王濤，洪煬，韓宏曉，呂超，賈秉光，曹曉丹，韓倩，陸珂，李浩，傅志強(qiáng)，林矯矯

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日本血吸蟲凋亡基因的克隆、真核表達(dá) 及其功能分析

王濤，洪煬，韓宏曉，呂超，賈秉光，曹曉丹，韓倩，陸珂，李浩，傅志強(qiáng)，林矯矯

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海 200241

為深入研究日本血吸蟲細(xì)胞凋亡機(jī)制。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的全長序列，其ORF含900 bp，編碼299個氨基酸，理論分子量為33 509.7 Da，理論等電點為6.39。Real-time PCR分析表明該基因在日本血吸蟲生長發(fā)育的各個時期均有表達(dá)，其中21 d表達(dá)量最高，42 d雌蟲表達(dá)量高于42 d雄蟲。成功構(gòu)建了pXJ40-FLAG-Sjcaspase3重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞內(nèi)，熒光定量PCR和Western blotting分析表明成功在Hela細(xì)胞中表達(dá)。酶活分析提示重組Sjcaspase3具有切割特異性底物天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸 (DEVD) 的活性。流式細(xì)胞術(shù)檢測了可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生早期細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果為深入探討的生物學(xué)功能及日本血吸蟲細(xì)胞凋亡機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

日本血吸蟲，caspase3，細(xì)胞凋亡，酶活，細(xì)胞流式

細(xì)胞凋亡 (Apoptosis) 是細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death) 的一種重要方式。它在多細(xì)胞生物去除不需要和異常細(xì)胞中起著重要作用，對多細(xì)胞生物體生長發(fā)育具有重要的意義。目前，研究比較透徹的凋亡調(diào)控通路主要有兩條：即外源性的死亡受體通路和內(nèi)源性的線粒體通路。兩種通路雖然起始的調(diào)控基因不同，但終點都是半胱天冬酶家族 (Caspase family) 成員的激活并進(jìn)行一系列切割，最終導(dǎo)致細(xì)胞不可逆地發(fā)生細(xì)胞凋亡。可見Caspase家族在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。

本實驗室前期對日本血吸蟲的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象和機(jī)制進(jìn)行了初步探索。彭金彪等對不同適宜性宿主來源10 d日本血吸蟲童蟲的細(xì)胞凋亡進(jìn)行了觀察和比較，發(fā)現(xiàn)非適宜性宿主來源的日本血吸蟲存在更明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[1]。韓宏曉等在miRNA水平上分析了不同適宜性宿主來源日本血吸蟲差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)一些與調(diào)控凋亡相關(guān)的miRNA在不同適宜性宿主來源蟲體呈現(xiàn)差異表達(dá)[2]。郭小勇等觀察并實驗證明了大、小鼠來源不同時期的日本血吸蟲存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[3]。以上研究說明日本血吸蟲和其他多細(xì)胞生物一樣存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并且細(xì)胞凋亡與日本血吸蟲的生長發(fā)育具有重要關(guān)系。

2009年日本血吸蟲全基因組測序工作的完成對深入開展日本血吸蟲凋亡機(jī)制的研究提供了重要基礎(chǔ)[4]。人類等高等哺乳動物的Caspase家族目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有11個成員，而日本血吸蟲僅僅在基因組水平上發(fā)現(xiàn)了4個成員[5]。本實驗室前期已在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上證實日本血吸蟲存在Caspase9[6]，但其他成員卻未見相關(guān)報道。

很早以前人們就開始關(guān)注細(xì)胞凋亡在癌癥治療方面的應(yīng)用[7-8]，在細(xì)胞凋亡中Caspase3就是一個關(guān)鍵的分子[9]。近幾年人們開始關(guān)注細(xì)胞凋亡在治療血吸蟲病方面的應(yīng)用前景[10]。2013年Kumar等利用生物信息學(xué)分析了血吸蟲的Caspase3/7成員并對比了人類的Caspase成員[11]，發(fā)現(xiàn)血吸蟲的Caspase3/7蛋白在二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)上和它們的哺乳動物宿主具有一定的差異，分析了血吸蟲Caspase3/7作為藥物靶點的可能性。因此對日本血吸蟲基因的研究具有重要意義，不僅有助于對日本血吸蟲細(xì)胞凋亡機(jī)制的理解，也可能有助于日本血吸蟲病新藥物靶點的鑒定。

本研究對日本血吸蟲3進(jìn)行了克隆、表達(dá)，驗證了其具有切割特異性底物的活性，并可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，為深入研究日本血吸蟲細(xì)胞凋亡機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和酶

Trizol、SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司；ExDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptTM PT-PCR Kit、SYBR?Premix ExTMⅡ (Perfect Real Time)、EASY Dilution (For Real Time PCR) 均購自TaKaRa生物工程 (大連) 有限公司；DNA純化回收試劑盒，小型質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸訟xygen公司；大型質(zhì)粒純化回收試劑盒購自QIAGEN公司。Caspase3/7活性檢測試劑盒，F(xiàn)uGene HD轉(zhuǎn)染試劑購自Progema公司；FLAG單抗購自CST公司； HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自北京碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen公司；pXJ40-FLAG質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽病實驗室保存；DAPI染料購自上海前塵生物科技有限公司；Anti-Flag親和凝膠和Poly Flag多肽購自Biotool生物公司。

1.1.2 生物材料

DH5α和BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物有限公司；Hela細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽病實驗室保存；日本血吸蟲蟲體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲實驗室保存；6周齡雄性BALB/c購自上海斯萊克實驗動物有限公司；中國大陸株日本血吸蟲陽性釘螺由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

取液氮保存的42 d日本血吸蟲約150 mg，按照Trizol試劑盒說明書提取蟲體總RNA。利用SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 Sjcaspase3基因的克隆

根據(jù)日本血吸蟲基因 (GenBank登錄號FN315427.1) 序列設(shè)計特異引物F1 (與ORF的1-20位核苷酸重疊) 和R1 (與ORF的878–900位核苷酸反向互補(bǔ))，引物序列見表1，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系參考Ex酶說明書。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共32個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸 5 min；4 ℃終止反應(yīng)并保存。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

利用ORF FINDER (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.htmL) 在線分析尋找開放閱讀框；將序列進(jìn)行BLASTX (http:// blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi?) 進(jìn)行比對尋找同源基因；利用Primer Premier 5軟件進(jìn)行酶切位點分析和理論編碼蛋白質(zhì)序列分析；利用NCBI(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析尋找結(jié)構(gòu)域；利用MEGA 6軟件進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)在線分析氨基酸殘基組成、數(shù)目，蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量和理論等電點等基本理化性質(zhì)。

1.2.4 熒光定量PCR分析Sjcaspase3在各期別蟲體中的表達(dá)情況

分別提取日本血吸蟲尾蚴、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、42 d雄蟲、42 d雌蟲的總RNA，

按照TaKaRa PrimeScriptTMPT-PCR Kit試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄日本血吸蟲各時期蟲體的cDNA。以日本血吸蟲基因為內(nèi)參，各時期日本血吸蟲cDNA為模板，并利用SYBR?Premix ExTMⅡ (Perfect Real Time) 酶進(jìn)行熒光定量PCR實驗。實驗進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)。熒光定量PCR引物 (F2和R2) 序列和日本血吸蟲內(nèi)參引物 (F3和R3) 序列見表1。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.2.5 pXJ40-FLAG-SjCaspase3重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)自身酶切位點和pXJ40-FLAG多克隆位點設(shè)計攜帶有酶切位點的引物F4和R4，分別在上、下游引物的5￠端引入H I和I限制性酶切位點。引物序列見表1，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，亞克隆到pMD19-T載體，挑取單克隆測序驗證后進(jìn)一步克隆到pXJ40-FLAG載體上并再次進(jìn)行測序驗證。將構(gòu)建成功的pXJ40-FLAG-Sjcaspase3單克隆菌液大量培養(yǎng)，并利用QIAGEN質(zhì)粒抽提試劑盒提取pXJ40-FLAG-Sjcaspase3重組質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR和RT-PCR引物

Table 1 Primers used for PCR and RT-PCR

1.2.6 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞

將生長狀況良好的Hela細(xì)胞用完全培養(yǎng)基稀釋成2×105cells/mL濃度，按每孔2 mL的量鋪到35 mm直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞貼壁生長至80%–90%時可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。棄去培養(yǎng)基，利用37 ℃預(yù)熱的PBS洗3遍后加入 1 mL 37 ℃預(yù)熱的含2%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。利用FuGene HD轉(zhuǎn)染試劑，按照質(zhì)粒 (μg) 與轉(zhuǎn)染試劑 (μL) 1∶3的比例配制進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每個培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染2 μg質(zhì)粒。分別設(shè)置對照組、空質(zhì)粒組和Sjcaspase3組。其中對照組只更換培養(yǎng)基，不進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染相應(yīng)的pXJ40-FLAG質(zhì)粒；Sjcaspase3組轉(zhuǎn)染pXJ40- FLAG-Sjcaspase3重組質(zhì)粒。

1.2.7 熒光定量PCR分析Sjcaspase3基因的 表達(dá)

轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后6、9、12、15 h，先棄去培養(yǎng)基，利用37 ℃預(yù)熱的PBS洗3遍，然后加入Trizol反復(fù)吹打細(xì)胞。按照上述方法提取Hela細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以的熒光定量PCR引物和人類的基因為內(nèi)參，以各期別蟲體cDNA為模板，按照上述方法進(jìn)行熒光定量PCR分析，每個實驗重復(fù)3次。內(nèi)參基因的引物 (F5和R5) 見表1。

1.2.8 Western blotting分析Sjcaspase3蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后6、9、12、15 h，先棄去培養(yǎng)基，利用37 ℃預(yù)熱的PBS洗3遍，然后加入200 μL RIPA (含蛋白酶抑制劑) 細(xì)胞裂解液4 ℃裂解30 min。收集細(xì)胞裂解液，4 ℃、12 000×離心10 min，取上清進(jìn)行Western blotting分析Sjcaspase3蛋白在Hela細(xì)胞中的表達(dá)。

1.2.9 rSjcaspase3重組蛋白的純化

轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后15 h后先棄去培養(yǎng)基，利用37 ℃預(yù)熱的PBS清洗3遍，然后加入400 μL RIPA細(xì)胞裂解液裂解30 min。收集細(xì)胞裂解液，4 ℃、12 000×離心10 min取上清。按照Anti-Flag親和凝膠純化說明書進(jìn)行操作，取 300 μL細(xì)胞裂解液并加入100 μL親和凝膠4 ℃振蕩孵育4 h。利用TBS緩沖液清洗3遍后加入200 μg/mL的Poly Flag多肽200 μL。4 ℃振蕩孵育4 h后，4 ℃、10 000×離心1 min取上清即為純化的目的蛋白。取10 μL目的蛋白上清并加入10 μL 2×上樣緩沖液煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳實驗。

1.2.10 Caspase酶活檢測

轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞15 h后先棄去培養(yǎng)基，利用37 ℃預(yù)熱的PBS清洗3遍，然后加入400 μL RIPA細(xì)胞裂解液裂解30 min。收集細(xì)胞裂解液，4 ℃、12 000×離心10 min取上清。按照Promega Caspase3/7酶活檢測試劑盒說明書操作，每組各取200 μL并加入200 μL含天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸 (DEVD) 序列的蛋白底物，混勻后在室溫下避光振蕩。30 min后利用FB12 光度計讀取熒光強(qiáng)度。取剩下的蛋白裂解液進(jìn)行蛋白濃度測定。每個組別進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實驗。

Sjcaspase3體外酶活檢測實驗方法同上。取100 μL含rSjcaspase3重組蛋白上清并加入 100 μL底物，混勻后在室溫下避光振蕩。對照組為進(jìn)行相同處理的陰性細(xì)胞裂解液。30 min后利用FB12 光度計讀取熒光強(qiáng)度。每個組別進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實驗。

1.2.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞15 h后利用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測對照組、空質(zhì)粒組和Sjcaspase3重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率，對凋亡細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞15 h后收集各組細(xì)胞，利用PBS洗3遍。按照Invitrogen凋亡檢測試劑盒說明書利用Binding buffer (試劑盒內(nèi)提供) 稀釋細(xì)胞濃度至1×106cells/mL。避光下100 μL細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL PI染色 15 min后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果與分析

2.1基因克隆和生物信息學(xué)分析

利用日本血吸蟲42 d cDNA為模板，利用全長基因引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。核酸凝膠電泳分析在750 bp和1 000 bp之間得到一條DNA片段 (圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增Sjcaspase3基因

生物信息學(xué)分析表明的ORF共有900 bp，編碼299個氨基酸殘基，理論分子量為33 509.7 Da，理論等電點為6.39。利用NCBI的Blastx在線工具分析，發(fā)現(xiàn)該基因與曼氏血吸蟲SmCaspase3基因的相似性為77%，故將此基因命名為。利用NCBI的Conserved Domains Search Service和SMART進(jìn)行結(jié)構(gòu)域搜索，結(jié)果顯示Sjcaspase3屬于CASc超家族，具有CASc結(jié)構(gòu)域 (圖2)。選擇曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、華支睪吸蟲、細(xì)粒棘球絳蟲和人類的基因與日本血吸蟲的基因進(jìn)行多序列比較，較高相似性依次為77%、73%、53%、50%和43%。利用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示曼氏血吸蟲的基因與日本血吸蟲的親緣性最近，與人的基因親緣性較遠(yuǎn) (圖3)。

圖3 Sjcaspase3系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2在各期別蟲體中的表達(dá)情況分析

熒光定量PCR結(jié)果分析表明，在日本血吸蟲尾蚴、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d蟲體中均有表達(dá) (圖4)，其中21 d蟲體表達(dá)量最高。42 d蟲體雌雄蟲轉(zhuǎn)錄水平相比，雌蟲表達(dá)量高于雄蟲且具有顯著性差異 (<0.05)。

圖4 熒光定量PCR分析Sjcaspase3在日本血吸蟲體內(nèi)各期別的轉(zhuǎn)錄水平 () *表示差異顯著 (P<0.05)

2.3 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后基因轉(zhuǎn)錄 水平

pXJ40-FLAG-Sjcaspase3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，分別在0、6、9、12、15 h時經(jīng)熒光定量PCR技術(shù)分析基因的表達(dá)量 (圖5)。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染pXJ40-FLAG-Sjcaspase3質(zhì)粒后6 h可檢測到基因的轉(zhuǎn)錄，在15 h之內(nèi)隨著時間的延長基因的表達(dá)量隨著時間的延長逐步上升。

圖5 Sjcaspase3在Hela細(xì)胞中不同時間的轉(zhuǎn)錄水平 (±s)

2.4 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后Western blotting檢測Sjcaspase3蛋白表達(dá)情況

如圖6所示，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后分別在6、9、12、15 h時收樣進(jìn)行Western blotting檢測，12 h時可見有微量Sjcaspase3蛋白表達(dá)，15 h后可見明顯的Sjcaspase3蛋白表達(dá)。

圖6 Sjcaspase3蛋白在Hela細(xì)胞中表達(dá)檢測

2.5 rSjcaspase3重組蛋白的純化

利用Anti-Flag親和凝膠對Hela細(xì)胞表達(dá)的rSjcaspase3重組蛋白進(jìn)行純化并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果如圖7所示。純化結(jié)果為單一條帶，蛋白大小約33 kDa，符合預(yù)期。

圖7 rSjcaspase3重組蛋白的純化

2.6 酶活檢測

轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞15 h后分別提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行均一化處理。分別測定對照組、空質(zhì)粒組和Sjcaspase3重組質(zhì)粒組的Caspase酶活性結(jié)果 (圖8)。結(jié)果顯示，與對照組和空質(zhì)粒組相比，Sjcaspase3重組質(zhì)粒組具有較高的熒光強(qiáng)度。體外Caspase酶活實驗結(jié)果如圖9所示，結(jié)果與對照組相比，純化的rSjcaspase3重組蛋白組具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。

圖8 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞15 h后不同組別Caspase酶活檢測

圖9 rSjcaspase3重組蛋白體外Caspase酶活檢測

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞流式結(jié)果如圖10所示。對照組中有99.1%的細(xì)胞為正常細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞占0.5%，晚期凋亡細(xì)胞占0.4%；空質(zhì)粒組正常細(xì)胞占91.7%，早期凋亡細(xì)胞占5.3%，晚期凋亡細(xì)胞占0.7%，死亡細(xì)胞占2.2%；Caspase3組正常細(xì)胞占79.8%，早期凋亡細(xì)胞占19.2%，晚期凋亡細(xì)胞占0.3%，死亡細(xì)胞占0.7%。

3 討論

日本血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全的人畜共患寄生蟲病，截至2013年底，全國推算有血吸蟲病人184 943例[12]。血吸蟲病的防治措施是使用吡喹酮化療為主，而長期大規(guī)模使用吡喹酮治療引起了人們對耐藥性的擔(dān)心[13]。因此，迫切需要治療血吸蟲病新藥物靶點的篩選，而血吸蟲細(xì)胞凋亡分子就具有作為新藥物靶點的潛力。本實驗室前期在探討東方田鼠對日本血吸蟲感染的抗性機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡可能是東方田鼠清除日本血吸蟲的機(jī)制之一[14]。Dubois等利用凋亡誘導(dǎo)藥物Trichostatin A (TSA)在體外對曼氏血吸蟲進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)TSA可以提高曼氏血吸蟲Caspase3/7的表達(dá)量，可見Caspase3在曼氏血吸蟲細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用并具有作為藥物靶標(biāo)的潛力[15]。Hines-Kay等研究表明PZQ對血吸蟲的殺傷作用與細(xì)胞凋亡有關(guān)[16]，因此研究血吸蟲細(xì)胞凋亡分子具有重要意義。

最早H. Robert Horvitz研究團(tuán)隊在1993年研究秀麗隱桿線蟲時發(fā)現(xiàn)一個基因在凋亡細(xì)胞中表達(dá)特別豐富，命名為CED3，Horvitz發(fā)現(xiàn)此基因編碼一種蛋白酶并與細(xì)胞凋亡有關(guān)[17]。隨后，人們研究發(fā)現(xiàn)人類也存在與線蟲CED3同源的基因CPP32[18]，也證明此基因具有導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用。后來人們陸續(xù)在人類基因中發(fā)現(xiàn)許多與線蟲CED3同源的基因[19-21]。由于這些基因編碼的蛋白質(zhì)都具有半胱氨酸依賴性的天冬氨酸酶活性，因此命名為半胱天冬酶 (Caspase)。Caspase家族成員分為兩類，一類是起始者 (Initiators)，一類是執(zhí)行者 (Executioners)。其中起始者負(fù)責(zé)凋亡信號的傳遞和放大，主要成員有Caspase8/9/10等。而執(zhí)行者的功能就像細(xì)胞的“劊子手”一樣，被激活后就會切割特異性底物，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡，主要成員有Caspase3/6/7。本研究對日本血吸蟲凋亡基因進(jìn)行了克隆和真核表達(dá)，并證明了其具有切割特異性底物 (DEVD) 和誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的作用。

熒光定量PCR結(jié)果表明在日本血吸蟲生長發(fā)育的各個時期均有表達(dá)，其中21 d蟲體表達(dá)量最高。日本血吸蟲雌雄蟲一般在入侵后14–16 d開始合抱，19–21 d雌雄蟲生殖器官及其相應(yīng)的管道全部形成，蟲體處于配子發(fā)生期，睪丸及卵巢開始有精子及卵子產(chǎn)生，是蟲體生長發(fā)育最快的階段之一[22]。在21 d呈現(xiàn)高表達(dá)可能與蟲體的快速生長發(fā)育及性器官的發(fā)育成熟和產(chǎn)卵有關(guān)。42 d雌蟲比42 d雄蟲表達(dá)量高且差異顯著，這可能與雌蟲大量產(chǎn)卵相關(guān)。先前也有報道未成功合抱的曼氏血吸蟲雌蟲的卵巢會退化并發(fā)生細(xì)胞凋亡[23]，這一結(jié)果提示基因可能對雌蟲生殖器官發(fā)育和產(chǎn)卵具有重要作用。

pXJ40是一種哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，經(jīng)過多克隆位點前添加了一個FLAG標(biāo)簽 (DYKDDDDK) 的修飾后并不影響其連接和表達(dá)目的蛋白功能，已有多位學(xué)者利用添加標(biāo)簽修飾后的pXJ40載體表達(dá)出有功能的目的蛋 白[24-26]。本實驗構(gòu)建了pXJ40-FLAG-Sjcaspase3重組質(zhì)粒，熒光定量PCR和Western blotting分析表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，并可在該細(xì)胞系中表達(dá)。

Caspase家族蛋白具有切割特異性底物 (天冬氨酸殘基后的肽鍵)。為了檢測日本血吸蟲的Sjcaspase3是否具有典型的Caspase家族特征。我們提取了含Sjcaspase3目的蛋白的細(xì)胞裂解液，并加入了含天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸 (DEVD) 序列的蛋白底物和其他非底物酶。當(dāng)特異性底物被切割后，其他酶會繼續(xù)發(fā)揮作用，與切割后的底物發(fā)生作用并發(fā)出熒光，并且熒光強(qiáng)度和Caspase酶活性成正比例相關(guān)。經(jīng)檢測，與陰性對照組和空質(zhì)粒對照組相比，Sjcaspase3組Caspase酶活性明顯增強(qiáng)。為進(jìn)一步證明Sjcaspase3蛋白的Caspase酶活性，我們對Hela細(xì)胞中的rSjcaspase3重組蛋白進(jìn)行了純化，并利用純化后的rSjcaspase3重組蛋白進(jìn)行了體外Caspase酶活檢測。結(jié)果表明rSjcaspase3重組蛋白在體外也具有較高的Caspase酶活性?？梢?，日本血吸蟲的基因在Hela中成功表達(dá)且翻譯出具有酶活的蛋白，此蛋白具有Caspase家族其他蛋白切割特意底物的活性。

細(xì)胞凋亡具有一系列典型特征，如細(xì)胞膜皺縮，內(nèi)陷、細(xì)胞核皺縮，崩解、形成凋亡小體、保持膜完整性等，通過檢測這些特征性變化可以判斷細(xì)胞是否發(fā)生了細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生早期細(xì)胞凋亡時細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸會外翻，它能與Annexin V特異性結(jié)合，因此可以利用FITC標(biāo)記的Annexin V檢測到。當(dāng)細(xì)胞處于細(xì)胞凋亡晚期時，細(xì)胞膜依然保持完整但通透性會發(fā)生改變，這時核染料PI就能進(jìn)入細(xì)胞核并與之結(jié)合。細(xì)胞壞死后細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞可以被PI染色，但是卻不能被Annexin V-FITC標(biāo)記，以此判斷細(xì)胞為壞死細(xì)胞。本研究通過細(xì)胞流式實驗檢測了誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果顯示，對照組99%以上的細(xì)胞為正常細(xì)胞?？召|(zhì)粒組可能由于外源核酸的應(yīng)激作用，誘導(dǎo)了5.3%和0.7%的細(xì)胞發(fā)生了早期凋亡與晚期凋亡，并且有2.2%的細(xì)胞發(fā)生壞死。但是空質(zhì)粒組仍有90%以上的細(xì)胞為正常細(xì)胞。Sjcaspase3組早期細(xì)胞凋亡率為19.2%，明顯高于對照組和空質(zhì)粒組，但是晚期凋亡率卻無明顯差別。說明日本血吸蟲的基因的表達(dá)可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生早期細(xì)胞凋亡。

綜上，本研究對日本血吸蟲進(jìn)行了初步的研究，為深入研究日本血吸蟲細(xì)胞凋亡機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning, eukaryotic expressing and function analysis ofapoptosis gene

Tao Wang, Yang Hong, Hongxiao Han, Chao Lv, Bingguang Jia, Xiaodan Cao, Qian Han, Ke Lu, Hao Li, Zhiqiang Fu, and Jiaojiao Lin

Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Shanghai 200241, China

For further research of the apoptosis mechanism of(). The cDNA encodingofwas amplified by polymerase chain reaction (PCR) technique, which contained 900 nucleotides and encoded 299 amino acids. The theory molecular weight and isoelectric point (PI) of the deduced protein is 33.5 kDa and 6.39, respectively. Real-time PCR was used to analyze the transcription profiles ofat different development stages of. The results showed that this gene was expressed in all stages ofwith the highest expression in 21d worms, and the level of gene transcription in 42 d female worms was higher than that of male worms. The recombinant plasmid pXJ40-FLAG-Sjcaspase3 was constructed and transfection into Hela cells successfully. Real-time PCR and Western blotting analysis showedwas successfully expressed in Hela cells. Enzyme activity analysis revealed that recombinant Sjcaspase3 possessed the activity to cut substrate DEVD. Flow cytometry proved thatcould induce early apoptosis of Hela cells. The results provide the basis for proceeding further study on the biological function ofand better understand the apoptosis mechanism of.

, caspase3, apoptosis, enzyme activity, flow cytometry

November 13, 2015; Accepted: April 5, 2016

王濤, 洪煬, 韓宏曉, 等. 日本血吸蟲凋亡基因的克隆、真核表達(dá)及其功能分析. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(7): 889–900.

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Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81271871, 31172315).

Corresponding author: Jiaojiao Lin. Tel: +86-21-34293440; E-mail: jjlin@shvri.ac.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 81271871, 31172315) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-04-14 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160414.1437.002.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)