育的相關(guān)研究。

圖4 玉米幼小花藥蛋白質(zhì)組MapMan分析

2.3 玉米早期花藥磷酸化蛋白質(zhì)功能概述

可逆的蛋白質(zhì)磷酸化，在生物體的代謝、生長(zhǎng)、分裂和分化等過(guò)程都發(fā)揮著重要作用[10,12-14]。通過(guò)NCBI Protein Blast找到了鑒定到的玉米早期花藥磷酸化蛋白質(zhì)在擬南芥中最佳匹配的 (Score值最高且E-Value值最小) 同源蛋白質(zhì) (附表4，具體數(shù)據(jù)作為附件，可在網(wǎng)絡(luò)版中下載)。為了探究在玉米花藥發(fā)育的早期，磷酸化參與的過(guò)程以及功能，我們利用ClueGO軟件對(duì)玉米早期花藥磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物過(guò)程、分子功能和通路分析。磷酸化蛋白質(zhì)的分子功能主要分為4類：結(jié)合活性 (與DNA、鈣調(diào)蛋白、某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合)；磷脂酶活性 (磷脂酶C、含磷二脂水解酶、磷脂酰肌醇磷脂酶C)；磷酸轉(zhuǎn)移酶活性 (分子轉(zhuǎn)移酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)；多肽受體活性 (圖5A)。

磷酸化蛋白質(zhì)參與的生物過(guò)程主要分為調(diào)控過(guò)程、DNA組裝過(guò)程、糖代謝過(guò)程、有氧呼吸過(guò)程和蛋白質(zhì)定位過(guò)程。調(diào)控過(guò)程主要包括：翻譯正向調(diào)控、翻譯延伸調(diào)控、細(xì)胞組分合成正向調(diào)控、細(xì)胞組分降解調(diào)控、細(xì)胞代謝調(diào)控和細(xì)胞組分合成調(diào)控、細(xì)胞蛋白代謝過(guò)程調(diào)控和氨基酸修飾等調(diào)控過(guò)程；DNA組裝過(guò)程主要包括：DNA組裝、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物亞基組裝、核小體組裝、核小體組裝、染色質(zhì)組裝和蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物組裝；糖代謝過(guò)程主要包括：二糖代謝過(guò)程、二糖合成過(guò)程、蔗糖代謝過(guò)程、寡糖代謝過(guò)程、寡糖合成過(guò)程、海藻糖生物合成過(guò)程、海藻糖代謝過(guò)程和TCA循環(huán) (圖5B)。

蛋白激酶和磷酸酶介導(dǎo)的可逆磷酸化過(guò)程在花藥發(fā)育過(guò)程中參與很多不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[26]，利用KEGG對(duì)玉米早期花藥蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)控的通路進(jìn)行分析，分析結(jié)果顯示1條遺傳通路、1條信號(hào)通路和4條代謝通路。遺傳通路是DNA復(fù)制，信號(hào)通路是磷脂酰肌醇信號(hào)通路，4條代謝通路：碳水化合物代謝 (半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、戊糖磷酸途徑、TCA循環(huán)、糖異生、糖酵解)；氨基酸代謝(半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、甘氨酸代謝、精氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解)；聚糖、脂類、維生素類的生物合成和代謝(鞘糖脂生物合成、亞麻酸代謝、不飽和脂肪酸合成、脂肪酸代謝、甘油脂代謝、花生四烯酸代謝、維生素C代謝、葉酸代謝、生物素代謝)；能量代謝 (氮代謝) (圖5C)。

圖5 玉米早期花藥磷酸化蛋白質(zhì)組GO分析和KEGG分析

對(duì)玉米早期花藥磷酸化蛋白質(zhì)的生物過(guò)程、分子功能和通路途經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)玉米早期花藥中蛋白質(zhì)磷酸化在DNA復(fù)制過(guò)程、信號(hào)通路過(guò)程、調(diào)控過(guò)程和代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

2.4 磷酸化的14-3-3蛋白質(zhì)

通過(guò)和擬南芥同源蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)，推測(cè)GRMZM2G091155_P03、AC217050.4_FGP006、GRMZM2G078641_P01屬于14-3-3蛋白質(zhì)，GRMZM2G091155_P03擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT5G16050.1，AC217050.4_FGP006和GRMZM2G078641_P01在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT3G02520.1；鑒定到的磷酸化位點(diǎn)分別是S110、T237和S257，磷酸化位點(diǎn)在P3DB均未曾收錄 (表2)。14-3-3蛋白質(zhì)最初在人腦中被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)在哺乳動(dòng)物、植物和其他真核生物中也有表達(dá)[27]。14-3-3蛋白質(zhì)是一種酸性可溶性蛋白質(zhì)，可以被上游的激酶磷酸化，其典型的功能就是可以和其他發(fā)生了磷酸化的蛋白質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控該蛋白質(zhì)的功能[28]。研究顯示14-3-3蛋白質(zhì)可以調(diào)控初級(jí)代謝中的酶[29]，也可以與蛋白激酶發(fā)生作用，14-3-3蛋白質(zhì)可以被激酶磷酸化，也可以與激酶互作進(jìn)而調(diào)節(jié)其活性。研究顯示14-3-3蛋白可以結(jié)合植物鈣依賴性蛋白激酶 (CDPK)來(lái)激活其催化活性[30]；SNF-related蛋白激酶 (SnRK) 在碳同化和脅迫適應(yīng)的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮核心作用，在擬南芥中，SnRK包括SnRK1、SnRK2和SnRK3，WPK4是小麥SnRK3激酶，WPK4和14-3-3蛋白具有雙重連接關(guān)系，14-3-3蛋白能通過(guò)WPK4C-末端區(qū)域的磷酸化位點(diǎn)S388和S418結(jié)合到WPK4上，WPK4可以磷酸化14-3-3在硝酸還原酶上的結(jié)合位點(diǎn)S534[31]。MAP激酶參與許多細(xì)胞過(guò)程，比如細(xì)胞周期調(diào)控和非生物脅迫細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程等。番茄14-3-3蛋白7可以通過(guò)強(qiáng)化MAPKKKα的信號(hào)能力正向調(diào)控免疫相關(guān)的細(xì)胞程序性死 亡[32]。在百合中，14-3-3蛋白可以結(jié)合磷酸化的質(zhì)子泵C-末端來(lái)調(diào)控質(zhì)子泵的活性，進(jìn)而影響花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)過(guò)程[33]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育中，14-3-3蛋白能夠與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，從而精確的調(diào)控復(fù)雜的信號(hào)通路，影響不同的發(fā)育過(guò)程，比如植物的開(kāi)花過(guò)程，細(xì)胞周期調(diào)控，脫落酸 (ABA)、赤霉素 (GA)和油菜素內(nèi)酯 (BR) 的合成等過(guò)程[27–28]。GRMZM2G091155_P03、AC217050.4_ FGP006、GRMZM2G078641_P01與擬南芥 (AT5G16050.1，AT3G02520.1) 和水稻的Os08g0430500、Os04g0462500都具有高度的序列相似性，GRMZM2G091155_P03鑒定到的磷酸化位點(diǎn)S110和GRMZM2G078641_P01鑒定到的磷酸化位點(diǎn)S257，位于同一段保守的功能域內(nèi)，這個(gè)磷酸化了的位點(diǎn)在其他物種中也是保守的，我們從而預(yù)測(cè)該磷酸化位點(diǎn)在多個(gè)物種間具有類似的功能 (圖6)。

表2 磷酸化的玉米早期花藥中的14-3-3蛋白質(zhì)

Table 2 The phosphorylation of 14-3-3 proteins in maize early anther

a) Bold amino acids indicated that these amino acids were phosphorylated in identified phosphoproteins. b) P-site means phosphorylation site. c) “N” means that phosphorylation site found in this study was not recorded in P3DB.

圖6 玉米早期花藥中鑒定到的磷酸化蛋白質(zhì)與水稻和擬南芥中的同源蛋白質(zhì)序列比對(duì)

2.5 磷酸化的激酶和磷酸酶

在植物中，磷酸酶、激酶構(gòu)成了有機(jī)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系，可逆的調(diào)控了蛋白質(zhì)的磷酸化過(guò)程[34]。擬南芥和水稻中都報(bào)道了多個(gè)重要的磷酸酶，激酶及配基的功能及調(diào)控機(jī)制[35]。本研究中發(fā)現(xiàn)了一些磷酸化蛋白質(zhì)GRMZM2G309025_P01/GRMZM2G180704_P01/GRMZM2G009538_P01/GRMZM2G166035_P01/GRMZM2G169182_P01/GRMZM2G127632_P01
/GRMZM2G060296_P04/GRMZM2G011070_P01預(yù)測(cè)是磷酸化的同源蛋白質(zhì)是AT2G19130.1，是一種S-locus受體激酶，激酶和磷酸酶，其磷酸化位點(diǎn)分別是S825/T170/S469 S23/S278 S148/S153/S170/S581，這些磷酸化位點(diǎn)都是P3DB未報(bào)道的 (表3)。GRMZM2G 309025_ P01在擬南芥中的具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。S-locus受體激酶 (SRK) 基因最初在甘藍(lán)中被發(fā)現(xiàn)，在十字花科植物自交不親和反應(yīng)中，SRK受體在自花授粉和異花授粉過(guò)程中發(fā)揮識(shí)別作用[36]。GRMZM2G009538_P01在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT3G50690.1，是一種LRR受體激酶，LRR受體激酶在植物抗逆性反應(yīng)、發(fā)育調(diào)控及激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在擬南芥中，F(xiàn)LS2參與植物抗逆性反應(yīng)，具有防御和病原體識(shí)別的功能[37]；另外擬南芥中的LRR受體激酶ER、EMS1、BAM1/BAM2，SERK1/SERK2在花藥發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作 用[3,25,38-40]；FLOR1介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，參與花發(fā)育的調(diào)控[41]。GRMZM2G166035_P01在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT4G31750.1，是一種磷酸酶。擬南芥的磷酸酶PSP1在植物的雄性育性中也發(fā)揮著重要的功能[42]。GRMZM2G169182_P01在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT2G01190.1，GRMZM2G127632_P01的是AT1G18160.1，GRMZM2G011070_P01的是AT2G35050.1，都屬于蛋白激酶超家族。GRMZM2G060296_P04在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT4G30600.1，是SRP受體α亞基家族蛋白。GRMZM2G180704_P01在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT3G01090.2，是AKIN10/ SNF1-RELATED PROTEIN KINASE 1.1。SNF1 (Sucrose non-fermenting-1) 蛋白激酶在葡萄糖脅迫反應(yīng)中具有重要的作用，在酵母產(chǎn)孢過(guò)程中也是必不可少的[43]。該蛋白最早在釀酒酵母中被鑒定到，研究證明SNF1在真核生物中具有高度保守性[44]。在哺乳動(dòng)物中，AMPK是SNF1同源蛋白質(zhì)，SNF1/AMPK蛋白激酶家族是一個(gè)高度保守的激酶家族，在細(xì)胞脅迫反應(yīng)中起重要作用[45]。在擬南芥中，SNF1-related kinase 1 (SnRK1) 是SNF的同源蛋白質(zhì)，研究證明SnRK1參與很多應(yīng)激反應(yīng)，比如脅迫反應(yīng)[46]。在大麥中，SnRK1α和SnRK1β在花藥中表達(dá)，反義SnRK1的表達(dá)能夠引起花粉發(fā)育異常和大麥的雄性不 育[47]。此外，SnRK1在轉(zhuǎn)錄和代謝過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[48]，能夠調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)[46]。在釀酒酵母中，研究發(fā)現(xiàn)SNF1激酶在減數(shù)分裂起始和孢子形成過(guò)程中必不可少[49]。本文鑒定到的GRMZM2G180704_P01在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是SNF1-RELATED PROTEIN KINASE 1.1 (AKIN10)，研究顯示，AKIN10可以和FUSCA3 (FUS3) 結(jié)合調(diào)控?cái)M南芥?zhèn)壬鞴俚陌l(fā)育和時(shí)期過(guò)渡[50]。因?yàn)殍b定到的GRMZM2G 180704_P01與擬南芥AT3G01090.2、水稻 (OSK1，Os05g0530500) 氨基酸序列具有高度的相似性，推測(cè)GRMZM2G180704_P01鑒定到的T170磷酸化位點(diǎn)具有保守性 (圖7)。

表3 磷酸化的玉米早期花藥中的激酶和磷酸化酶

Table 3 Phosphorylated kinases and phosphatases in maize early anther

a) Bold amino acids indicated that these amino acids were phosphorylated in identified phosphoproteins. b) P-site means phosphorylation site. c) “N” means that phosphorylation site found in this study was not recorded in P3DB.

圖7 玉米早期花藥中鑒定到的磷酸化蛋白質(zhì)與水稻和擬南芥中的同源蛋白質(zhì)序列比對(duì)

2.6 磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子是動(dòng)植物體內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的重要元件，在調(diào)控轉(zhuǎn)錄，維持基因組穩(wěn)定性方面具有重要意義。擬南芥和水稻等模式植物中報(bào)道和鑒定到的轉(zhuǎn)錄因子主要包括鋅指家族、bZIP家族、bHLH家族以及MYC家族等[51-54]。GRMZM2G119640_P05中鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S142，在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT3G21810.1，是C-X8-C-X5-C-X3-H類型的鋅指蛋白質(zhì) (表4)。CCCH鋅指基序廣泛存在于有機(jī)體中，從人類到酵母，CCCH類型的鋅指蛋白質(zhì)可以與DNA、RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮作 用[55]。該蛋白發(fā)生磷酸化，推測(cè)其在玉米早期花藥發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。GRMZM2G010960_P01鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S767，在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT1G10200.1，是GATA類型的鋅指蛋白質(zhì) (表4)。GRMZM2G097726_P02鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是T204，在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT4G22140.1，是PHD-finger家族蛋白質(zhì)。H2A、H2B、H3和H4都屬于組蛋白，組蛋白修飾是一種重要的翻譯后修飾，在轉(zhuǎn)錄的激活和沉默過(guò)程中發(fā)揮重要作用[56]。研究顯示，植物的同源結(jié)構(gòu)域 (PHD-finger) 可以作為一種識(shí)別組蛋白的特殊的結(jié)構(gòu)域[57]。此外，PHD-finger在染色質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)中也存在，可以識(shí)別染色質(zhì)修飾并招募其他因子行使功 能[58]。在擬南芥中，MMD1可以編碼PHD-finger蛋白質(zhì)，MMD1在雄性減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用[59]。因此，推測(cè)鑒定到的同源基因GRMZM2G097726_P02在玉米花藥減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)揮作用。GRMZM2G175280_P01鑒定到磷酸化位點(diǎn)是S219，在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT4G38900.1，是bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)；GRMZM2G178182_P01鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S259、S261、T273和S288，在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT5G50915.1，是bHLH DNA-binding 超家族蛋白質(zhì) (表4)。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控細(xì)胞過(guò)程和有機(jī)體的組分中發(fā)揮著重要的功能。bZIP和bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在于真核生物中，研究顯示bZIP轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控花發(fā)育[60]。在動(dòng)物中，bHLH蛋白在感應(yīng)信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞周期，以及其他一些重要過(guò)程中發(fā)揮作用[61]。在植物中，bHLH蛋白參與很多生物過(guò)程，比如信號(hào)過(guò)程、脅迫過(guò)程和花發(fā)育過(guò)程[60]。水稻中已有研究顯示，bHLH轉(zhuǎn)錄因子UDT1、TDR、TIP2參與花藥發(fā)育過(guò)程，能夠影響雄性育性[62-64]。因此，推測(cè)鑒定到的GRMZM2G178182_P01在玉米早期花藥發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化的鑒定和研究為進(jìn)一步理解轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制提供了理論支持，并為我們后續(xù)的遺傳學(xué)研究提供了線索。

2.7 細(xì)胞周期和染色質(zhì)相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)

通過(guò)與擬南芥同源蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了一些磷酸化蛋白質(zhì)與細(xì)胞周期以及染色質(zhì)相關(guān)。GRMZM5G866734_P01鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S2和T5，在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT1G19880.1 ，是RCC1家族蛋白質(zhì) (表4)。RCC1是擬南芥有絲分裂調(diào)控染色體濃縮的關(guān)鍵基因[65]。GRMZM2G036765_P02鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S3，在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT3G09840.1，是細(xì)胞分裂周期蛋白48 (CDC48) (表4)。在釀酒酵母中，CDC48在紡錘體分離時(shí)發(fā)揮重要作用；在擬南芥中，CDC48在細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要功能[66]。GRMZM2G117100_P02鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S139，GRMZM2G139617_P01鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S479、S11、S367。GRMZM2G117100_P02和GRMZM2G139617_P01在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)均是AT3G48710.1；GRMZM2G375984_P01鑒定到的磷酸化位點(diǎn)是S379，在擬南芥中的同源蛋白質(zhì)是AT5G55660.1；這3種蛋白都含有DEK結(jié)構(gòu)域 (表4)，在擬南芥中，含有DEK結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功 能[23]。因此，通過(guò)分析推測(cè)鑒定到的玉米早期花藥磷酸化蛋白質(zhì)參與了調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)胞分裂過(guò)程。

3 結(jié)論

本文聚焦在玉米早期花藥蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的研究上，利用TiO2親和層析的方法富集磷酸化肽段，借助Nano UHPLC-MS/MS質(zhì)譜手段，獲得了1 032個(gè)蛋白質(zhì)和210個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)，對(duì)磷酸化的14-3-3蛋白質(zhì)、激酶、磷酸酶、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期和染色質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了重點(diǎn)分析以及14-3-3磷酸化位點(diǎn)、AKIN10磷酸化位點(diǎn)的保守性分析。研究結(jié)果不僅能夠豐富植物蛋白磷酸化數(shù)據(jù)庫(kù) (P3DB)，同時(shí)對(duì)于推動(dòng)玉米花藥發(fā)育和翻譯后修飾過(guò)程的研究提供了一定的信息基礎(chǔ)。

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Global proteomic and phosphoproteomic analysis of the premature maize anther

Zhimin Zhang*, Juanying Ye*, Haifei Long, Yue Hong, and Pingli Lu

Institute of Plant Biology, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China

Reversible phosphorylation plays a crucial role in regulating protein activities and functions. Sexual reproduction directly affects yield of most agricultural crops. As the male reproductive organ, anther generates microspores (pollen), delivering gametes (sperms) to complete double fertilization in higher plants. Here, we took the advantage of Nano UHPLC-MS/MS to analyze maize (, B73) early anthers at proteomic and phosphoproteomic levels, to explore the protein and phosphorylation modification regulatory networks controlling maize anther development. Our proteomic analysis identified 3 016 unique peptides, belonging to 1 032 maize proteins. MapMan analysis revealed variously potential proteins associated with maize anther development, such as receptor-like kinases (GRMZM2G082823_P01 and GRMZM5G805485_P01). Using phospho-peptides enriched by TiO2affinity chromatography, our phosphoproteomic analysis detected 257 phospho-peptides from 210 phosphoproteins, discovering 223 phosphosites. Compared to the 86 maize phosphoproteins collected in the Plant Protein Phosphorylation Data Base (P3DB), we found that 203 phosphoproteins and 218 phosphosites were not revealed before. Further bioinformatics analysis revealed that phosphorylation of 14-3-3 proteins, kinases, phosphatases, transcription factors, cell cycle and chromatin structure related proteins might play important roles in regulating normal anther development in maize. Our findings not only enlarged the maize phosphoproteome data, but also provided information for analyzing the molecular mechanism controlling maize anther development at genetic and biochemical levels.

maize anther, proteome, phosphorylation, kinase, regulatory network

October 23, 2015; Accepted: December 25, 2015

張智敏, 葉娟英, 龍海飛, 等. 玉米早期花藥蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(7): 937–955.

Zhang ZM, Ye JY, Long HF, et al. Global proteomic and phosphoproteomic analysis of the premature maize anther. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 937–955.

Supported by: Shanghai Pujiang Talent Program to P.L. (No. 14PJ1400900).

Corresponding author: Pingli Lu. Tel: +86-21-51630535; E-mail: pinglilu@fudan.edu.cn

*These authors contributed equally to this study.

上海市浦江人才計(jì)劃 (No. 14PJ1400900) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)