杜允成，董文玥，姜進(jìn)舉，陳啟佳，馮進(jìn)輝，吳洽慶，朱敦明

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一種來源于PsJN的ω-轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)純化及性質(zhì)分析

杜允成1,2，董文玥1，姜進(jìn)舉1,2，陳啟佳1,2，馮進(jìn)輝1，吳洽慶1，朱敦明1

1 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室 天津 300308 2 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049

ω-轉(zhuǎn)氨酶 (ω-transaminase) 可以通過手性拆分和不對稱合成的催化反應(yīng)來獲得光學(xué)純的手性胺類化合物和非天然氨基酸，在醫(yī)藥中間體合成中是一種重要的生物催化劑。采用基因挖掘技術(shù)，在基因組數(shù)據(jù)庫中獲得一個來自伯克氏菌PsJN的ω-轉(zhuǎn)氨酶基因 ()，將該基因在大腸桿菌BL21 (DE3) 中克隆、表達(dá)，利用鎳柱親和層析將該酶 (HBP) 進(jìn)行純化并研究了其酶學(xué)性質(zhì)和底物譜。結(jié)果表明，以β-苯丙氨酸 (β-Phe) 為氨基供體、丙酮酸為氨基受體，HBP具有較高的活力 (33.80 U/mg) 和立體選擇性；其最適溫度為40 ℃左右，最適pH在8.0–8.5之間。研究過程中，建立了一種簡便快捷的紫外吸收法來檢測β-Phe的脫氨反應(yīng)，證明了該反應(yīng)的熱力學(xué)平衡性質(zhì)。底物譜研究表明HBP可以以β-Phe及其衍生物為氨基供體。結(jié)果表明HBP能夠有效地手性拆分-β-Phe及其衍生物，轉(zhuǎn)化率在50%左右，ee>99%。

ω-轉(zhuǎn)氨酶，伯克氏菌，芳香族β-氨基酸，手性拆分

轉(zhuǎn)氨酶 (EC 2.6.1.X) 又叫氨基轉(zhuǎn)移酶，是一種以磷酸吡哆醛 (PLP) 為輔酶，能夠?qū)被w的氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移至氨基受體羰基位置的生物催化劑[1]。根據(jù)轉(zhuǎn)氨酶作用的底物，轉(zhuǎn)氨酶可以分為α-轉(zhuǎn)氨酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶兩大類。與α-轉(zhuǎn)氨酶不同，ω-轉(zhuǎn)氨酶催化的兩個底物，至少有一個為非α-酮酸或者α-氨基酸 (圖1)[2]。ω-轉(zhuǎn)氨酶能夠通過手性拆分或者不對稱合成的方法催化合成光學(xué)純的手性胺類化合物和非天然氨基酸。由于醫(yī)藥和農(nóng)藥工業(yè)中，大約有40%的生物活性物質(zhì)都含有手性胺結(jié)構(gòu)[1]，因此，ω-轉(zhuǎn)氨酶在有機(jī)合成中是一種非常重要的生物催化劑。

圖1 ω-轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)

上世紀(jì)50年代，實驗證實了在哺乳動物中存在ω-轉(zhuǎn)氨酶催化的化學(xué)反應(yīng)[3]。1990年，Celgene公司在ω-轉(zhuǎn)氨酶研究方面取得了重大突破，實現(xiàn)了ω-轉(zhuǎn)氨酶催化手性胺類化合物的拆分[4]，這項研究極大地促進(jìn)了ω-轉(zhuǎn)氨酶的研究。在過去的20多年中，ω-轉(zhuǎn)氨酶催化合成手性胺類化合物及非天然氨基酸的研究廣受關(guān)注并取得了巨大的進(jìn)展[5-7]。1999年，Celgro公司以異丙胺和甲氧基異丙酮為底物，建立了ω-轉(zhuǎn)氨酶催化()-甲氧基丙胺的生產(chǎn)路線[8]；這是ω-轉(zhuǎn)氨酶工業(yè)生產(chǎn)農(nóng)用手性胺類藥物中間體的代表。2010年，美國Codexis和Merck公司，對ω-轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行了11輪的突變，成功實現(xiàn)了酶法催化西他列汀 (治療糖尿病藥物) 的合成工藝，徹底取代了重金屬銠催化的化學(xué)合成路線[9]；該成果獲得了2010年美國總統(tǒng)綠色化學(xué)獎，是生物催化工業(yè)應(yīng)用的一個里程碑。

根據(jù)ω-轉(zhuǎn)氨酶作用底物的立體構(gòu)型，可將ω-轉(zhuǎn)氨酶分為 ()-ω-轉(zhuǎn)氨酶和 ()-ω-轉(zhuǎn)氨酶。()-ω-轉(zhuǎn)氨酶作用于 ()-型底物，()-ω-轉(zhuǎn)氨酶作用于 ()-型底物。文獻(xiàn)報道較多的是 ()-ω-轉(zhuǎn)氨酶[5,10]，其中研究最廣泛、最透徹的是來自河流弧菌JS17的ω-轉(zhuǎn)氨酶，該酶有兩個底物結(jié)合口袋，大口袋能夠接受底物的苯環(huán)或者羧基基團(tuán)，小口袋對大于乙基的基團(tuán)具有嚴(yán)格的空間位阻效應(yīng)[11]；由于小口袋限制，大大縮小了其應(yīng)用范圍，Nobili等通過分子改造擴(kuò)大了這個酶的小口袋[12]。與 ()-ω-轉(zhuǎn)氨酶相比，()-ω-轉(zhuǎn)氨酶的數(shù)量屈指可數(shù)；直到2010年，H?hne等通過生物信息學(xué)分析，根據(jù)兩個Motif對6 000多條標(biāo)注為“L-分支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶”氨基酸序列進(jìn)行逐條分析，最終獲得了21條可能的 ()-ω-轉(zhuǎn)氨酶序列，實驗確定其中17條為 ()-ω-轉(zhuǎn)氨酶[13]；隨后，我們實驗室將兩個Motif合并，又成功挖掘出5個 ()-ω-轉(zhuǎn)氨酶[14]。()-ω-轉(zhuǎn)氨酶逐步豐富起來。

ω-轉(zhuǎn)氨酶不僅可以催化手性胺類化合物，還可以實現(xiàn)β-氨基酸的手性合成。雖然已有多種酶法合成β-氨基酸[15-18]，但由于ω-轉(zhuǎn)氨酶擁有反應(yīng)快速、底物譜廣泛以及不需要輔因子再生等優(yōu)勢，利用ω-轉(zhuǎn)氨酶合成β-氨基酸是一種更加理想的選擇。目前，能夠作用于芳香族β-氨基酸的ω-轉(zhuǎn)氨酶相對較少[19-23]，尋找新的ω-轉(zhuǎn)氨酶來催化獲得光學(xué)純的芳香族β-氨基酸具有重要意義。本文通過基因挖掘技術(shù)，獲得了一種來自PsJN的ω-轉(zhuǎn)氨酶，實現(xiàn)了芳香族β-氨基酸的手性拆分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及主要試劑

pET-32a(+) 質(zhì)粒購自Novagen公司；蛋白胨和酵母提取物均來自BD公司；Bradford BCA蛋白濃度試劑盒購自康為世紀(jì)公司；考馬斯亮藍(lán)R250購自Solarbio公司。氨基供體底物，-β-Phe (Alfa Aeser)、()-β-Phe (百靈威科技有限公司)，-3-氨基-3-(4-氟苯基) 丙酸 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、-3-氨基- 3-(4-甲氧基苯基) 丙酸 (上海韶遠(yuǎn)化學(xué)科技有限公司)、-3-氨基-3-(4-甲基苯基) 丙酸 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、-3-氨基-3-(4-硝基苯基) 丙酸 (sigma公司)、-3-氨基-3-(4-羥基苯基) 丙酸 (上海韶遠(yuǎn)化學(xué)科技有限公司)、-3-氨基-4-甲基戊酸 (阿拉丁)、()-苯乙胺 (Alfa Aesar)、-2-戊胺 (TCI)；氨基受體底物丙酮酸 (Alfa Aesar)、α-酮戊二酸 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、丙酮酸乙酯 (Alfa Aesar)、苯甲醛 (Alfa Aesar)、乙醛酸 (百靈威科技有限公司)、苯乙酮 (Alfa Aesar)、其他氨基受體 (sigma公司)。

1.1.2 主要儀器

高壓勻漿破碎儀購自德國APV公司；RC6+高速冷凍離心機(jī)購自Thermo公司；凝膠成像系統(tǒng)購自BIO-RAD公司；?KTA purifier 10，所用層析柱均為GE公司；高效液相色譜儀 (HPLC 1260)，購自Agilent公司；酶標(biāo)儀 (SpectraMax M2e)。

1.2 基因挖掘

通過文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)來自根瘤菌屬sp. LUK的 ()-立體選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶能夠以β-Phe為氨基供體，以丙酮酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸為氨基受體進(jìn)行反應(yīng)[20]，表明這個酶能夠催化芳香族β-氨基酸，并且有比較寬的氨基受體底物譜。因此，以來自sp. LUK的ω-轉(zhuǎn)氨酶蛋白序列(EF127643.1) 為模板，在NCBI(http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 中進(jìn)行Blastp (默認(rèn)設(shè)置) 搜索，來挖掘能夠作用于芳香族β-氨基酸的ω-轉(zhuǎn)氨酶。從Blast結(jié)果列表中選擇了一條來自PsJN，標(biāo)注為“class III aminotransferase”的候選蛋白序列 (YP_001890102.1，將該蛋白序列在N端加上His6后命名為HBP)，與已經(jīng)報道的能夠作用于芳香族β-氨基酸的ω-轉(zhuǎn)氨酶(分別來自sp. LΜK[20]胞菌屬sp. JS666[21]和爭論貪噬菌屬[22]、伯克氏菌屬[23]) 進(jìn)行Pr-Blast，HBP與之同源性都較高，分別為51%、55%、59%、83%。通過在線的jcat密碼子優(yōu)化程序 (http://www.jcat.de)，對HBP的原始基因序列進(jìn)行了針對(K12) 表達(dá)的密碼子優(yōu)化，在N端加上His6標(biāo)簽，目的基因直接合成至pET-32a原核表達(dá)載體的Ⅰ (691 bp處) 與HⅠ酶切位點之間。

1.3 目的蛋白的表達(dá)純化

工程菌構(gòu)建：將重組載體pET-32a-轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中。

誘導(dǎo)表達(dá)：將工程菌接種到裝有LB液體培養(yǎng)基 (Amp含量100 μg/mL) 的三角瓶 (800 mL/瓶) 里，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)搖床 (200 r/min) 中培養(yǎng)至對數(shù)期 (600為0.6–1.0)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，置于25 ℃、200 r/min的恒溫培養(yǎng)搖床中誘導(dǎo)表達(dá)12 h。

收菌破胞：將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心并收集菌體，用冰浴過的磷酸鈉緩沖液 (50 mmol/L，pH 7.0) 清洗菌體兩遍；之后將菌體用100 mL冰浴過的破胞緩沖液重懸，破胞緩沖液為磷酸鈉緩沖液 (50 mmol/L，pH 7.0)，其中添加有20 μmol/L磷酸吡哆醛 (PLP)、1 mmol/L的PMSF、0.01% (/) 的β-巰基乙醇、30 mmol/L咪唑和500 mmol/L氯化鈉；重懸好的菌液用高壓勻漿機(jī) (提前預(yù)冷至4 ℃) 進(jìn)行細(xì)胞破碎。

純化透析：將細(xì)胞破碎液離心收集破菌上清液 (呈淡黃色)，用0.45 μm的濾器過濾。純化過程主要在?KTA蛋白質(zhì)純化儀上進(jìn)行，所用層析柱為Ni-NTA親和層析柱 (實驗室自裝10 mL手工柱)，純化用到的緩沖液主要為上樣溶液A (pH 7.0的50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液，含有30 mmol/L咪唑和500 mmol/L的氯化鈉) 和洗脫溶液B (pH 7.0的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液，含有500 mmol/L咪唑和500 mmol/L氯化鈉)，采用咪唑線性濃度對目的酶蛋白進(jìn)行洗脫；得到純酶后對其進(jìn)行透析，透析緩沖液為含有20 μmol/L的PLP和0.01% (/) 的β-巰基乙醇的磷酸鈉緩沖液 (50 mmol/L，pH 7.0)，透析過程在4 ℃環(huán)境進(jìn)行；透析完成之后，所得純酶溶液加入10%的甘油后分裝密封后保存在–80 ℃冰箱中冷藏備用。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)測定

1.4.1 反應(yīng)體系

典型的反應(yīng)體系：體積為1 mL的含有PLP (20 μmol/L)、氨基供體-β-Phe、氨基受體丙酮酸的緩沖液 (100 mmol/L)，在水浴中孵育至與設(shè)定溫度相同后，加入6.6 μg的HBP純酶啟動反應(yīng)，反應(yīng)5 min后，取100 μL的反應(yīng)液加入200 μL的丙酮終止反應(yīng)。丙酮中含有30 mmol/L的1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺 (氨基酸衍生劑，參見FDAA，Marfey’s Reagent說明書)，然后加入40 μL的1 mol/L碳酸氫鈉溶液，混勻，在40 ℃加熱1 h，冷卻至室溫后，加入20 μL的2 mol/L鹽酸溶液。衍生完成后，底物-β-Phe的減少和產(chǎn)物丙氨酸的生成通過HPLC進(jìn)行測定。HPLC檢測條件為：色譜柱為Eclipse XDB-C18 column (4.6 mm×150 mm，Agilent)，流動相為三乙胺溶液 (50 mmol/L三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)∶乙腈=62.5∶37.5，等度洗脫，流速為0.8 mL/min，檢測波長為 340 nm。

1.4.2 最適反應(yīng)pH及其最適反應(yīng)溫度

最適反應(yīng)pH的測定：采用典型的反應(yīng)體系，氨基供體-β-Phe和氨基受體丙酮酸的濃度分別為20 mmol/L和10 mmol/L，反應(yīng)溫度為37 ℃，其余保持不變。以pH為變量，測定在一系列pH (6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0) 的條件下底物 (-β-Phe) 的減少量，通過比較不同pH條件下氨基底物的減少，來表征pH對該酶活力的影響。用到的 pH緩沖液 (濃度皆為100 mmol/L) 為醋酸鈉緩沖液(pH 3.8–5.6)、磷酸鈉緩沖液 (pH 5.8–7.6)、硼酸硼砂緩沖液 (pH 7.8–9.2) 和硼砂氫氧化鈉緩沖液 (pH 9.3–10.1)。

最適反應(yīng)溫度的測定：采用典型的反應(yīng)體系，反應(yīng)pH為上述測定的最適反應(yīng)pH (8.2)，氨基供體-β-Phe和氨基受體丙酮酸的濃度分別為20 mmol/L和10 mmol/L，其余保持不變。以反應(yīng)溫度為變量，測定在一系列溫度 (25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃) 條件下底物的減少量，通過比較不同反應(yīng)溫度條件下底物-β-Phe的減少，來表征反應(yīng)溫度對該酶活力的影響。

1.4.3 pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性

pH穩(wěn)定性的測定：采用典型反應(yīng)體系，氨基供體-β-Phe和氨基受體丙酮酸的濃度分別為20 mmol/L和10 mmol/L，反應(yīng)溫度為1.4.2測定的最適反應(yīng)溫度 (40 ℃)，但是反應(yīng)所用的酶分別在不同pH的緩沖液中進(jìn)行酸堿處理。具體為：將多份酶分別置于pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的緩沖液中處理24 h (室溫25 ℃)，之后測定不同pH處理24 h之后的殘留酶活力。通過比較各反應(yīng)氨基供體底物-β-Phe的減少，便可以計算出經(jīng)過不同pH處理之后的酶活損失情況。使用的pH緩沖液 (濃度皆為100 mmol/L) 為醋酸鈉緩沖液 (pH 3.8–5.6)、磷酸鈉緩沖液 (pH 5.8–7.6)、硼酸硼砂緩沖液 (pH 7.8–9.2) 和硼砂氫氧化鈉緩沖液 (pH 9.3–10.1)。

溫度穩(wěn)定性的測定：采用典型反應(yīng)體系 (氨基供體-β-Phe和氨基受體丙酮酸的濃度分別為20 mmol/L和10 mmol/L)，反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH均為最適反應(yīng)條件 (40 ℃、pH 8.2)，但是反應(yīng)所用的酶經(jīng)過不同溫度的熱處理。具體為：將多份酶液 (50 mmol/L磷酸鈉緩沖體系，pH 7.0) 分別置于30 ℃、 35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55℃和60 ℃溫度下熱處理20 min，測定不同溫度下熱處理之后的殘留酶活力。通過比較各反應(yīng)底物減少，來表示不同溫度熱處理之后的酶活損失情況。

1.4.4 動力學(xué)參數(shù)和底物抑制測定

HPLC檢測該反應(yīng) (圖2) 擁有精確度高的優(yōu)點，已有報道中檢測-β-Phe脫氨反應(yīng) (圖2) 也都采用HPLC方法，但這種方法十分費時耗力。因此，本研究建立了一種紫外吸收法來測定該酶的酶活，并成功應(yīng)用于動力學(xué)參數(shù)的測定中。

圖2 HBP手性拆分rac-β-Phe

首先，由于產(chǎn)物C (3-羰基-3-苯基丙酸) 能夠自發(fā)脫羧，是一種不穩(wěn)定的β-酮酸類化合物[24]，因此研究了溫度對該化合物C穩(wěn)定性的影響以及產(chǎn)物C的自發(fā)脫羧速率。溫度對化合物C的影響：脂肪酶Nov435水解其酯而制備產(chǎn)物C (圖3)，水解完全后，將其置于不同的溫度下處理2 h，此段時間內(nèi)，產(chǎn)物C進(jìn)行脫羧反應(yīng)；2 h后，通過得到苯乙酮的量來計算其分解產(chǎn)率，分解產(chǎn)物苯乙酮是通過HPLC進(jìn)行檢測的。分解速率的確定：將產(chǎn)物C置于HPLC的樣品盤中，每隔0.5 h檢測一次樣品，來測定此時苯乙酮的量；12 h后，100 ℃加熱0.5 h，使產(chǎn)物C全部脫羧分解為苯乙酮，來確定苯乙酮的總量。HPLC檢測條件為：色譜柱為Eclipse XDB-C18 column (4.6 mm×150 mm，Agilent)，流動相為水∶乙腈=1∶1，等度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長為205 nm。

其次，產(chǎn)物C有一種特殊的超級共軛結(jié)構(gòu)，表明產(chǎn)物C有特殊的紫外吸收，我們將200 μL (緩沖液為200 mmol/L的硼酸硼砂緩沖液) 的底物和產(chǎn)物 (10 mmol-β-Phe、10 mmol丙酮酸、0.5 mmol 3-羰基-3-苯基丙酸) 分別在酶標(biāo)儀上進(jìn)行紫外掃描，檢測產(chǎn)物C的特殊紫外吸收情況，來確定檢測該反應(yīng)的合適波長。確定好檢測波長之后，測定底物及產(chǎn)物濃度和紫外吸收的關(guān)系，最終確定200 μL反應(yīng)體系中，反應(yīng)速率和紫外吸收之間的關(guān)系。

再次，在同樣的反應(yīng)體系中 (10 mmol底物，pH 8.2，濃度為100 mmol的硼酸硼砂緩沖液)，加入純酶3.5 μg/mL，分別用酶標(biāo)儀和HPLC來測定反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率情況，進(jìn)行比較，來驗證方法的可行性。

最后，方法確定后，用酶標(biāo)儀檢測不同底物濃度條件下的反應(yīng)初速度。反應(yīng)在200 mmol/L硼酸硼砂緩沖液 (pH 8.2)、室溫25 ℃的條件下進(jìn)行 (注：測定動力學(xué)常數(shù)時，使用的是第二批次純化的酶，其他實驗均為第一批次純化的酶)。具體操作為：將1.89 μg的純酶加入到96微孔板中，隨后加入不同濃度的底物 (終體積為200 μL) 啟動反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測該反應(yīng)體系的紫外吸收變化，檢測波長290 nm，時間為1 min，間隔為10 s，這樣便可以測定不同底物濃度下的反應(yīng)初速度。底物濃度的具體變化情況：當(dāng)測定HBP對-β-Phe的動力學(xué)參數(shù)和底物抑制時，固定氨基受體丙酮酸的濃度為50 mmol/L，使-β-Phe的濃度為唯一變量，測定反應(yīng)初速度；當(dāng)測定氨基受體丙酮酸時，固定氨基供體-β-Phe的濃度為10 mmol/L，使丙酮酸的濃度為唯一變量。

酶活的定義：25 ℃下，在含有10 mmol/L-β-Phe和10 mmol/L丙酮酸的反應(yīng)體系中，1 min內(nèi)催化生成1 μmol產(chǎn)物 (丙氨酸或3- 羰基-3-苯基丙酸) 所需要的酶量，即1 U= 1 μmol/min。

1.5 底物譜的測定

HBP的氨基供體底物特異性采用典型的反應(yīng)體系進(jìn)行測定，但氨基供體更換成表2中的氨基化合物，濃度為10 mmol/L，丙酮酸的濃度為10 mmol/L，反應(yīng)溫度為40 ℃，pH 8.2 (100 mmol/L硼酸硼砂緩沖液)。反應(yīng)5 min后，用HPLC檢測產(chǎn)物丙氨酸的生成量來標(biāo)定反應(yīng)進(jìn)行的程度，檢測條件與1.4.1相同。丙氨酸的生成量越多，說明反應(yīng)速度越快，酶活越高。其中，以-β-Phe為底物的反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)，將該反應(yīng)丙氨酸的生成量設(shè)定為100%，其他氨基供體的活力采用相對活力來表示，即相對活力=其他氨基底物丙氨酸的生成量除以-β-Phe反應(yīng)體系中丙氨酸的生成量×100%。測定氨基受體時，底物反之，條件亦然，反應(yīng)結(jié)束后，用HPLC檢測底物-β-Phe的減少量來標(biāo)定反應(yīng)進(jìn)行的程度。

1.6 rac-β-Phe及其衍生物的手性拆分

采用典型的反應(yīng)體系，氨基供體 (-β-Phe或其衍生物) 和丙酮酸的濃度均為10 mmol/L，反應(yīng)溫度為室溫25 ℃，pH為8.2 (100 mmol/L硼酸硼砂緩沖液)，加入66 μg的純酶啟動反應(yīng)，反應(yīng)12 h后，用HPLC檢測產(chǎn)物的ee值和底物的轉(zhuǎn)化率。ee值的檢測條件與1.4.1條件一致；轉(zhuǎn)化率的檢測條件：色譜柱為CROWNPAK CR (+) column (4.0 mm×150 mm，5 μm)，流動相為高氯酸水溶液 (加入10%甲醇，pH 1.5)，流速為0.5 mL/min，等度洗脫，檢測210 nm條件下的紫外吸收值。

2 結(jié)果與討論

2.1 序列比對分析

HBP與已經(jīng)報道的能夠作用于芳香族β-氨基酸的ω-轉(zhuǎn)氨酶 (分別來自sp. LUK、sp. JS666、和) 進(jìn)行Pr-Blast，HBP與之同源性都較高，分別為51%、55%、59%和83%。這說明HBP極有可能作用于芳香族β-氨基酸。

2.2 HBP的表達(dá)純化

將重組載體pET32a (+)-轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3) 中表達(dá)純化，經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析，0.1 mmol IPTG、25 ℃誘導(dǎo)可以表達(dá)出大量的可溶性蛋白，經(jīng)過鎳柱純化后即可除去大量雜質(zhì)，得到純酶；HBP的單亞基分子量約為45 kDa (圖4)，分子排阻實驗測得該酶的分子量約為91.5 kDa，說明HBP由兩個相同的亞基組成，與報道的大多數(shù)ω-轉(zhuǎn)氨酶相同[25-26]。

圖4 HBP的SDS-PAGE電泳檢測

2.3 HBP的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度

HBP的最適反應(yīng)pH是通過測定其在不同的反應(yīng)pH條件下的活力來確定的。觀察實驗結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)HBP喜堿厭酸，這一現(xiàn)象與已經(jīng)報道的ω-轉(zhuǎn)氨酶相似[27-28]；HBP的最適反應(yīng)pH在8.0–8.5之間 (圖5a)。

圖5 pH和溫度對HBP活力的影響

選取pH 8.2的條件研究HBP的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃左右 (圖5b)，因此后續(xù)反應(yīng)在此條件下進(jìn)行。

2.4 HBP的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性

HBP的穩(wěn)定性是通過測定不同溫度和pH條件處理后的殘余活力來測定的。pH在6.0–10.0之間時，HBP的活性能夠保持70%以上，而當(dāng)pH降到酸性pH 5.0的時候，HBP的活力只有處理前的20%，表明酶的結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了嚴(yán)重變化，喪失了大部分活力 (圖5c)。

由圖5d可以看出溫度對HBP穩(wěn)定性的影響，在當(dāng)溫度低于50 ℃時，HBP的活力均能保持在80%以上，此時酶比較穩(wěn)定；然而，當(dāng)溫度高于50 ℃后，活力出現(xiàn)大幅度下降，該酶不再穩(wěn)定，溫度到達(dá)60 ℃時，幾乎喪失了全部活力。因此，在HBP的研究或應(yīng)用過程中應(yīng)該避免50 ℃以上的高溫。

2.5 HBP的動力學(xué)參數(shù)和底物抑制情況

2.5.1 3-羰基-3-苯基丙酸的分解情況

β-酮酸是一種容易自發(fā)脫羧的不穩(wěn)定化合物[24]，因此我們研究了溫度對產(chǎn)物C (3-羰基-3-苯基丙酸) 穩(wěn)定性的影響。產(chǎn)物C的穩(wěn)定性與溫度呈負(fù)相關(guān) (圖6a)，不同溫度處理2 h后其分解產(chǎn)物苯乙酮隨著溫度的升高而增加；室溫條件下，只有3%左右的酮酸產(chǎn)物C分解成苯乙酮，而當(dāng)溫度上升到60 ℃時，有65%左右的酮酸C分解成苯乙酮。產(chǎn)物C在25 ℃條件下的分解速率為0.03 %/min (圖6b)，分解速率極其緩慢，1 min內(nèi)的分解對檢測的影響可以忽略。實驗初期，我們誤以為該反應(yīng)的主要推動力是產(chǎn)物C的減少；然而實驗表明，產(chǎn)物C在室溫25 ℃放置12 h后，大部分并沒有分解 (大約14%分解)，說明該反應(yīng)平衡的主要推動力并不是產(chǎn)物的減少，而是該反應(yīng)在此條件下的固有性質(zhì)，即該反應(yīng)的熱力學(xué)平衡極其偏向于丙氨酸生成一方。這一結(jié)果，加深了我們對該反應(yīng)歷程的理解，對該反應(yīng)的后續(xù)研究具有指導(dǎo)意義。

圖6 溫度對C分解的影響和分解速率

2.5.2 反應(yīng)底物和產(chǎn)物的濃度與紫外吸收的關(guān)系

通過紫外全波長掃描，產(chǎn)物C在250 nm左右有最大的紫外吸收 (圖7a)，但是底物丙酮酸和β-Phe在250 nm下同樣具有較強(qiáng)的紫外吸收；考慮到儀器的量程和背景吸收的問題，因此我們選擇在290 nm的波長下進(jìn)行檢測。此條件下，底物和產(chǎn)物C的紫外吸收與濃度呈線性關(guān)系，符合朗伯比爾定律 (圖7b、7c、7d)。由此我們可以計算出在200 μL的反應(yīng)體系 (pH 8.2硼酸硼砂緩沖液) 下，底物濃度變化1.0 mmol/L，△290為0.73。

圖7 底物和產(chǎn)物的全波長及其OD290與其濃度的關(guān)系

由此可知，酶的比活力計算公式為：

每分鐘紫外吸收的變化(△290/△)×反應(yīng)液總體積(L)/(0.73×酶量)。

其中，時間的單位為min，反應(yīng)液總體積為常數(shù)200 μL，酶量的單位為mg。

2.5.3 紫外吸收法和HPLC方法的比較

相同條件下，酶標(biāo)儀測定反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為5.97%±0.57%，HPLC測定反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為5.77%±0.44%。兩種方法測量的結(jié)果差距較小，因此可以采用紫外吸收法測定該反應(yīng)的反應(yīng)速率。并且計算得到酶活為33.80 U/mg。

2.5.4 底物濃度對酶活的影響

采用以上建立的紫外吸收法，測定不同底物濃度條件下反應(yīng)的酶活，這樣不僅可以計算出HBP的動力學(xué)參數(shù)，還可以了解底物的抑制情況。根據(jù)不同底物濃度下的反應(yīng)初速度，由sigmaplot軟件計算出HBP對-β-Phe和丙酮酸的m分別是1.6 mmol/L和8.6 mmol/L，cat分別為142.3 s–1和148.5 s–1，此時max分別為 88.5 μmol/min·mg和92.9 μmol/min·mg (圖8)。底物濃度升高時，顯示出微弱的底物抑制現(xiàn)象，當(dāng)-β-Phe的濃度增加到80 mmol時，其活力為83.28 μmol/min·mg；當(dāng)丙酮酸的濃度升高到 200 mmol時，其反應(yīng)速率為70.98 μmol/min·mg。

圖8 HBP對底物的米氏方程曲線

2.6 HBP的底物譜情況

2.6.1 氨基供體底物譜

HBP的氨基供體特性是以丙酮酸為氨基受體來測定的。由表1可以看出HBP對不同種類的芳香族β-氨基酸都有活性，并且活力差別不大，比較A5和A6，這兩種底物的側(cè)鏈都是給電子基團(tuán)，A5的活力低于A1，A6的活力高于A1，因此，芳香族β-氨基酸苯環(huán)側(cè)鏈的不同，對位基團(tuán)的供給電子能力并不能對反應(yīng)活性造成絕對的影響，反應(yīng)活力的高低取決于底物和酶的綜合性相互作用。比較特別的是，HBP對脂肪族β-氨基酸A8沒有活性，卻對含有支鏈的脂肪族β-氨基酸A7活力較高，表明HBP的小口袋比較大，只能接受側(cè)鏈相對較大的基團(tuán)，不能接受側(cè)鏈比較小的基團(tuán)。有意思的是，對于典型的氨基供體A9 (苯乙胺)，幾乎所有報道的ω-轉(zhuǎn)氨酶都對其表現(xiàn)出高活性[5,11]，但是HBP對其卻沒有任何活性。由上可知，HBP催化的底物比較專一，對芳香族β-氨基酸和支鏈的脂肪族β-氨基酸有特異性。

表1 HBP的氨基供體底物譜

Table 1 Amino donors specificity of HBP

2.6.2 氨基受體底物譜

HBP的氨基受體底物特性是以-β-Phe為氨基供體來測定的。結(jié)果顯示，與其他能夠作用于芳香族β-氨基酸的轉(zhuǎn)氨酶[20-22,25]相似，HBP能夠作用于含有羧酸基團(tuán)的底物B1、B2和B3，并且表現(xiàn)出完美的立體選擇性，相對應(yīng)的產(chǎn)物ee值在99%以上。對于B4，HBP表現(xiàn)出較高的活力，有意思的是，檢測到B4對應(yīng)的產(chǎn)物為L-Ala，由于檢測條件是堿性的，底物B4和其對應(yīng)的產(chǎn)物都是酯類，所以無法確定HBP能否以丙酮酸乙酯為氨基受體；可以推測，此反應(yīng)存在兩種可能：第一，HBP以B4為底物，反應(yīng)生成手性的丙氨酸乙酯在堿性條件下水解生成L-Ala；第二，HBP不能以B4為底物進(jìn)行反應(yīng)，而是底物B4在堿性條件下先水解成丙酮酸，然后HBP以丙酮酸為底物進(jìn)行反應(yīng)。對于B5，其對應(yīng)的產(chǎn)物是具有應(yīng)用價值的γ-氨基酸[29]，可惜的是當(dāng)HBP以-β-Phe作為氨基供體時，得到的兩種產(chǎn)物 (3-氨基-3-苯基丙酸和4-氨基- 4-苯基丁酸) 結(jié)構(gòu)上非常相似從而很難分離；對于醛類B6是一種廉價從而非常適合進(jìn)行拆分的氨基受體。有趣的是，HBP對B7沒有活性，B7與B1相比，擁有更小的位阻，理論上應(yīng)該具有相似的活性，但是HBP對B7沒有活力，我們推測其底物結(jié)合口袋處，有一些特殊的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致這一現(xiàn)象，希望之后能夠通過三維結(jié)構(gòu)得到解釋；其他底物，B8到B13，其中有一些和標(biāo)準(zhǔn)底物 (β-Phe和丙酮酸) 的結(jié)構(gòu)很相近，但是HBP對這些底物都沒有催化活性。總之，HBP催化的底物相對比較專一，只對特有的底物有活力。

表2 HBP的氨基受體底物譜

Table 2 Amino acceptors specificity of HBP

2.7 rac-β-Phe及其衍生物的手性拆分

-β-Phe及其衍生物的手性拆分是在典型的反應(yīng)體系中測定的。首先我們測定HBP對 10 mmol/L的-β-Phe及其衍生物的拆分情況。反應(yīng)12 h后，檢測結(jié)果如表3所示，結(jié)果顯示，對于-β-Phe及其不同的衍生物，HBP均能有效地將其進(jìn)行手性拆分，最終得到光學(xué)純的芳香族β-氨基酸產(chǎn)物。其轉(zhuǎn)化率均在50%左右，ee>99%。

表3 HBP動力學(xué)拆分-β-Phe及其衍生物

Table 3 Preparation of ()-Phe and its derivatives using HBP-catalyzed kinetic resolution of racemic substrates

為了進(jìn)一步研究HBP手性拆分芳香族β-氨基酸的能力，選取-β-Phe為代表，逐步提高底物的濃度；采用典型的反應(yīng)體系，但有一些不同，緩沖液采用200 mmol/L的硼酸硼砂緩沖液 (通過增加緩沖液的濃度來增加緩沖液的緩沖能力，pH 8.2)。底物-β-Phe的濃度增加到100 mmol/L (接近飽和) 時，氨基受體采用 100 mmol/L的丙酮酸鈉 (丙酮酸鈉取代丙酮酸，防止pH變化過大)；反應(yīng)進(jìn)行7 h，β-Phe的ee值大于99%，說明HBP可以將100 mmol/L的-β-Phe有效地拆分 (圖9)。當(dāng)我們繼續(xù)增加底物濃度，到150 mmol/L時，反應(yīng)初期底物-β-Phe處于溶解平衡狀態(tài)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，-β-Phe逐漸溶解，反應(yīng)體系逐漸清澈，24 h后補(bǔ)加66 μg的純酶，總反應(yīng)進(jìn)行36 h時，ee值達(dá)到97.47%。

圖9 HBP動力學(xué)拆分100 mmol/L的rac-β-Phe

2.8 幾種不同ω-轉(zhuǎn)氨酶的性質(zhì)比較

根據(jù)前面的實驗結(jié)果，我們將HBP與最近報道的能夠作用于芳香族β-Phe的ω-轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行了簡單的比較。通過比較發(fā)現(xiàn)，HBP的最適反應(yīng)溫度與其他幾個酶比較相似，最適反應(yīng)pH都偏向于堿性條件。手性拆分的底物濃度比較高 (150 mmol)，不足之處在于不能進(jìn)行β-Phe的不對稱合成 (表4)。

表4 幾種不同ω-轉(zhuǎn)氨酶的性質(zhì)比較

Table 4 Comparison of different ω-transaminases

3 結(jié)論

本研究中，采用基因挖礦的方法從 NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了一個來自PsJN的新型 () 立體選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，并將其在BL21 (DE3) 中進(jìn)行異源表達(dá)，之后測定了HBP的酶學(xué)性質(zhì)、動力學(xué)參數(shù)并研究了其底物譜。HBP最適反應(yīng)pH在8.0–8.5之間，最適反應(yīng)溫度為40 ℃。測定過程中，建立了一種簡便快捷的檢測方法，加深了我們對β-Phe脫氨反應(yīng)熱力學(xué)平衡的認(rèn)識。此酶表現(xiàn)出嚴(yán)格的 () 立體選擇性和相對專一的底物選擇性。對于氨基供體，HBP能特異性地識別側(cè)鏈比較大的芳香族β-氨基酸，包括芳香族β-氨基酸和帶有支鏈的脂肪族β-氨基酸，與已經(jīng)報道的ω-轉(zhuǎn)氨酶不同的是，HBP不能以苯乙胺為氨基供體。對于氨基受體，該酶對比較常見的氨基受體丙酮酸的活力較高，能夠以B5 (4-羰基-4-苯基丁酸) 為氨基受體，不對稱合成芳香族γ-氨基酸，遺憾的是我們尚未發(fā)現(xiàn)理想的氨基供體?？傮w而言，HBP是一種可以有效地拆分芳香族β-氨基酸的生物催化劑。

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Expression and characterization of a novel ω-transaminase fromPsJN

Yuncheng Du1,2, Wenyue Dong1, Jinju Jiang1,2, Qijia Chen1,2, Jinhui Feng1, Qiaqing Wu1, and Dunming Zhu1

1 National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 2 College of Life Science, University of Chinese academy of science, Beijing 100049, China

Production of chiral amines and unnatural amino-acid using ω-transaminase can be achieved by kinetic resolution and asymmetric synthesis, thus ω-transaminase is of great importance in the synthesis of pharmaceutical intermediates. By genomic data mining, a putative ω-transaminase genewas found inPsJN. The genewas cloned and over-expressed inBL21 (DE3). The recombinant enzyme (HBP) was purified by Ni-NTA column and its catalytic properties and substrate profile were studied. HBP showed high relative activity (33.80 U/mg) and enantioselectivity toward β-phenylalanine (β-Phe). The optimal reaction temperature and pH were 40 ℃ and 8.0–8.5, respectively. We also established a simpler and more effective method to detect the deamination reaction of β-Phe by UV absorption method using microplate reader, and demonstrated the thermodynamic property of this reaction. The substrate profiling showed that HBP was specific to β-Phe and its derivatives as the amino donor. HBP catalyzed the resolution of-β-Phe and its derivatives, the products ()amino acids were obtained with about 50% conversions and 99%.

ω-transaminase,PsJN, aromatic β-amino acids, chiral resolution

October 27, 2015; Accepted: February 17, 2016

杜允成, 董文玥, 姜進(jìn)舉, 等. 一種來源于PsJN的ω-轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)純化及性質(zhì)分析. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(7): 912–926.

Du YC, Dong WY, Jiang JJ, et al. Expression and characterization of a novel ω-transaminase fromPsJN. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 912–926.

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB710800).

Corresponding authors: Qiaqing Wu. Tel: +86-22-84861963; Fax: +86-22-84861996; E-mail: wu_qq@tib.cas.cn

Dunming Zhu. Tel: +86-22-84861962; Fax: +86-22-84861996; E-mail: zhu_dm@tib.cas.cn

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CB710800) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)