許春春，于渤浩，王紅蕾，李　晶，劉淑瑩，3，于珊珊，4

( 1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春130000; 2.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春130024; 3.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所長(zhǎng)春質(zhì)譜中心，長(zhǎng)春130022; 4.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海200240)

?

重組嗜熱β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化
稀有人參皂苷Rd和CK

許春春1，于渤浩1，王紅蕾2，李晶1，劉淑瑩1，3，于珊珊1，4

( 1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春130000; 2.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春130024; 3.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所長(zhǎng)春質(zhì)譜中心，長(zhǎng)春130022; 4.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海200240)

摘要利用高效液相色譜( HPLC)法，對(duì)重組嗜熱β-葡萄糖苷酶( Fpglu1)轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷( Rd和CK)進(jìn)行研究，并表征了其催化動(dòng)力學(xué)參數(shù).利用同源模建和分子動(dòng)力學(xué)模擬等生物信息學(xué)技術(shù)，探究了Fpglu1轉(zhuǎn)化人參皂苷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其相互作用.結(jié)果表明，F(xiàn)pglu1能夠水解人參總皂苷生成稀有皂苷Rd和CK，其催化人參皂苷Rb1，Rb2和Rc的Km值分別為0. 318，1. 840和5. 269 mmol/L;酶的轉(zhuǎn)換數(shù)( kcat)值分別為144. 191，0. 572和0. 011 s－1.當(dāng)轉(zhuǎn)化時(shí)間分別為6和102 h時(shí)，Rd和CK的產(chǎn)率達(dá)到最大，分別為60%和93%.通過(guò)對(duì)該酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及皂苷分子的對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)，底物位于由疏水性氨基酸構(gòu)成的底物口袋中，氨基酸殘基Glu194和Glu367是參與催化作用的關(guān)鍵，且實(shí)驗(yàn)測(cè)得的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)( Km)與對(duì)接的相互作用能量值存在線性關(guān)系.

關(guān)鍵詞β-葡萄糖苷酶;生物轉(zhuǎn)化;稀有人參皂苷;動(dòng)力學(xué)

人參( Panax ginseng C.A Maye)是我國(guó)的傳統(tǒng)名貴中藥，人參皂苷是人參藥用的有效成分.目前，已經(jīng)從人參中發(fā)現(xiàn)100多種天然人參皂苷產(chǎn)物，分離出40余種［1］.各種人參皂苷的含量不同、結(jié)構(gòu)多樣，藥理活性也有很大差別［2］.研究［3，4］表明，稀有人參皂苷(如Rd，Rg3，F(xiàn)2，Rh2，CK和CMc等)是一類在人參中痕量存在或不存在的物質(zhì)，但因其更容易在體內(nèi)被吸收利用，且具有更顯著的藥理活性而受到越來(lái)越多的關(guān)注.人參皂苷Rd和CK是人參皂苷體內(nèi)代謝后的主要物質(zhì)，均屬于稀有人參皂苷.人參皂苷Rd具有抗腫瘤、治療動(dòng)脈粥樣硬化和保護(hù)神經(jīng)等作用［5，6］;人參皂苷CK具有抗炎、保護(hù)心肌、抗過(guò)敏、改善記憶力和腎組織病理變化等作用［7，8］，尤其在治療癌癥方面療效顯著［9，10］.但人參皂苷分子龐大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前的化學(xué)全合成方法仍處于探索階段;且人參皂苷Rd在人參中含量甚微，而人參皂苷CK根本不存在，難以通過(guò)直接提取的方法獲得，因此大量高效地制備稀有人參皂苷Rd和CK已成為亟待解決的問(wèn)題.

基于皂苷核心骨架和化學(xué)結(jié)構(gòu)相似原理，通過(guò)水解某些含量高、藥效低的人參皂苷末端糖基來(lái)大量制備稀有人參皂苷已成為目前最為可行的方法.化學(xué)水解法通常選擇性較差、產(chǎn)率低、不易提純且易造成環(huán)境污染.糖苷酶水解法則具有區(qū)域選擇性和立體選擇性高、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少、無(wú)污染和容易工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是制備稀有人參皂苷最具有潛力的方法［11，12］.目前，已有多種用于轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷Rd和CK的糖苷水解酶被報(bào)道，如β-D-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶［13～16］，但是對(duì)轉(zhuǎn)化人參皂苷Rd及CK的糖苷酶研究多集中在酶學(xué)性質(zhì)及轉(zhuǎn)化性質(zhì)的定性定量研究，對(duì)于糖苷酶轉(zhuǎn)化皂苷分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其相互作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.此外，人參皂苷Rd和CK仍未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，從而限制了其藥理研究及新藥開(kāi)發(fā)的進(jìn)程.這主要是因?yàn)槟壳坝糜谠碥辙D(zhuǎn)化的酶活性或穩(wěn)定性較低，且多以單一皂苷作為轉(zhuǎn)化底物，轉(zhuǎn)化途徑單一，原料成本高;而使用原料成本相對(duì)低廉的總皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)需應(yīng)用多酶體系，從而增加了工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)設(shè)備的要求及操作難度.

本文利用高效液相色譜( HPLC)法，對(duì)重組嗜熱β-葡萄糖苷酶( Fpglu1)轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷Rd和CK進(jìn)行了研究，表征了其催化動(dòng)力學(xué)參數(shù).利用同源模建和分子動(dòng)力學(xué)模擬等生物信息學(xué)技術(shù)，探究了Fpglu1轉(zhuǎn)化人參皂苷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其相互作用.結(jié)果表明，F(xiàn)pglu1能夠以價(jià)格較低廉的總皂苷作為原料高效制備稀有人參皂苷Rd和CK，為工業(yè)化生產(chǎn)稀有人參皂苷Rd和CK奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)Fpglu1蛋白分子與皂苷分子相互作用的研究也將對(duì)進(jìn)一步的定向進(jìn)化具有借鑒意義.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

人參皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd和CK均購(gòu)自南京澤朗生物有限公司;色譜純乙腈和甲醇購(gòu)自美國(guó)TEDIA試劑公司;工程菌BL21-28a-Fpglu1由本實(shí)驗(yàn)室提供，其基因來(lái)源于嗜熱細(xì)菌Fervidobacterium pennivorans DSM9078.

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司) ; TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司) ; JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司).

1.2重組糖苷酶的表達(dá)和純化

向100 mL含30 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani( LB)液體培養(yǎng)基中加入2 mL工程菌，于37℃，170 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)10 h后;轉(zhuǎn)移至2 L含30 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，170 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)，直至菌液在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度值( OD600)達(dá)到0. 6～0. 8時(shí)，在培養(yǎng)基中加入2 mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG，1 mol/L)，于30℃，120 r/min轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)過(guò)夜;將發(fā)酵液于4℃，8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄去上層清液，收集菌體.

稱取約4. 7 g菌體，加入47 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液( 20 mmol/L，pH=7. 0)重懸，菌體的終濃度為0. 1 g/mL，冰浴下超聲破碎60 min(工作時(shí)間3 s，間隔時(shí)間3 s)，于4℃，8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心50 min后，收集上層清液即為粗酶液;采用鎳柱親和層析法純化，用含20 mmol/L咪唑的洗脫液除去雜蛋白，再用咪唑洗脫液( 150 mmol/L)收集目的蛋白，收集到的蛋白于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液( 20 mmol/L，pH=7. 0)中透析過(guò)夜，并于－20℃下保存.采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE)驗(yàn)證蛋白純度［17］.

1.3 HPLC色譜條件

色譜測(cè)試使用Agilent 1200型高效液相色譜儀和C18反相色譜柱( 5 cm×3. 0 mm，i.d.2. 7 μm) ;流動(dòng)相為水( A)和乙腈( B)，流速1. 0 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;柱溫箱溫度35℃.梯度洗脫條件: 0～5 min，15%～19% B; 5～7. 5 min，19% B; 7. 5～10 min，19%～30% B; 10～16 min，30%～33%B; 16～25 min，33%～45%B; 25～30 min，45%～65%B; 30～33 min，65%～80%B; 33～40 min，80%～100%B; 40～45 min，100%B(百分?jǐn)?shù)均為體積分?jǐn)?shù)).

1.4 Fpglu1轉(zhuǎn)化人參總皂苷

人參總皂苷( 2 mg/mL)與等體積的酶溶液( 0. 267 mg/mL)于70℃反應(yīng)，間隔時(shí)間取樣，加入等體積的水飽和正丁醇終止反應(yīng)，渦旋2～3 s后，于4℃，10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min，靜置10 min后取上層溶液，水浴蒸干，用色譜純甲醇復(fù)溶，定容至1 mL，用0. 45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析.

1.5 Fpglu1動(dòng)力學(xué)測(cè)定

1.5.1人參皂苷Rb1，Rb2和Rc動(dòng)力學(xué)反應(yīng)時(shí)間的確定在20 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液( pH=7. 0)中，F(xiàn)pglu1分別與人參皂苷Rb1( 0. 036 mmol/L)、人參皂苷Rb2( 0. 200 mmol/L)和人參皂苷Rc( 1. 000 mmol/L)于70℃下反應(yīng)，間隔時(shí)間取樣.樣品處理方法參見(jiàn)1.4節(jié)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別做3個(gè)平行樣品，保證底物的消耗量不超過(guò)20%［18］.

酶活力單位( IU)定義:每分鐘催化轉(zhuǎn)化1 μmol人參皂苷所需的酶量定義為1 IU.

1.5.2米氏常數(shù)Km和vmax的測(cè)定利用液相色譜分析方法，分別測(cè)定人參皂苷Rb1，Rb2和Rc在0. 036～0. 900 mmol/L，0. 200～5. 000 mmol/L和1. 000～9. 700 mmol/L濃度范圍內(nèi)的酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù).

動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析依據(jù)Michael和Menten提出的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，即米氏方程進(jìn)行計(jì)算.

式中: v為不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)速度; vmax為最大反應(yīng)速度; Km為米氏常數(shù); c為底物濃度.

1.6計(jì)算方法

應(yīng)用Accelrys公司的Discovery Studio( DS) 3.5分子設(shè)計(jì)軟件包進(jìn)行同源模建及分子對(duì)接的計(jì)算.1.6.1同源模建DS3.5軟件的Homology Modeling主要基于MODELER程序［19］，其主要建模步驟如下: ( 1)使用序列相似性搜索工具BLAST或PSI-BLAST搜索目標(biāo)序列的模板; ( 2)使用結(jié)構(gòu)比對(duì)方法將模板進(jìn)行比對(duì)、疊合; ( 3)使用序列比對(duì)方法將目標(biāo)序列與模板結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行比對(duì); ( 4)使用MODELLER產(chǎn)生目標(biāo)序列的模型.對(duì)模建后的結(jié)構(gòu)應(yīng)用Procheck程序得到Ramachandran圖.

1.6.2分子對(duì)接采用DS3.5軟件的CDOCKER模塊進(jìn)行分子對(duì)接，CDOCKER是基于CHARMm力場(chǎng)的分子對(duì)接方法，能夠產(chǎn)生高精度的對(duì)接結(jié)構(gòu).將皂苷分子(人參皂苷Rb1，Rb2和Rc)放入活性口袋進(jìn)行多構(gòu)象搜索，利用CHARMm力場(chǎng)對(duì)復(fù)合物進(jìn)行模擬退火，以優(yōu)化對(duì)接構(gòu)象.將得到的配體構(gòu)象進(jìn)行聚類分析( RMSD≤0. 5 nm)，分析對(duì)接能量較低的前10個(gè)構(gòu)象，根據(jù)聚類情況和對(duì)接打分選取最佳構(gòu)象.

2　結(jié)果與討論

2.1 Fpglu1的純化

粗酶液經(jīng)鎳柱親和層析純化后，利用SDS-PAGE電泳法分析蛋白樣品純度.由圖1可見(jiàn)，目的蛋白呈單一條帶，其分子量約為54000，與該酶的預(yù)測(cè)分子量相符;經(jīng)純化后的目的蛋白純度達(dá)95%，濃度為7. 35 mg/mL.

Fig.1　SDS-PAGE analysis of Fpglu1 after purificationLane M: standard protein molecular mass makers; lane 1: Fpglu1 purified by Ni-NTA chromatography.

2.2 Fpglu1轉(zhuǎn)化人參總皂苷的產(chǎn)物鑒定

圖2為Fpglu1轉(zhuǎn)化人參總皂苷的HPLC分析結(jié)果.通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比對(duì)來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物.標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rb2，Rc，Rd，F(xiàn)2，Rg3，CMc，CK和Rh2的保留時(shí)間分別為9. 435，9. 544，13. 249，13. 848，14. 602，16. 195，21. 473，23. 136，24. 276，27. 123和27. 792 min［圖2( A)］.根據(jù)人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時(shí)刻反應(yīng)液中不同皂苷的含量，通過(guò)對(duì)比轉(zhuǎn)化前［圖2( B)］與轉(zhuǎn)化后［圖2( C)和( D)］各皂苷含量的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化過(guò)程中Re和Rg1的含量始終未發(fā)生變化，表明Fpglu1不能夠轉(zhuǎn)化Re和Rg1;反應(yīng)10 min后，Rb1轉(zhuǎn)化完全，Rb2和Rc含量均減少，而Rd的含量升高［圖2( C)］;反應(yīng)2 h時(shí)，Rb2轉(zhuǎn)化完全，Rc含量繼續(xù)減少，Rd的含量進(jìn)一步增多，并產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)后確定該物質(zhì)為稀有人參皂苷CK［圖2( D)］;反應(yīng)6 h時(shí)，Rc含量繼續(xù)減少，CK含量增加，Rd含量達(dá)到最高，并伴隨產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物2，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)后確定該物質(zhì)為稀有人參皂苷CMc［圖2( E)］;反應(yīng)66 h時(shí)，Rc和Rd含量均降低，CMc含量達(dá)到最高，CK含量進(jìn)一步增加［圖2( F)］;反應(yīng)78 h時(shí)，Rc轉(zhuǎn)化完全，Rd和CMc含量降低［圖2( G)］，CK含量增高;反應(yīng)102 h時(shí)，Rd和CMc含量繼續(xù)減少，CK含量達(dá)到最大［圖2 ( H)］.可見(jiàn)，控制反應(yīng)時(shí)間可分別獲得稀有人參皂苷Rd和CK，即6 h時(shí)，人參皂苷Rd的含量最高，產(chǎn)率可達(dá)60%; 102 h時(shí)，人參皂苷CK的含量最高，產(chǎn)率可達(dá)93%.

Fig.2　HPLC analysis of biotransformation of the ginseng root extract at different time( A) Standard ginsenosides; ( B)—( H) Fpglu1 reacted with 2 mg/mL ginseng root extract for 0，1/6，2，6，66，78 and 102 h，respectively in 20 mmol/L sodium phosphate buffer( pH=7. 5) at 70℃.

2.3 Fpglu1轉(zhuǎn)化人參總皂苷的轉(zhuǎn)化路徑

達(dá)瑪烷型人參皂苷根據(jù)其C3，C6和C20位上糖基種類和數(shù)量的不同可以分為二醇型人參皂苷和三醇型人參皂苷，而二醇型人參皂苷可根據(jù)C3和C20位上連接的糖基種類和數(shù)量的不同進(jìn)行區(qū)分.本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)pglu1對(duì)三醇型人參皂苷無(wú)水解活性，但能夠水解二醇型人參皂苷Rb1，Rb2和Rc，生成稀有人參皂苷Rd和CK.二醇型人參皂苷Rb1，Rb2和Rc的結(jié)構(gòu)相似，具有共同的原人參二醇型皂苷元，且C3位都連有2個(gè)葡萄糖［Glc-β-( 1，2) -Glc］，差別在于C20位側(cè)鏈糖基的不同，即Rb1的C20位是2個(gè)葡萄糖以β-( 1→6)糖苷鍵相連接，Rb2的C20位是1個(gè)阿拉伯吡喃糖和1個(gè)葡萄糖以α-( 1→6)阿拉伯糖苷鍵相連接，Rc的C20位是1個(gè)阿拉伯呋喃糖和1個(gè)葡萄糖以α-( 1→6)阿拉伯糖苷鍵相連接.研究［20］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1時(shí)，F(xiàn)pglu1先水解人參皂苷Rb1的C20位的β-( 1→6)糖苷鍵生成Rd，隨后水解其C3位的與皂苷元相連的葡萄糖苷鍵生成CK;當(dāng)轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb2時(shí)，F(xiàn)pglu1先水解人參皂苷Rb2的C20位的α-( 1→6)阿拉伯糖苷鍵生成Rd，再水解其C3位與皂苷元相連的葡萄糖苷鍵生成CK;當(dāng)轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc時(shí)，F(xiàn)pglu1經(jīng)過(guò)2條轉(zhuǎn)化路徑，即Fpglu1水解Rc的C20位的α-( 1→6)阿拉伯糖苷鍵生成Rd，再水解其C3位與皂苷元相連的葡萄糖苷鍵生成CK，或Fpglu1水解人參皂苷Rc的C3位與皂苷元相連的葡萄糖苷鍵生成CMc，再水解其C20位的α-( 1→6)阿拉伯糖苷鍵生成CK，2條路徑同時(shí)存在，并得到共同的最終產(chǎn)物CK.另外還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)pglu1不能水解人參皂苷CK的C20位內(nèi)側(cè)葡萄糖苷鍵.可見(jiàn)，F(xiàn)pglu1轉(zhuǎn)化人參總皂苷的轉(zhuǎn)化路徑為Rb1→Rd→CK，Rb2→Rd→CK以及Rc→Rd/CMc→CK，其中Rb1→Rd→CK為主要的轉(zhuǎn)化途徑(見(jiàn)圖3).

Fig.3　Transformation pathways of the ginsenosides Rb1，Rb2and Rc by Fpglu1The transformation pathways were Rb1→Rd→CK，Rb2→Rd→CK and Rc→Rd/CMc→CK.

2.4 Fpglu1轉(zhuǎn)化人參總皂苷的時(shí)間進(jìn)程

經(jīng)HPLC定量分析，由人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各皂苷含量分別為Rb10. 185 mg/mL( 0. 167 mmol/L)，Rb20. 049 mg/mL( 0. 046 mmol/L)，Rc 0. 083 mg/mL( 0. 077 mmol/L)和Rd 0. 054 mg/mL ( 0. 058 mmol/L).通過(guò)間隔時(shí)間取樣并經(jīng)HPLC檢測(cè)，F(xiàn)pglu1轉(zhuǎn)化人參總皂苷的時(shí)間進(jìn)程曲線如圖4所示.當(dāng)反應(yīng)6 h時(shí)，生成人參皂苷Rd 0. 197 mg/mL( 0. 208 mmol/L)，其摩爾產(chǎn)率為60%，平均生成速度為23. 8 mg·L－1·h－1;當(dāng)反應(yīng)102 h時(shí)，生成人參皂苷CK 0. 201 mg/mL( 0. 323 mmol/L)，其摩爾產(chǎn)率為93%，平均生成速度為1. 97 mg· L－1·h－1.

Fig.4　Production of Rd and CK from the ginseng root extract by Fpglu1●: Ginsenoside Rb1;○: Ginsenoside Rb2;▲: Ginsenoside Rc;△: Ginsenoside Rd;■: CMc;□: CK.

目前，用于Rd和CK轉(zhuǎn)化的糖苷酶類主要以單一皂苷作底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化［16，21～23］，而鮮見(jiàn)利用總皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化的報(bào)道.實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的人參總皂苷為人參根提取物，其制備過(guò)程簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，節(jié)約了生產(chǎn)稀有人參皂苷的工業(yè)成本.通過(guò)控制反應(yīng)時(shí)間，可應(yīng)用Fpglu1水解人參總皂苷較高產(chǎn)率生成稀有人參皂苷Rd和CK，為大量制備稀有人參皂苷Rd和CK奠定了基礎(chǔ).

2.5 Fpglu1轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1，Rb2和Rc的催化動(dòng)力學(xué)

利用HPLC法測(cè)定3種底物的反應(yīng)時(shí)間，根據(jù)人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得不同時(shí)刻底物的含量并計(jì)算轉(zhuǎn)化率.在70℃下，Rb1濃度為0. 036 mmol/L時(shí)，測(cè)定0，1，2和5 min時(shí)的底物轉(zhuǎn)化率; Rb2濃度為0. 200 mmol/L時(shí)，測(cè)定0，1，1. 5和2 h時(shí)的底物轉(zhuǎn)化率; Rc濃度為1. 000 mmol/L時(shí)，測(cè)定0，0. 5，1. 5，2和3 h時(shí)的底物轉(zhuǎn)化率.結(jié)果表明，當(dāng)控制反應(yīng)時(shí)間為1 min，1和1. 5 h時(shí)，人參皂苷Rb1，Rb2和Rc的底物轉(zhuǎn)化率均未超過(guò)20%，因此確定1 min，1和1. 5 h分別為測(cè)定3種底物動(dòng)力學(xué)的反應(yīng)時(shí)間.

人參皂苷Rb1( 0. 036～0. 900 mmol/L)，Rb2( 0. 200～5. 000 mmol/L)和Rc( 1. 000～9. 700 mmol/L)分別與Fpglu1在70℃反應(yīng)1 min，1和1. 5 h后，計(jì)算不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)速度.對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合后，得到Km值分別為0. 318，1. 840和5. 269 mmol/L，最大速度( vmax)值分別為1901. 41，18. 87和0. 69 mmol·L－1·h－1·mg－1，擬合曲線R2分別為0. 992，0. 992和0. 996(見(jiàn)圖5).

Fig.5　Fitting curve of ginsenosides Rb1( A)，Rb2( B) and Rc( C)

Km是酶促反應(yīng)的初速度為vmax的1/2時(shí)的底物濃度，僅與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)，Km值越小，表示酶與底物的親和力越高; vmax表示在一定酶量下的最大反應(yīng)速度，即酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶的濃度呈正比; kcat表示單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子將底物分子轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物的最大值，kcat越大，表示酶的催化效率越高.一般情況下，Km值越小，vmax值越大，kcat值也越大，對(duì)Fpglu1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果符合以上規(guī)律，即Fpglu1對(duì)3種皂苷底物的親和能力和催化效率從高到低的順序?yàn)镽b1＞Rb2＞Rc.

2.6 Fpglu1結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建及模型評(píng)價(jià)

通常，在同源模建中當(dāng)序列一致性高于30%時(shí)模建的結(jié)果具有較高的可信度.應(yīng)用BLAST Search模塊搜索到的模板序列與Fpglu1序列一致性為51. 48%，晶體結(jié)構(gòu)分辨率為0. 17 nm，因此選擇該蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)( 3wdp)作為模板，應(yīng)用DS3. 5軟件的Homology Modeling功能構(gòu)建Fpglu1的三維結(jié)構(gòu)模型.使用Ramanchandran Plot和Profile-3D對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估.

拉氏構(gòu)象圖［Ramachandran圖，圖6( A)］是以φ和ψ的角度為橫縱坐標(biāo)，規(guī)定φ和ψ角允許的構(gòu)象區(qū)域的一個(gè)圖形［φ( phi)表示一個(gè)肽單位中α碳右邊C—C鍵的旋轉(zhuǎn)角度，ψ( psi)表示α碳左邊C—N鍵的旋轉(zhuǎn)角度，通過(guò)該圖可鑒定蛋白質(zhì)構(gòu)象是否合理.圖6( A)中紅色的點(diǎn)表示落在不合理區(qū)域內(nèi)的殘基.Fpglu1結(jié)構(gòu)模型位于合理區(qū)域內(nèi)的殘基百分比為99. 14%，位于不允許區(qū)域內(nèi)的殘基均不在活性位點(diǎn)區(qū)域.

Profile-3D是一種基于“穿線”法的模型評(píng)估程序.該方法采用3D-1D的打分函數(shù)來(lái)檢測(cè)所構(gòu)建模型與自身氨基酸序列的匹配度關(guān)系，分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明同源模型的可信度越大.Fpglu1的Profiles-3D打分為222. 61，高于理想最高分212. 797，表明該建模蛋白的殘基均位于合理可信的位置.以上結(jié)果表明，經(jīng)同源建模所得的Fpglu1三維結(jié)構(gòu)合理可靠.

Fig.6　Ramachandran plot analysis and predicted 3D structure of Fpglu1( A) Ramachandran plot showing different regions of the modeled enzyme; ( B) the overall structure of the Fpglu1 model.

Fpglu1的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果如圖6( B)所示.Fpglu1的整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)1個(gè)典型TIM桶狀結(jié)構(gòu)，為糖苷水解酶家族1的典型結(jié)構(gòu)，TIM滾筒結(jié)構(gòu)的中心是平行的β片層結(jié)構(gòu)，周圍包裹著長(zhǎng)短相間的α螺旋.Fpglu1的三維結(jié)構(gòu)是由20個(gè)α螺旋和14個(gè)β折疊組成，β折疊形成了該酶的主體結(jié)構(gòu)，位于結(jié)構(gòu)的中心，α螺旋分布于β折疊的周圍.同時(shí)，結(jié)構(gòu)中有1個(gè)可供小分子物質(zhì)進(jìn)入的口袋式結(jié)構(gòu)，催化殘基Glu194和Glu367位于口袋中心位置，這是典型的外切型糖苷酶構(gòu)象.口袋的深度、長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)內(nèi)部疏水性的大小以及周圍氨基酸殘基的極性可能會(huì)影響該酶的活力或底物選擇性.以上結(jié)構(gòu)是Fpglu1發(fā)揮催化活力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)Fpglu1的結(jié)構(gòu)分析對(duì)于進(jìn)一步的定向進(jìn)化或定點(diǎn)改造具有借鑒意義.

2.7皂苷分子與Fpglu1結(jié)構(gòu)模型的分子對(duì)接及分析

迄今為止，糖苷酶催化皂苷類分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及催化機(jī)制的研究仍處于空白，而皂苷類分子作為β-葡萄糖苷酶的非天然底物，對(duì)皂苷分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究將有助于闡明其催化的選擇性機(jī)制.本文結(jié)果表明Fpglu1對(duì)人參皂苷Rb1，Rb2和Rc均具有催化活性，推測(cè)得到的活性中心附近區(qū)域的殘基為中心，應(yīng)用DS3.5軟件的CDOCKER模塊將3種皂苷分子(人參皂苷Rb1，Rb2和Rc)對(duì)接到蛋白活性中心處.由于皂苷分子的多環(huán)結(jié)構(gòu)使其剛性增強(qiáng)，因而選擇CDOCKER INTER-ENERGY值對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)［24］.

分子對(duì)接結(jié)果［圖7( A)］表明，底物位于活性部位的底物口袋中，此口袋中的疏水性氨基酸側(cè)鏈形成了底物口袋的疏水環(huán)境，這些疏水性氨基酸包括Phe139，Val197，Leu201，Phe210，Phe339，Trp341，Trp405，Trp413和Phe421.參與催化作用的2個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基，即β4上的Glu194和β10上的Glu367位于活性口袋中.為了進(jìn)一步確定參與底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基與底物的相互作用，選取距離底物0. 3 nm范圍內(nèi)的氨基酸為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)與底物可能具有相互作用的殘基還包括Ser13，His138，Asn193，Glu194，Gln200，Gln205，Met207，Ala208，Thr253，Asn291，Tyr293，Arg318，Tyr322，Glu326，Phe339，Glu367，Trp341，Trp405，Glu412，Trp413和Phe421.從皂苷分子與Fpglu1蛋白的二維結(jié)構(gòu)圖可知，皂苷分子可與Tyr293，Glu367，Glu412，Gln16，Trp413，His138和Asn193形成氫鍵; 而Phe139，Val197，Gln200，Leu201，Thr253，Phe421和Phe210則主要通過(guò)范德華力與底物相互作用［圖7( B)］.

Fig.7　Docking model of Fpglu1 with ginsenoside Rb1( A) A zooming view showing the docking model with ginsenoside Rb1.The hydrophobic amino acids around ginsenoside Rb1and the key catalytic amino acids were indicated.The ginsenoside Rb1and the surrounding amino acids are colored yellow and blue，respectively; ( B) amino acid residues close to ginsenoside Rb1inside the binding pocket of Fpglu1( 2D view).

通過(guò)CDOCKER計(jì)算得到的人參皂苷Rb1，Rb2和Rc與蛋白分子的相互作用能值呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)(見(jiàn)表1)，與動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，相互作用能值的變化趨勢(shì)與其動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值的變化趨勢(shì)一致，而與kcat值的變化趨勢(shì)相反，因而從能量的角度再次證明了Fpglu1的最適底物為人參皂苷Rb1，具有最大的催化效率.

Table 1　Kinetic parameters of Fpglu1 for Ginsenosides

3　結(jié)　論

Fpglu1能夠轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1，Rb2和Rc生成稀有人參皂苷Rd和CK，其摩爾產(chǎn)率可分別達(dá)到60%和93%;利用同源模建和分子動(dòng)力學(xué)模擬等生物信息學(xué)技術(shù)，探究了Fpglu1轉(zhuǎn)化人參皂苷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其相互作用.底物位于由疏水性氨基酸構(gòu)成的底物口袋中，Glu194和Glu367是參與催化作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km與對(duì)接的相互作用能量值存在線性關(guān)系.本文結(jié)果為實(shí)現(xiàn)高效率和低成本生產(chǎn)稀有人參皂苷Rd和CK提供了新型酶源，同時(shí)為糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷的定向進(jìn)化研究奠定了基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)

［1］Cheng Y.Q.，Jin Y.Z.，Liang D.C.，Chem.J.Chinese Universities，2011，32( 1)，67—73(成樂(lè)琴，金瑜真，梁德春.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2011，32( 1)，67—73)

［2］Chi H.，Kim D.H.，Ji G.E.，Biol.Pharm.Bull.，2005，28( 11)，2102—2105

［3］Kim S.K.，Park J.H.，J.Ginseng Res.，2011，35( 4)，389—398

［4］Wang Y.Z.，Chen J.，Chu S.F.，Wang Y.S.，Wang X.Y.，Chen N.H.，Zhang J.T.，J.Pharmacol.Sci.，2009，109( 4)，504—510

［5］Shin J.Y.，Lee J.M.，Shin H.S.，Park S.Y.，Yang J.E.，Cho S.K.，Yi T.H.，J.Ginseng Res.，2012，36( 1)，86—92

［6］Guan Y.Y.，Zhou J.G.，Zhang Z.，Wang G.L.，Cai B.X.，Hong L.，Qiu Q.Y.，He H.，Eur.J.Pharmacol.，2006，548( 1―3)，129—136

［7］Park J.S.，Shin J.A.，Jung J.S.，Hyun J.W.，Le T.K.V.，Kin D.H.，Park E.M.，Kim H.S.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2012，341 ( 1)，59—67

［8］Tsutsumi Y.M.，Tsutsumi R.，Mawatari K.，Nakaya Y.，Kinoshita M.，Tanaka K.，Oshita S.，Life Sci.，2011，88( 15/16)，725—729

［9］Suda K.，Murakami K.，Murata J.，Hasegawa H.，Saiki I.，J.Tradit.Chin.Med.，2000，17( 4)，144—150

［10］Li W.，Liu Y.，Zhang J.W.，Ai C.Z.，Xiang N.，Liu H.X.，Arch.Pharm.Res.，2009，32( 1)，49—57

［11］Jiang B.H.，Han Y.，Zhao Y.Q.，Hu X.M.，Zheng L.X.，Chin.Tradit.Herb.Drugs，2004，35( 9)，986—988(姜彬慧，韓穎，趙余慶，胡筱敏，鄭龍熙.中草藥，2004，35( 9)，986—988)

［12］Li G.H.，Shen Y.M.，Zhang K.Q.，Chinese Chem.Lett.，2005，16( 3)，359—361

［13］An D.S.，Cui C.H.，Sung B.H.，Yang H.C.，Kim S.C.，Lee S.T.，Im W.T.，Kim S.G.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2011，94 ( 3)，673—682

［14］Shin H.Y.，Park S.Y.，Sung J.H.，Kim D.H.，App.Environ.Microbiol.，2003，69( 12)，7116—7123

［15］An D.S.，Cui C.H.，Lee H.G.，Wang L.，Kim S.C.，Lee S.T.，Jin F.X.，Yu H.S.，Chin Y.W.，Lee H.K.，Im W.T.，Kim S.G.，App.Environ.Microbiol.，2010，76( 17)，5827—5836

［16］Quan L.H.，Jin Y.，Wang C.，Min J.W.，Kim Y.J.，Yang D.C.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，2012，39( 10)，1557—1562

［17］Yu S.S.，Yin H.B.，Wang X.Y.，F(xiàn)eng L.，Xu C.C.，Li J.，Han H.X.，Liu S.Y.，Chem.Res.Chinese Universities，2014，30( 5)，778—784

［18］Zhang D.J.，Screening of Highly Active Glycosidase for Rare Ginsenosides Production，Hanzhou Normal University，Hangzhou，2013(張道軍.高活性人參皂苷催化酶的篩選，杭州:杭州師范大學(xué)，2013)

［19］Tu G.G.，Liu C.，Liao Y.J.，Xiong S.T.，Li S.H.，Chem.J.Chinese Universities，2014，35( 5)，1063—1067(涂國(guó)剛，劉超，廖一靜，熊勝濤，李少華.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35( 5)，1063—1067)

［20］Park C.S.，Yoo M.H.，Noh K.H.，Oh D.K.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2010，87( 1)，9—19

［21］Son J.W.，Kim H.J.，Oh D.K.，Biotechnol.Lett.，2008，30( 4)，713—716

［22］Shin K.C.，Lee G.W.，Oh D.K.，J.Microbiol.Biotech.，2013，23( 4)，483—488

［23］Quan L.H.，Min J.W.，Jin Y.，Wang C.，Kim Y.J.，Yang D.C.，J.Agr.Food Chem.，2012，60( 14)，3776—3781

［24］Fang T.，Sun C.W.，Xu Y.Y.，Yuan J.，Wang Y.F.，Xing J.H.，Chem.Res.Chinese Universities，2014，30( 6)，931—936

Transformation of Minor Ginsenoside Rd and CK by Recombinant Thermostable β-Glucosidase?

XU Chunchun1，YU Bohao1，WANG Honglei2，LI Jing1，LIU Shuying1，3*，YU Shanshan1，4*
( 1.Jilin Ginseng Academy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130000，China; 2.School of Chemistry and Bioscience，Changchun University of Technology，Changchun 130024，China; 3.Changchun Center of Mass Spectrum，Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130022，China;
4.School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China)

Abstract Ginsenosides are the principle components that are responsible for the biological and pharmacological activities of ginseng.In this study，biotransformation of ginsenside Rd and CK by recombinant β-glucosidasse( Fpglu1) was studied by high performance liquid chromatography( HPLC).Structure modeling and molecular docking studies were performed to study the interaction between the protein and the ginsenosides.The results showed that ginsenoside Rd and CK could be transformed from major ginsenosides Rb1，Rb2and Rc by Fpglu1.The Kmvalues for Rb1，Rb2and Rc were 0. 318，1. 840 and 5. 269 mmol/L，and the kcatvalues were 144. 191，0. 572 and 0. 011 s－1，respectively.The highest productivity of ginsenoside Rd and CK were 60% and 93% with biotransformation time of 6 and 102 h，respectively.Molecular docking studies show that Glu194 and Glu367 are key active site residues and the predicted inter-energy exhibits linear relations to experimental Kmvalues and kcatvalues.

Keywords β-Glucosidase; Biotransformation; Ginsenoside; Kinetics

( Ed.: P，H，D，K)

?Supported by National Natural Science Foundation of China( No.31400682) and the Key Technologies R＆D Programme of Changchun，China( No.13KG60).

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 31400682)和長(zhǎng)春市重大科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 13KG60)資助.

收稿日期:2015-07-09.網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-26.

doi:10.7503/cjcu20150536

中圖分類號(hào)O629; O641

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介:于珊珊，女，博士，講師，主要從事人參皂苷生物轉(zhuǎn)化研究.E-mail: yushanshan001@ aliyun.com劉淑瑩，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事質(zhì)譜學(xué)研究.E-mail: syliu@ ciac.jl.cn