段仰凱，梁飛燕，談曉明，呂雪峰

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基于Ⅰ的T載體及其在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

段仰凱1,2，梁飛燕1,2，談曉明2，呂雪峰2

1 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 2 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 中國科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

為了節(jié)約成本和提高實(shí)驗(yàn)效率，以商用pMD18-T載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建獲得了pFL-XS-T載體，其具有符合Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的串聯(lián)Ⅰ-Ⅰ-Ⅰ-Ⅰ克隆序列，通過對Ⅰ的酶切處理即可以通過TA克隆方便地克隆PCR片段?？寺◎?yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)Ⅰ處理的該載體可以與PCR片段進(jìn)行TA連接，連接效率及陽性率均可以滿足實(shí)驗(yàn)室要求并且可以得到Biobrick標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。此外，該載體不僅可以與其余Biobrick標(biāo)準(zhǔn)元件進(jìn)行串聯(lián)，還可以作為功能DNA元件的篩選載體。

Biobrick標(biāo)準(zhǔn)，TA克隆，合成生物學(xué)

傳統(tǒng)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，由于受可用酶切位點(diǎn)的限制，許多重組后的DNA無法繼續(xù)拼裝，因而不能滿足合成生物學(xué)的大量、快速拼裝的要求。Knight發(fā)明了一套新的DNA組裝策略并將其命名為“Biobrick”。該策略利用限制性內(nèi)切酶的同尾酶，酶切后可以得到互補(bǔ)的粘性末端并且連接后形成的堿基序列無法被其中任何一種酶識別的原理，實(shí)現(xiàn)了DNA片段的循環(huán)組裝[1-3]。經(jīng)典的Biobrick拼接方法，需要先通過PCR克隆的方式，將目的片段克隆到兩翼帶有RⅠ-Ⅰ、Ⅰ-Ⅰ等酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒上。這就需要在擴(kuò)增目的片段的引物末端加上Ⅰ和Ⅰ等酶切位點(diǎn)，引物上額外的酶切位點(diǎn)的添加使得合成成本升高且步驟相對繁瑣。

PCR是分子生物學(xué)中獲得體外DNA片段的最常用的方法，用DNA聚合酶PCR擴(kuò)增得到片段的3′端突出一個(gè)A堿基[4]，TA克隆是DNA聚合酶擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與載體連接最快速最有效的方法之一[5-8]。商用T載體，如pMD18-T，載體兩端有Ⅰ等多個(gè)酶切位點(diǎn)可用，然而通常條件下克隆得到的質(zhì)粒并不具有Biobrick特征，在載體的一端缺少Ⅰ的同尾酶Ⅰ。若要利用TA克隆的方式獲得Biobrick特征質(zhì)粒，需要在目的片段的一端加入Ⅰ酶切位點(diǎn)且片段插入后需確保pMD18-T載體引入的Ⅰ和目的片段引入的Ⅰ酶切位點(diǎn)位于插入片段的兩端。該方法雖然克隆效率高，但擴(kuò)增片段的引物末端還需加入Ⅰ酶切位點(diǎn)且克隆后需要鑒定插入方向，這使得引物合成成本升高且步驟仍然相對繁瑣。

由此可見，獲得一個(gè)帶有Biobrick酶切位點(diǎn)的T載體就可以解決傳統(tǒng)Biobrick組件獲取方法所面臨的問題。許多研究報(bào)道過利用限制性內(nèi)切酶可以構(gòu)建T載體[9-11]，其中Ⅰ構(gòu)建T載體的研究尤其得到了廣泛關(guān)注[12-16]。Ⅰ為一種Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，識別位點(diǎn)為5′-CCANNNNN | NNNNNTGG-3′，如果設(shè)計(jì)第5個(gè)N為T，Ⅰ酶切后在3′端突出一個(gè)T，可以與聚合酶反應(yīng)產(chǎn)物上的3′端單A突出配對，直接進(jìn)行亞克隆或測序。但是目前還沒有利用Ⅰ構(gòu)建符合Biobrick規(guī)范T載體的研究報(bào)道。事實(shí)上，pMD18-T與符合Biobrick規(guī)范T載體的主要區(qū)別只是在pMD18-T的d Ⅲ一端缺少Ⅰ酶切位點(diǎn)。因此，將一段一端帶有Ⅰ酶切位點(diǎn)，另一端帶有Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體經(jīng)過TA克隆連接，會得到一個(gè)符合Biobrick規(guī)則的T載體質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒再經(jīng)過Ⅰ酶切便可以得到符合Biobrick規(guī)范的T載體 (圖1)，該載體不僅可以與DNA片段進(jìn)行TA克隆連接，而且克隆后的片段還可以利用Biobrick規(guī)則進(jìn)行后續(xù)組裝 (圖1)。因此，本文按照該方法構(gòu)建了Biobrick-T載體并對該載體的克隆效率及應(yīng)用的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖1 基于XcmⅠ的T載體構(gòu)建及其在合成生物學(xué)中應(yīng)用示意圖

1 材料與方法

1.1 試劑

pMD18-T載體和感受態(tài)細(xì)胞購于TaKaRa (日本)。其余用于分子克隆的試劑盒購于Omega (美國)。內(nèi)切酶Ⅰ購于NEB (美國)，其余所用的限制性內(nèi)切酶和分子克隆所用到的相關(guān)的酶購于Thermo (加拿大)。

1.2 菌株和質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究所用的引物見表1，用到的質(zhì)粒見表2。

表1 本研究中所用的引物

Table 1 Primers used in this study

Underlined nucleotides represent the restriction enzyme sites

表2 本研究中所用的質(zhì)粒

Table 2 Plasmids used in this study

1.2.1 使用pMD18-T載體構(gòu)建Biobrick標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

以pRL271[17]為模板，Cm-F (含Ⅱ酶切位點(diǎn))/Cm-R (含Ⅰ酶切位點(diǎn)) 為引物PCR擴(kuò)增得到約1 kb的氯霉素抗性基因片段，隨后將該片段連接到pMD18-T載體中得到質(zhì)粒pXT170c，形成Ⅰ和Ⅰ同尾酶的Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒。隨后用Ⅰ酶切pRL57[18]，得到的帶有壯觀霉素抗性編碼基因的Omega片段與用Ⅱ和Ⅰ酶切并補(bǔ)平的pXT170c片段連接，得到有Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒pXT170s。用QucikChange方法消除壯觀霉素抗性片段中的Ⅰ位點(diǎn) (用引物Omega-qc-F/Omega-qc-R進(jìn)行突變)得到質(zhì)粒pXT170′。

1.2.2 Biobrick-T載體pFL-XS的構(gòu)建

以pRL271[17]為模板，X-F1/X-R1為引物PCR擴(kuò)增得到約1 kb的氯霉素抗性片段，隨后將該片段連接到pMD18-T載體中得到質(zhì)粒pXcm-XS。用Ⅰ酶切該質(zhì)粒并用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平，自連接，最終得到消除Ⅰ的質(zhì)粒pFL-XS。

1.2.3 利用Biobrick規(guī)則進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建

如圖2所示，使用Ⅰ和Ⅰ酶切質(zhì)粒BBa_E0240得到綠色熒光報(bào)告基因片段 (eGFP)，使用Ⅰ和Ⅰ酶切pFL-XS得到載體片段，將兩個(gè)片段分別回收后連接得到質(zhì)粒pXT238。用Ⅰ和Ⅰ酶切pXT238得到的載體與用Ⅰ和Ⅰ酶切pXT170′得到的壯觀霉素抗性片段連接得到質(zhì)粒pXT244′。

圖2 利用Biobrick規(guī)則構(gòu)建質(zhì)粒pXT244′流程圖

1.2.4 用于大腸桿菌中檢測啟動子活性的質(zhì)粒構(gòu)建

用Ⅰ酶切pXT244′得到有3′-T突出的2.7 kb的DNA片段，該片段可作為T載體。lacI-R/PlacO-R為引物，質(zhì)粒pRL59EH[19]為模板用DNA聚合酶PCR得到3′端帶有堿基A的lacI-Ptac片段，lacI-R/PlacO-R為引物，質(zhì)粒pXT181b為模板用DNA聚合酶PCR得到3′端帶有堿基A的lacI-Ptrc片段，將兩個(gè)啟動子片段分別與pXT244′得到的載體進(jìn)行TA克隆分別得到含有Ptac啟動子的質(zhì)粒pFL75和含有Ptrc啟動子的質(zhì)粒pFL76。

1.3 pFL-XS-T載體克隆效率及陽性率測定

pFL-XS質(zhì)粒用Ⅰ (NEB) 酶切并使用膠回收試劑盒 (OMEGA) 回收得到2.7 kb的pFL-XS-T載體 (40 μg/μL)，實(shí)驗(yàn)中對照載體使用的是商業(yè)載體pMD18-T (TaKaRa，50 μg/μL)。

首先，實(shí)驗(yàn)使用插入片段 (pMD18-T試劑盒內(nèi)置對照片段，50 μg/μL) 與兩個(gè)載體分別進(jìn)行連接。連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，分別隨機(jī)挑取20個(gè)單克隆，使用通用引物RV-M和M13-47對20個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性克隆。陽性克隆的標(biāo)準(zhǔn)是菌落PCR可以得到約660 bp的PCR產(chǎn)物。

其次，為了驗(yàn)證pFL-XS-T對隨機(jī)克隆的PCR產(chǎn)物的連接效率，PCR擴(kuò)增來源于集胞藻PCC 6803 (sp. PCC 6803) 328 bp和來源于聚球藻PCC 7942(sp. PCC 7942) 2 199 bp兩段DNA片段。用膠回收試劑盒(OMEGA)回收，分別與pFL-XS-T載體連接過夜隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。分別隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆，用上述通用引物對單克隆進(jìn)行菌落PCR。檢驗(yàn)出陽性克隆的標(biāo)準(zhǔn)是菌落PCR可以分別得到約500 bp和2 350 bp的PCR產(chǎn)物。

1.4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒pFL75、pFL76和pFL77轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，分別得到重組大腸桿菌FL178、FL179和FL180。

1.5 熒光顯微鏡觀察

將重組大腸桿菌FL178、FL179和FL180接種到LB培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至指數(shù)生長期時(shí)加入1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)。IPTG誘導(dǎo)后5 h，對不同菌的培養(yǎng)液取樣并進(jìn)行熒光顯微鏡 (Olympus BX51, 日本) 觀察[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 T尾Biobrick載體的獲得

構(gòu)建得到pFL-XS質(zhì)粒經(jīng)過內(nèi)切酶Ⅰ可以得到Biobrick-T載體。由圖3可以清楚地看出，內(nèi)切酶Ⅰ可以有效地將pFL-XS質(zhì)粒酶切成一個(gè)2 722 bp的載體片段和一個(gè)962 bp的氯霉素抗性片段，并且兩個(gè)片段的大小可以確保在回收膠上得到有效分離 (圖3)，其中2 722 bp片段為Biobrick-T載體片段。該載體以pMD18-T載體為基本框架，不僅具備各種多克隆位點(diǎn)，而且在載體兩端分別帶有RⅠ-Ⅰ和Ⅰ-Ⅰ Biobrick酶切位點(diǎn)，使得與該載體進(jìn)行TA克隆后的DNA片段獲得Biobrick特征(圖1)。

圖3 pFL-XS-T載體的XcmⅠ限制性內(nèi)切酶酶切檢測 結(jié)果

2.2 pFL-XS-T載體克隆效率及陽性率

商業(yè)載體pMD18-T轉(zhuǎn)化平板上的單克隆數(shù)量 (大于200個(gè)) 遠(yuǎn)高于pFL-XS-T載體轉(zhuǎn)化平板上的單克隆數(shù)量 (32個(gè))，但是自制pFL-XS-T濃度略低于商用載體濃度 (40 μg/mL VS 50 μg/mL)，如果提高pFL-XS-T載體的濃度，轉(zhuǎn)化后的單克隆數(shù)目有再增多的可能。但是在該濃度下，pFL-XS-T為載體的轉(zhuǎn)化平板上的單克隆數(shù)目足夠應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室條件下目的克隆的獲得。

本研究以菌落PCR檢測轉(zhuǎn)化子插入片段的方法來驗(yàn)證陽性克隆并計(jì)算陽性率，分別選用pMD18-T載體的商用插入片段和藍(lán)藻基因組隨機(jī)片段作為待測片段。在插入商用片段的實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)挑取20個(gè)單克隆PCR鑒定，pMD18-T載體重組質(zhì)粒的陽性率為100% (圖4A)，即所有單克隆中都成功得到了含有插入商業(yè)片段的重組質(zhì)粒；pFL-XS-T載體重組質(zhì)粒的陽性率為90% (20個(gè)單克隆中18個(gè)為陽性)，即有10%的單克隆中沒有成功得到含有插入商業(yè)片段的重組質(zhì)粒 (圖4B)。假陽性的出現(xiàn)是因?yàn)閜FL-XS質(zhì)粒在DNA瓊脂膠上條帶的位置與pFL-XS-T線性載體的條帶基本重合 (數(shù)據(jù)未列出)，與之前文獻(xiàn)報(bào)道類似[21-22]，受Ⅰ酶切效率的限制，有少量的沒有受到Ⅰ酶切的質(zhì)?；烊肓溯d體片段中，該質(zhì)粒含有氯霉素和氨芐青霉素的抗性，因此轉(zhuǎn)化得到的克隆可以在氨芐青霉素的抗性板上生長，因此推測影響重組陽性率的主要因素是pFL-XS質(zhì)粒的酶切完全程度。這個(gè)問題可以通過增加填充片段(本研究為氯霉素)的長度，使得載體片段和未被酶切的質(zhì)粒在電泳膠上易于分開回收以及引入藍(lán)白斑篩選來提高連接效率[21,23-25]。

圖4 商用插入片段與pFL-XS-T載體的TA克隆效率及陽性率檢測

T載體的廣泛應(yīng)用是因?yàn)槟軌蛑苯优c實(shí)驗(yàn)室條件下用DNA聚合酶PCR得到的產(chǎn)物連接并進(jìn)行后續(xù)的亞克隆和測序工作。為了驗(yàn)證pFL-XS-T對隨機(jī)克隆的PCR產(chǎn)物的連接效率，用DNA聚合酶分別PCR克隆了來源于藍(lán)藻基因組的328 bp和2.2 kb的基因片段，純化后直接與pFL-XS-T載體連接過夜，轉(zhuǎn)化。各隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者的陽性率都高于75% (圖5)。

圖5 隨機(jī)插入片段與pFL-XS-T載體的TA克隆效率及陽性率檢測

以上結(jié)果說明該載體可以有效地通過TA克隆的方式連接DNA片段，這些片段連接以后形成的質(zhì)粒即為Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒，這樣便可以省去PCR擴(kuò)增中為了加入Biobrick所需要的酶切位點(diǎn)而增加的引物長度。因此通過該方法可以很便捷的建立Biobrick元件庫。

2.3 不同方式獲得的符合Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的基因元件的組裝和應(yīng)用驗(yàn)證

為了驗(yàn)證得到的pFL-XS在實(shí)際應(yīng)用中是否可以與符合Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的元件有效拼接。我們先將質(zhì)粒pFL-XS與Biobrick標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒庫中的質(zhì)粒BBa_E0240進(jìn)行Biobrick規(guī)則組裝 (詳見材料與方法1.2.3)，得到了含有報(bào)告基因的質(zhì)粒pXT238，該質(zhì)粒仍然具有Biobrick特征。隨后我們又將pXT238與之前構(gòu)建的具有Biobrick特征的質(zhì)粒pXT170′再次進(jìn)行了Biobrick規(guī)則組裝，最終得到了帶有報(bào)告基因且仍然具有Biobrick特征的質(zhì)粒pXT244′。質(zhì)粒pXT244′構(gòu)建過程不僅證明了本研究得到的pFL-XS載體質(zhì)粒不僅具有Biobrick特征并且可以與其余Biobrick規(guī)則的片段及質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)的Biobrick規(guī)則組裝。

另外，之前有研究將T載體用于高通量篩選[26]，由于本研究得到的pFL-XS-T載體也具有T載體的特點(diǎn)，前面我們已經(jīng)驗(yàn)證了該載體連接的有效性，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該載體應(yīng)用的有效性，我們將該載體可進(jìn)行TA克隆的特性用于啟動子篩選。質(zhì)粒pXT244′源于質(zhì)粒pFL-XS，是以pFL-XS為載體，利用Biobrick規(guī)則與其余片段組裝獲得，該質(zhì)粒經(jīng)過Ⅰ酶切后可以得到含有報(bào)告基因的T載體，因此需要篩選的啟動子片段只需要經(jīng)過PCR和TA克隆便可以得到啟動子篩選質(zhì)粒。我們分別構(gòu)建了含有Ptrc和Ptac啟動子的篩選質(zhì)粒及對照質(zhì)粒 (見材料與方法) 并將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。培養(yǎng)的重組大腸桿菌在加入IPTG誘導(dǎo)以后，在日光中就可以看到含有Ptrc和Ptac啟動子的菌株有熒光出現(xiàn) (圖6C)。在熒光顯微鏡下觀察，很明顯可以看出含有Ptrc和Ptac啟動子的菌株可以發(fā)出綠色熒光 (圖6A和圖6B)。

圖6 重組大腸桿菌FL178、FL179和FL180的表型分析

因此，基于pFL-XS-T載體構(gòu)建的質(zhì)粒不僅可以實(shí)現(xiàn)與其他來源的Biobrick元件進(jìn)行拼裝，而且還可以作為T載體，通過TA克隆的方式對其中的元件進(jìn)行建庫及高通量篩選。

3 結(jié)果與討論

標(biāo)準(zhǔn)化生物學(xué)元件可以大大簡化生物基因工程過程。本研究通過利用Ⅰ對商業(yè)化載體pMD18-T的改造獲得了具有Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的pFL-XS-T載體，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該載體與片段的連接及重組效率均可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。另外本研究獲得的載體同時(shí)具備了Biobrick標(biāo)準(zhǔn)元件和T載體的功能，不僅可以與其他的Biobrick標(biāo)準(zhǔn)元件進(jìn)行裝配還可以作為T載體用于功能DNA元件的篩選，簡化了傳統(tǒng)Biobrick方法，減少了引物合成成本，為以后合成生物學(xué)研究提供了一種可選擇的平臺工具。

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AnⅠ-generated T vector and its applications in synthetic biology

Yangkai Duan1,2, Feiyan Liang1,2, Xiaoming Tan2, and Xuefeng Lü2

1 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 2 Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

For more economical and efficient DNA clonging, pFL-XS-T, a Biobrick-T vector was constructed based on pMD18-T vector, carrying clonging regions ofⅠ-Ⅰ-Ⅰ-Ⅰ. The results revealed that PCR products could be conveniently inserted into pFL-XS-T vevtor digested byⅠby means of TA cloning. The positive frequency of recombination can meet the experimental requirements and all the plasmids obtained meet Biobrick standard. Moreover, the pFL-XS-T is compatible with other Biobrick parts, and serves as a vector for functional DNA fragments screening.

Biobrick standard, TA cloning, synthetic biology

October 23, 2015; Accepted: November 16, 2015

段仰凱, 梁飛燕, 談曉明, 等. 基于Ⅰ的T載體及其在合成生物學(xué)中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(7): 956–965.

Duan YK, Liang FY, Tan XM, et al. AnⅠ-generated T vector and its applications in synthetic biology. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 956–965.

Supported by: Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2013CQ045).

Corresponding authors: Xuefeng Lü. Tel: +86-532-80662629; Fax: +86-532-80662712; E-mail: lvxf@qibebt.ac.cn

山東省自然科學(xué)基金 (No. ZR2013CQ045) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)