張文政，唐繼軍，李炳志，元英進

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釀酒酵母基因組位置效應對外源基因表達的影響

張文政1,2，唐繼軍2,3，李炳志1,2，元英進1,2

1 天津大學 系統(tǒng)生物學教育部重點實驗室，天津 300072 2 天津大學 化工學院 天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072 3 天津大學 計算機與科學技術(shù)學院，天津 300072

外源基因元件和模塊在底盤細胞中發(fā)揮特定功能是合成生物學研究的基本過程，而外源元件和模塊在基因組中的位置對其功能的實現(xiàn)具有顯著影響。為了系統(tǒng)、全面地表征釀酒酵母基因組位置效應對外源基因的表達影響，以綠色熒光蛋白為報告基因，通過雙交換同源重組方法，對釀酒酵母單基因敲除庫進行高通量轉(zhuǎn)化，構(gòu)建釀酒酵母基因組單位點熒光標記菌株庫。結(jié)合流式細胞術(shù)和高通量測序技術(shù)對單位點熒光標記庫菌株進行分析，構(gòu)建高表達位點庫和低表達位點庫，共發(fā)現(xiàn)促進綠色熒光蛋白表達的位點428個，抑制綠色熒光蛋白表達的位點444個。通過分析高、低表達位點在酵母染色體上的分布，從全基因組尺度上對釀酒酵母基因組整合位置對基因表達的影響進行表征。本研究可為釀酒酵母基因組位置效應的分布規(guī)律和產(chǎn)生機理研究提供重要參考，對外源蛋白工業(yè)生產(chǎn)和合成生物學中的基因表達精細調(diào)控也具有重要的指導意義。

合成生物學，釀酒酵母，染色體位置效應，外源基因表達

釀酒酵母具有蛋白翻譯后修飾功能，適合復雜結(jié)構(gòu)蛋白的表達和功能發(fā)揮，被廣泛應用于復雜化合物的生產(chǎn)[1-3]。合成生物學領(lǐng)域的最新研究進展表明，外源基因元件和模塊能夠在釀酒酵母細胞中發(fā)揮功能，實現(xiàn)復雜天然化合物的生 產(chǎn)[4-6]。外源基因元件或模塊通常以游離型質(zhì)粒為載體存在于釀酒酵母細胞中，或插入釀酒酵母基因組。與游離型質(zhì)粒相比，將外源基因元件或模塊整合至酵母基因組具有可精確控制拷貝數(shù)、穩(wěn)定強、無需抗生素或其他化合物的添加以維持篩選壓力等優(yōu)點。然而研究表明，釀酒酵母基因組對外源基因的表達存在明顯的位置效應[7]，與插入位點相關(guān)的表觀遺傳效應能夠影響外源基因的表達，插入本身可能會激活或者抑制某些基因，造成內(nèi)源基因的異常表達和有毒代謝產(chǎn)物的積累。因此釀酒酵母基因組位置效應對外源基因表達的影響的研究具有重要意義。

目前，研究人員已在多種生物體系中發(fā)現(xiàn)基因組位置效應的存在，如大腸桿菌[8]、釀酒酵 母[9-10]、乳酸乳球菌[11]、果蠅[12]和人類細胞[13]等。Yamane等[9]以為報告基因，將其整合至酵母Ⅲ號染色體的不同位點，通過測定β-半乳糖苷酶的活性表征的轉(zhuǎn)錄水平，對酵母Ⅲ號染色體的位置效應進行了研究；Bai等[10]采用類似的方法，在釀酒酵母基因組上選取了20個可能適合外源基因整合的位點，對插入這些位點的基因的表達情況進行了測定，發(fā)現(xiàn)不同位點間的表達水平存在明顯差異，最高可達20倍；Thomoson等[14]的研究則采用了一種隨機插入的策略，并未對報告基因的插入位置進行確定。上述研究僅對釀酒酵母的位置效應對外源基因表達的影響進行了初步探索，研究局限于有限位點或單條染色體，缺乏對整個釀酒酵母基因組的位置效應系統(tǒng)、全面的探究。

釀酒酵母單基因敲除庫 (Yeast konck-out collection，簡寫為YKO)[15]含有菌株4 817株，每個菌株均有1個非必需基因的開放閱讀框 (ORF) 被表達盒替代，具有G418抗性。表達盒上下游各含有一個長度為20 bp的“條碼區(qū)”識別區(qū)，用于特異性識別被替換的非必需基因。本研究通過同源重組將表達盒替換為報告基因，結(jié)合流式細胞分選技術(shù)和高通量測序技術(shù)，構(gòu)建釀酒酵母單位點熒光標記庫、高表達位點庫和低表達位點庫，實現(xiàn)對釀酒酵母基因組多位點上外源基因表達水平差異的表征。本研究方法具有高通量、能夠精準定位插入位置的特點，不僅能夠篩選出增強和抑制外源基因表達的位點，而且能夠從基因組尺度上揭示酵母位置效應的分布規(guī)律和產(chǎn)生機理。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

實驗背景菌株均為S288c 菌株 BY4741 ()[16]。以BY4741為背景菌株的酵母單基因敲除庫由美國Jef D. Boeke教授實驗室保存饋贈。大腸桿菌質(zhì)粒pUC19[17]，酵母復制型質(zhì)粒pRS416[18]，均為本實驗室保存。帶有基因的質(zhì)粒pGRB2.3由美國Brendan Cormack教授實驗室保存饋贈。用于質(zhì)粒擴增的菌株為大腸桿菌DH5α，購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

YPD培養(yǎng)基組成成分為10 g/L酵母浸粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖。SD培養(yǎng)基組成成分為6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源，2 g/L氨基酸混合物，20 g/L葡萄糖，20 mg/L組氨酸，20 mg/L色氨酸，SD-URA缺陷型培養(yǎng)基添加100 mg/L亮氨酸，SD-LEU缺陷型培養(yǎng)基添加20 mg/L尿嘧啶，用10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5。LB培養(yǎng)基組成成分為10 g/L 氯化鈉，5 g/L酵母浸粉, 10 g/L蛋白胨，添加0.1 mg/mL氨芐霉素用于篩選。固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉。培養(yǎng)含有基因的菌株細胞時，培養(yǎng)基中額外添加0.2 mg/mL G418。

培養(yǎng)基所用試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；? 高保真DNA聚合酶購自美國 Stratagene公司，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自美國Fermentas公司；轉(zhuǎn)化所用PEG3350、DMSO購自美國Sigma公司，鮭魚精DNA購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3 表達盒構(gòu)建

突變pUC19質(zhì)粒去除I酶切位點，作為基因表達載體。采用OE-PCR法[19]構(gòu)建整合型表達盒，總長3.9 kb，由5個DNA片段組成：與基因同源的上游同源臂和下游同源臂、釀酒酵母內(nèi)源弱啟動子、開放閱讀框與其相應的終止子和營養(yǎng)篩選標記，PCR引物見表1。最終得到帶有表達盒的整合型質(zhì)粒pUC19M-1 (圖1)。

表1 構(gòu)建整合型表達質(zhì)粒引物列表

Table 1 Primer for constructing the designer cassette for integrative transformation

Restriction enzyme sites are indicated in bold.

1.4 釀酒酵母單位點熒光標記庫的構(gòu)建

利用大腸桿菌對整合型質(zhì)粒pUC19M-1進行擴增，酶切回收目的DNA片段20 μg，對釀酒酵母單基因敲除庫進行轉(zhuǎn)化。篩選出具有LEU+G418-表型的轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建單位點熒光標記菌株庫。將該菌株庫在液體SD-LEU營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以抑制假陽性細胞的生長。取部分培養(yǎng)后的細胞稀釋涂布于YPD固體平板并翻印至SD-LEU營養(yǎng)缺陷型平板以統(tǒng)計釀酒酵母單位點熒光標記庫的細胞陰性率。

1.5 釀酒酵母單位點熒光標記庫的分選

將釀酒酵母單位點熒光標記庫過夜培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基后懸于PBS緩沖液中，細胞密度調(diào)整至1×107個細胞/mL。用流式細胞儀對細胞進行分選，根據(jù)細胞熒光蛋白表達強度的分布圖譜 (圖2)，選取熒光蛋白表達量較高和較低的細胞，分選出的細胞數(shù)分別占細胞總量10%。將得到的細胞再次分選，去除干擾細胞，純化細胞庫，形成高表達位點庫和低表達位點庫。

圖2 釀酒酵母單位點熒光標記庫菌株分選 (A：以釀酒酵母單位點熒光標記庫為起始的第一輪分選，P4框中為gfp高表達細胞，P5 框中的gfp低表達細胞；B：以第一輪分選出的gfp高表達細胞為起始進行的第二輪分選；C：以第一輪分選出的gfp低表達細胞為起始進行的第二輪分選)

1.6 高/低表達位點庫的測定與分析

提取釀酒酵母單基因敲除庫、釀酒酵母單位點熒光標記庫、高表達位點庫和低表達位點庫的基因組DNA，采用Tag-array hybridization法[20]測定表達盒上下游“條碼區(qū)”的DNA序列，確定庫中所含菌株和基因插入位置。

2 結(jié)果與討論

為了系統(tǒng)研究釀酒酵母基因組位置效應對外源基因表達的影響，本實驗中對釀酒酵母單基因敲除庫進行了高通量轉(zhuǎn)化，以報告基因替換單基因敲除菌株的序列。通過對轉(zhuǎn)化子的表型篩選，得到1.3×104個具有LEU+G418-表型的轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建釀酒酵母基因組單位點熒光標記菌株庫。釀酒酵母單基因敲除庫中共有菌株4 817株，根據(jù)計算，單位點熒光標記庫對單基因敲除庫的覆蓋率為2.6倍，單個單基因敲除菌株被轉(zhuǎn)化的概率為92.8%。單基因敲除菌株庫中存在部分生長緩慢菌株，在培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化過程中可能遺失；某些基因的缺失會對整合型轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響[21]；此外，長片段外源DNA的整合型轉(zhuǎn)化效率遠低于游離型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。考慮上述因素，我們認為實驗中所構(gòu)建的釀酒酵母單點熒光標記庫基本實現(xiàn)了對原單基因敲除庫的替換。

與抗性篩選不同，營養(yǎng)缺陷型篩選過程中會產(chǎn)生假陽性轉(zhuǎn)化子，為避免這些轉(zhuǎn)化子影響后續(xù)的分選和測序，實驗中對酵母單位點熒光標記庫、高表達位點庫和低表達位點庫中菌株的表型進行了驗證。在統(tǒng)計的4 200個單位點熒光標記庫菌株菌落中，表型為LEU-的菌落84個，陰性率為2% (表2)。采用同樣的方法對高、低表達位點庫的細胞陰性率進行檢測，結(jié)果顯示高表達位點庫的陰性率為0%，低表達位點的陰性率為1.1% (表2)。由于經(jīng)過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中的傳代培養(yǎng)和流式細胞儀的分選，兩者的陰性率與單位點熒光標記庫菌株陰性率相比均有明顯降低。但是低位點表達庫仍存在1.1%的假陽性細胞，這是由于流式細胞儀的分選受精度所限，未能將部分無熒光強度的細胞與熒光強度較低的細胞區(qū)分開來。由于后續(xù)的測序?qū)嶒災軌蚺懦訇栃跃辏虼水攷熘屑毎幮月实陀?%時，不會對后續(xù)實驗結(jié)果造成顯著影響。

表2 釀酒酵母單位點熒光標記庫、高表達位點庫和低表達位點庫中菌株表型驗證

Table 2 Phenotype verification for strains in the starting pool (SP), high-expressed pool (HP) and low-expressed pool (LP)

利用高通量測序技術(shù)測定表達盒上下游“條碼區(qū)”的DNA序列，確定釀酒酵母單位點熒光標記庫中所含菌株和基因插入位置。數(shù)據(jù)分析顯示，釀酒酵母單位點熒光標記庫中共含菌株3 455個，占原酵母單基因敲除庫的72%。分析測定結(jié)果少于酵母單基因敲除庫菌株數(shù)的原因如下：1) 在原始的4 817個菌株中，有部分菌株具有生長緩慢表型。這些菌株無論是在最開始的轉(zhuǎn)化操作，還是后續(xù)的培養(yǎng)、分選和測序過程中均可能因為生長過于緩慢丟失。2)基因的缺失和插入位置的不同會對轉(zhuǎn)化效率造成影響[21]，使得部分菌株未能成功插入報告基因。3) 分析和測序過程中會造成一部分菌株的缺失。

由酵母單位點熒光標記庫的流式細胞分選圖 (圖2) 可以看出，部分細胞的表達量明顯高于或低于其他細胞，說明處于這些位點上的基因表達受位置影響較大。

實驗中將位置效應明顯的細胞分選出來，構(gòu)建高表達位點庫和低表達位點庫。測序分析結(jié)果顯示，高表達位點庫中含有菌株428個，占單位點標記庫的12%；低表達位點庫中含有菌株444個，占單位點標記庫的13% (菌株列表見補充材料)。在熒光顯微鏡下觀察酵母單位點熒光標記庫、高表達位點庫菌株細胞的表達情況 (圖3)，圖3B為酵母單位點熒光標記庫細胞的觀察結(jié)果，可以看出細胞之間熒光強度存在明顯差異；圖3C為高表達庫菌株的細胞，其熒光強度明顯強于低表達庫菌株的細胞 (圖3D)。對酵母單位點熒光標記庫、高表達位點庫和低位點表達庫熒光表達強度的定量測定與鏡檢結(jié)果相吻合 (圖4)。圖4B為未分選的酵母單位點熒光標記庫細胞的熒光蛋白表達量分布圖，沿橫坐標軸分布較為分散，說明庫中細胞熒光蛋白表達量差異較大；圖4C為高表達位點庫細胞的熒光蛋白表達量分布，與圖4B相比明顯沿坐標軸向右偏移，說明細胞中熒光蛋白的表達量明顯增強；而從代表低表達位點庫的圖4D中可以看出，細胞分布沿坐標軸右移，說明細胞中熒光蛋白的表達量明顯降低。通過分布圖的量化數(shù)據(jù)可知，低表達位點庫菌株的平均表達量為18.02，高表達位點庫菌株的平均表達量為137.84，為低表達位點庫平均表達量的7.6倍。

圖3 熒光顯微鏡下釀酒酵母單基因敲除庫、高表達位點庫和低表達位點庫的綠色熒光蛋白表達情況(A：未轉(zhuǎn)化的釀酒酵母單基因敲除庫細胞；B：未經(jīng)過分選的釀酒酵母單位點熒光標記庫細胞；C：高表達位點庫細胞；D：低表達位點庫細胞。左側(cè)圖片為白光觀測，曝光時間100 ms；右側(cè)圖片為熒光觀測，曝光時間2 000 ms)

圖4 gfp表達量測定圖 (A：未轉(zhuǎn)化的釀酒酵母單基因敲除庫；B：未經(jīng)過分選的釀酒酵母單位點熒光標記庫；C：經(jīng)過兩輪分選得到的高表達位點庫；D：經(jīng)過兩輪分選得到的低表達位點庫)

為了進一步探尋釀酒酵母位置效應的分布規(guī)律，將高表達位點庫和低表達位點庫中報告基因所在位點繪制成圖譜 (圖5)。高/低表達位點分布圖顯示，對于外源基因表達存在顯著影響的位點在酵母基因組的16條染色體上均有分布。一些高表達和低表達位點集中分布在染色體的特定位置，呈現(xiàn)出一定的區(qū)域性。存在下調(diào)基因表達的“抑制區(qū)”和上調(diào)外源基因表達的“熱點區(qū)”。一個典型的例子就是端粒位置效應，表現(xiàn)為處于端粒序列附近的基因的表達受到抑制[22]。從圖5中可以看出，低表達位點在端粒位置的分布較為集中，如Ⅶ號、ⅪⅤ號染色體，端粒沉默效應抑制了其附近位點基因的表達，這一現(xiàn)象與染色質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)[23-24]。此外，低表達位點還多集中于著絲粒位置和位點，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因為著絲粒和位點具有特殊的DNA序列，容易與蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定的聚合體，不利于外源蛋白的表達[25-26]。除上述位點之外，染色體上還存在一些外源基因表達抑制區(qū)，如Ⅱ號染色體的100-119 kb位置，Ⅷ號染色體的136-159位置，ⅩⅥ號染色體的226-204 kb位置等，其抑制機理有待進一步研究。此外，在染色體上存在一些高表達位點相對較為集中的熱點區(qū)域，Yamane等[8]和Flagfeldt等[10]在其針對釀酒酵母基因組位置效應的研究中發(fā)現(xiàn)熱點區(qū)域附近存在自主復制序列 (ARS)，促進外源基因的表達，本實驗證實了這一現(xiàn)象并發(fā)現(xiàn)了更多類似熱點區(qū)，如Ⅳ號染色體755-768 kb (ARS423)，Ⅶ號染色體828-849 kb (ARS731)，ⅩⅥ號染色體455-465 kb (ARS1633)等。研究過程中我們還發(fā)現(xiàn)一些熱點區(qū)域能夠造成外源基因表達量增加，如Ⅷ染色體320-336 kb，ⅩⅢ染色體571-589 kb等。但其作用機理尚不明確。

圖5 高/低表達位點在釀酒酵母染色體上的分布示意圖 (線上部黃色點代表高表達位點；線下部藍色點代表低表達位點；線中紅色點代表染色體著絲粒；Ⅲ號染色體上的紅線代表交配型位點 (HML和HMR))

本研究以釀酒酵母單基因敲除庫為基礎(chǔ)，構(gòu)建釀酒酵母基因組單位點熒光標記庫、高表達位點庫和低表達位點庫，從全基因組尺度上對釀酒酵母基因組的位置效應進行了表征。獲得高表達位點428個，低表達位點444個。通過對這些位點分布的分析揭示了位置效應在染色體上的分布規(guī)律。研究結(jié)果對合成生物學研究中精確調(diào)控外源基因表達和重要蛋白生產(chǎn)工業(yè)都具有重要的指導意義。

致謝：感謝美國紐約大學的Jef D. Boeke教授對本研究的悉心指導和支持；本文的測序工作和位點圖譜繪制得到了Boeke課題組Anna Sliva和Zheng Kuang的協(xié)助，在此對他們表示感謝。

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Effect of integration loci of genome on heterologous gene expression in

Wenzheng Zhang1,2, Jijun Tang2,3, Bingzhi Li1,2, and Yingjin Yuan1,2

1 Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), Tianjin University, Tianjin 300072, China 2 SynBio Research Platform, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China 3 School of Computer Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China

Chromosomal integration of heterologous genes or pathways is preferred over the use of episomal plasmids for its inherently stability and thus more desirable in the industrial setting. However, the position of integration of heterologous genes in the genome influences the expression levels. In combination of high throughput transformation of the Yeast Knock-out Collection (YKO) and FACS analysis, the position effect on heterologous reporter genewas identified across the whole genome in yeast. In total 428 high-expressed sites and 444 low-expressed sites were spotted, providing massive data to analyze patterns and reasons for region dependency of gene expression on the genome-wide scale.

synthetic biology,, chromosomal region, heterologous gene expression

October 21, 2015; Accepted: December 4, 2015

張文政, 唐繼軍, 李炳志, 等. 釀酒酵母基因組位置效應對外源基因表達的影響. 生物工程學報, 2016, 32(7): 901–911.

Zhang WZ, Tang JJ, Li BZ, et al. Effect of integration loci of genome on heterologous gene expression in. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 901–911.

Supported by: International Science and Technology Cooperation Program of China (No. 2015DFA00960), National Natural Science Foundation of China (No. 21390203), Tianjin Municipal Science and Technology Program (No. 13RCGFSY19800).

Corresponding author: Bingzhi Li. Tel: +86-22-27402503; Fax: +86-22-27403888; E-mail: bzli@tju.edu.cn

國家國際科技合作項目 (No. 2015DFA00960)，國家自然科學基金 (No. 21390203)，天津市科技計劃項目 (No. 13RCGFSY19800) 資助。

(本文責編 郝麗芳)