李慧娟，蔣　犁，余章斌，韓樹(shù)萍，劉雪華

1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院兒科，南京 210009　2南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京婦幼保健院兒科，南京 210004

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·論著·

室間隔缺損相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUC40- 的生物信息學(xué)及表達(dá)譜分析

李慧娟1，蔣犁1，余章斌2，韓樹(shù)萍2，劉雪華2

1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院兒科，南京 2100092南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京婦幼保健院兒科，南京 210004

摘要：目的探討TUC40- 在人和小鼠心臟胚胎發(fā)育過(guò)程中是否發(fā)揮作用。方法應(yīng)用生物信息學(xué)網(wǎng)站NCBI、UCSC、Uniprot及軟件Clustal、DNAMAN、MEGA 6等，對(duì)TUC40- 及其編碼片段uc.40- 進(jìn)行分析；采用鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)TUC40- 與其正義鏈產(chǎn)物Pbx1 mRNA在小鼠胚胎心臟發(fā)育關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)譜。結(jié)果Uc.40- 于核苷酸序列、基因組位置及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)3個(gè)水平在人和小鼠具有保守性。TUC40- 與Pbx1 mRNA在小鼠心臟胚胎發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)負(fù)性趨勢(shì)。結(jié)論Uc.40- 的多水平保守性提示了TUC40- 功能的保守性。TUC40- 可能是通過(guò)調(diào)控Pbx1，在人和小鼠的心臟胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；生物信息學(xué)；保守性；表達(dá)譜；室間隔缺損

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：1-8

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)TUC40- 的全稱(chēng)是transcribed uc.40-，uc.40- 屬于一系列被稱(chēng)作超保守片段(ultraconserved elements，UCEs)的DNA片段，這些片段的堿基序列在人、大鼠、小鼠這3個(gè)物種中是100%保守的，這種序列的高度保守性暗示了功能的保守性和重要性。本課題組前期收集了孕17周經(jīng)胎兒心臟超聲診斷室間隔缺損(室缺)的流產(chǎn)胎兒心臟標(biāo)本，與同時(shí)間點(diǎn)正常流產(chǎn)標(biāo)本，每組取3個(gè)標(biāo)本混樣，進(jìn)行l(wèi)ncRNA差異表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)的lncRNA中，uc.40- 在所有UCEs中過(guò)表達(dá)的倍數(shù)最高，為4.87倍，而其他UCEs的過(guò)表達(dá)倍數(shù)波動(dòng)于2.11～3.83倍。此外，uc.40- 位于Pbx1的反義鏈上，以往研究顯示，Pbx1敲除小鼠可出現(xiàn)室缺表型[1-2]。uc.40- 與Pbx1呈現(xiàn)正反義關(guān)系，正反義基因通常有相互作用，而后者與室缺相關(guān)。因此本研究選擇uc.40- 為研究對(duì)象，擬通過(guò)對(duì)TUC40- 和uc.40- 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢測(cè)Pbx1/TUC40- 在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)譜，闡述TUC40- 與人和小鼠胚胎心臟發(fā)育的潛在關(guān)系。

材料和方法

序列保守性分析——進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建流程：(1)選擇常用于構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的物種，包括：靈長(zhǎng)類(lèi)(人、黑猩猩)、嚙齒類(lèi)(大鼠、小鼠)、其他哺乳動(dòng)物類(lèi)(牛、豬、大象)、其他脊柱類(lèi)(雞)、兩棲類(lèi)(非洲爪蟾、熱帶爪蟾)及魚(yú)類(lèi)(斑馬魚(yú)、大長(zhǎng)須鯨)共12個(gè)物種(表1)；(2)在NCBI Blast(http：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行比對(duì)，將所得序列及人uc.40- 序列以fasta格式保存于txt文檔中；(3)將上述序列導(dǎo)入MEGA 6，利用CLUSTAL X進(jìn)行多重比對(duì)，比對(duì)結(jié)果利用DNAMAN拼接制圖；(4)選擇最大簡(jiǎn)約法(maximum-parsimony，MP；適合用于相似度較高的序列)構(gòu)建uc.40- 的進(jìn)化樹(shù)，采用bootstrap檢驗(yàn)法，次數(shù)為1000次。

表 1　進(jìn)化樹(shù)包含的物種及uc.40- 序列在各個(gè)基因組中的比對(duì)結(jié)果

a：所示兩個(gè)物種比對(duì)結(jié)果顯示為uc.40，說(shuō)明這兩個(gè)物種基因組中已有超保守區(qū)域的注釋?zhuān)籦：Un表示數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示染色體未知

a：represent that the blast results feedback as uc.40，indicating that the UCE annotation already exist in the two species；b：Un means that the chromosome location is not for sure yet

基因組位置比對(duì)采用uc.40-序列在NCBI中應(yīng)用Blast進(jìn)行序列比對(duì)，獲得其在人和小鼠基因組中的位置。

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用HMR conserved transcription factor binding site(http：//genome.ucsc.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)，查找在人和小鼠中保守的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄因子；在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中(http：//www.uniprot.org/)查找轉(zhuǎn)錄因子的功能。

TUC40-、Pbx1表達(dá)譜檢測(cè)因小鼠胚胎心臟發(fā)育于胚胎10.5 d(E10.5)時(shí)完成環(huán)化，E14.5時(shí)四腔心完全形成，故選擇在E10.5、E14.5及生后(neo)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取心臟及肺、腦、肝、胃5個(gè)臟器。在E10.5，由于臟器體積小、取材困難，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)心臟和腦的樣本數(shù)量分別有3個(gè)(每個(gè)樣本由1只孕鼠所有胎鼠的心或腦混合)；此外在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)由于肺、胃、肝在實(shí)驗(yàn)用光鏡下不可見(jiàn)，即便設(shè)法取材也難以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，因此沒(méi)有取材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在E14.5，每種臟器的數(shù)量為4～6個(gè)(每個(gè)樣本由1只孕鼠所有胎鼠的相應(yīng)臟器混合)。在neo，每種臟器數(shù)量為4～6個(gè)，并且來(lái)源于單一新生小鼠(1只新生小鼠的某種臟器足夠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn))。

RNA提?。翰捎肨rizol(Life Technologies，美國(guó))法提取總RNA。動(dòng)物標(biāo)本取材、清洗后立即加入1 ml Trizol(單個(gè)胚胎某個(gè)臟器的標(biāo)本量不足時(shí)，將同孕母胎鼠的該臟器混合)；超聲勻漿機(jī)(Uibracell，Sonics and materials，美國(guó))勻漿后加入200 μl三氯甲烷，劇烈搖晃震動(dòng)15 s以上，室溫靜止15 min后，12 000×g4℃離心15 min；吸出上清，加入等體積于上清的異丙醇，翻轉(zhuǎn)混勻，稍靜置后予12 000×g4℃離心10 min，倒棄上清；加入1 ml 75%冰浴乙醇，盡量吹散團(tuán)塊，7500×g4℃離心5 min(該步驟重復(fù)2次)；倒掉上清，紙上瀝干，加入適量焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate,DEPC)水溶解，然后測(cè)定RNA濃度及純度。

鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用RevertAid Reverse Transcriptase(Thermo Scientific，美國(guó))。采用Primer 3(http：//primer3.ut.ee/)在線引物設(shè)計(jì)軟件，從目標(biāo)序列的3’端設(shè)計(jì)，TUC40-、Pbx1、GAPDH的strand-specific引物分別為5’-ACAGCCCCTCAGCTT- GTTAG- 3’、5’-GTCTGTGGGCTCCTCTTCTT- 3’、5’-TC AAGAGAGTAGGGAG GGCT- 3’。先將底物混勻：1 μg模板RNA，2 μl strand-specific primer，DEPC水補(bǔ)齊至12.5 μl；然后繼續(xù)加入試劑：4 μl反應(yīng)緩沖液，0.5 μl RNA酶抑制劑，2 μl脫氧核糖核苷三磷酸混合物，1 μl聚合酶。反應(yīng)流程為：42℃ 60 min，70℃ 10 min。以上反應(yīng)所得即為T(mén)UC40-、Pbx1及GAPDH相應(yīng)的cDNA模板，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[3]。

實(shí)時(shí)定量PCR：試劑盒采用Power SYBR?Green PCR Master Mix(Life Technologies，美國(guó))。TUC40-、Pbx1、GAPDH的PCR引物分別為5’-TCCTACCAGACTCCCAAGCA，3’-TCTAACAAGCTGAGGGGCTG；5’-CATC GGGGACATTTTACAGCA，3’-CTCCTCTTCTTGGGCTCCC；5’-CTGCGACTTCAACAGCAACT，3’-GAGTTGGGATAGG GCCTCTC。反應(yīng)體系為預(yù)混液(SYBR Green PCR Master Mix)12.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，cDNA模板1 μl，DEPC水10.5 μl，共20 μl。反應(yīng)流程為：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，循環(huán)40次。通過(guò)熔解曲線及電泳結(jié)果確認(rèn)產(chǎn)物是否正確。相對(duì)表達(dá)量通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物所需的循環(huán)次數(shù)(cycle threshold，CT)值來(lái)計(jì)算(2-△CT法)，其中△CT=CTsample-CTGAPDH。

瓊脂糖凝膠電泳：用瓊脂糖粉(Biowest，西班牙)制成濃度為1.5%的凝膠(DNA分離范圍為0.2～4 kb)，將1 μl PCR產(chǎn)物與4 μl上樣緩沖液(含核酸染料Gelred，Generay，中國(guó))混勻后加入凝膠的點(diǎn)樣孔中，并同時(shí)上樣DNA marker(含核酸染料Gelred，Generay，中國(guó))。電泳電壓為60V，時(shí)間為45 min。電泳完畢后在紫外燈下顯影。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

生物信息學(xué)查詢結(jié)果進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，人和小鼠、大長(zhǎng)須鯨、大鼠、黑猩猩的uc.40- 之間沒(méi)有進(jìn)化距離，分支點(diǎn)處的支持度基本在90以上(圖1)。

Uc.40- 在人基因組中位于chr1：164，668，725- 164，668，971(GRCh38/hg19)；在小鼠基因組中位于chr1：168，327，865- 168，328，111(GRCm38.p3，C57BL/6J)。Uc.40-(轉(zhuǎn)錄方向?yàn)?’到5’)在兩個(gè)物種中全長(zhǎng)均為247nt，對(duì)應(yīng)著Pbx1(轉(zhuǎn)錄方向?yàn)?’到3’)的第2個(gè)內(nèi)含子(圖2)。

圖左下角的標(biāo)尺長(zhǎng)度代表進(jìn)化距離為1個(gè)核苷酸，uc.40- 在物種之間的進(jìn)化距離為樹(shù)枝(橫線條)長(zhǎng)度之差，節(jié)點(diǎn)處(樹(shù)枝分叉點(diǎn))的數(shù)字代表“支持度”，通過(guò)步展法(Bootstrap)計(jì)算得來(lái)，數(shù)字取向?yàn)?0～100，數(shù)字越大表示越支持分支形成

Scale length(left corner) represents one nucleotide/site and difference between the branches(horizontal lines) represents the evolutionary distance between species, numbers under the node(branch bifurcation point) represent the support rate which is calculated by Bootstrap, the numbers vary from 50 to 100，with the higher numbers meaning stronger support for branch formation

圖1uc.40- 多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)

Fig1Multiple alignment of uc.40- and the phylogenetic tree

表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果在E10.5時(shí)間點(diǎn)，TUC40- 在心臟及腦中的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在E14.5時(shí)間點(diǎn)，TUC40- 在5個(gè)臟器中的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中，TUC40- 在腦與其他各臟器中的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在肝臟與胃中的表達(dá)量差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在neo時(shí)間點(diǎn)，TUC40- 在5個(gè)臟器中的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中，在心臟與腦、肺、胃的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在腦與肝臟、胃的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在肝臟與肺、胃的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖4A)。

在小鼠胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中，TUC40- 在E10.5與neo的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈下降趨勢(shì)，隨著TUC40- 表達(dá)量的下降，Pbx1呈上升趨勢(shì)(E10.5比E14.5，P<0.01；E10.5比neo，P<0.01；E14.5比neo，P<0.05；3組間，P<0.01)。在腦中，盡管TUC40- 的表達(dá)量在E10.5與E14.5間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且Pbx1在E10.5與E14.5(P<0.05)、E10.5與neo(P<0.01)及3組間(P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但整體并沒(méi)有明顯的正性或負(fù)性變化趨勢(shì)。在肝臟和胃中，無(wú)論TUC40- 還是Pbx1，在E14.5和neo間的表達(dá)量差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在肺中，僅Pbx1的表達(dá)量在E14.5和neo間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TUC40- 的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化(圖4B)。

A.uc.40- 序列在人和小鼠基因組的比對(duì)圖；B.相應(yīng)的示意圖

A. alignment picture of uc.40- in human and mouse genomes；B. the schematic diagram

圖2uc.40- 在人和小鼠基因組的比對(duì)結(jié)果

Fig2Blast results of uc.40- in human and mouse genomes

圖3保守的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子

Fig3Conserved transcription factor(TF) binding sites and the corresponding TFs

aP<0.05,bP<0.01

A.3個(gè)時(shí)間點(diǎn)及不同臟器中TUC40- 及Pbx1的相對(duì)表達(dá)量；B.胚胎心臟RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄及PCR后所得產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶，第1、2、3泳道分別為T(mén)UC40-、Pbx1、GAPDH，第4泳道為隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄后生成的GAPDH(用于對(duì)照產(chǎn)物的準(zhǔn)確性)，第6泳道為DNA marker

A. expression profile of three time points and the five organs；B. the AGE of PCR product of embryonic heart, lanes 1，2，and 3 represent TUC40-，Pbx1，and GAPDH，respectively，lane 4 represents GAPDH generated from random primers initiated reverse transcription(to show the accuracy of the product)，and lane 6 is the DNA marker

圖4表達(dá)譜及PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

Fig4Expression profile of TUC40- /Pbx1 and the agarose gel electrophoresis(AGE) of PCR product

討論

LncRNA是一類(lèi)編碼蛋白質(zhì)能力弱、長(zhǎng)度大于200nt的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[4]。UCEs包含481條在人、大鼠、小鼠基因組中100%保守的DNA片段(http：//users.soe.ucsc.edu/～jill/ultra. html，http：//users.soe.ucsc.edu/～jill/ultra.watson.fa)[5]。 UCEs(包含在ultraconserved regions，UCRs)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稱(chēng)為transcribed-UCRs，即T-UCRs，這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物組成了超保守lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[6]。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，lncRNA的保守性相對(duì)于microRNA等并不強(qiáng)，因此T-UCRs是lncRNA中非常特殊的一部分[7]。

20世紀(jì)60年代以來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)資料的迅速積累，分子進(jìn)化逐漸成為生物信息學(xué)的重要組成部分。通過(guò)比較物種間某一個(gè)生物分子的變化，也就是進(jìn)化分析，來(lái)研究其演變，有助于理解其功能[8]。本研究中的多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)基本能夠反映uc.40-在物種之間的高度保守性，且uc.40- 在人及小鼠的基因組位置也相同。Basu等[7]利用小鼠的lncRNA基因組表達(dá)譜，在魚(yú)中找到了相應(yīng)的基因組保守區(qū)域，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些保守區(qū)域周?chē)牡鞍拙幋a基因在GO分析中呈現(xiàn)出相似的作用。與之類(lèi)似的是，互為反義的一對(duì)lncRNA Pldi-AK158810在進(jìn)化上出現(xiàn)于哺乳動(dòng)物這一分支中，并且這一基因區(qū)域(包括其兩端的基因片段)在哺乳動(dòng)物當(dāng)中是保守的[9]。結(jié)合上述兩個(gè)例子筆者認(rèn)為，相同的基因組位置暗示著TUC40-在人和小鼠可能發(fā)揮相似的作用。

除外核苷酸序列和基因組位置，uc.40- 在兩個(gè)物種能夠結(jié)合的與心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子也是保守的。綜合上述不同層次的保守性判斷，筆者猜測(cè)，與人室缺相關(guān)的TUC40- 可能在小鼠胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮了作用。

LncRNA種類(lèi)繁多，其中一類(lèi)是反義lncRNA(antisense lncRNA)，即天然反義轉(zhuǎn)錄物。Antisense lncRNA能通過(guò)影響其正義鏈基因的轉(zhuǎn)錄活性或其產(chǎn)物來(lái)發(fā)揮作用[10]，如著名的BACE1-AS就是通過(guò)與其sense基因BACE1(編碼致阿爾茨海默病的關(guān)鍵酶)的mRNA形成復(fù)合物，增加BACE1 mRNA的穩(wěn)定性，從而加速阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展[11]。

本研究表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果顯示，TUC40- 在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)具有時(shí)空特異性，盡管TUC40- 并非心臟特異性表達(dá)，且在心臟中的表達(dá)量并非最高，但是TUC40- 在小鼠胚心發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這在其他臟器中并沒(méi)有出現(xiàn)，并且Pbx1/TUC40- 在小鼠胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)負(fù)性關(guān)系。因此結(jié)合Pbx1與室缺的相關(guān)性，筆者認(rèn)為，TUC40- 可能通過(guò)調(diào)控Pbx1，進(jìn)而影響小鼠胚心發(fā)育。

本研究存在以下不足：(1)文中進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建依據(jù)的是比對(duì)所得的片段，而非已證實(shí)的完整編碼lncRNA的片段，故而這個(gè)進(jìn)化樹(shù)尚不完善；(2)TUC40- 與小鼠心臟發(fā)育的相關(guān)性只有表達(dá)譜這一支持依據(jù)，尚沒(méi)有功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上，本研究作為一個(gè)探索性實(shí)驗(yàn)，通過(guò)保守性分析這個(gè)橋梁，把人和小鼠的TUC40- 聯(lián)系起來(lái)，推測(cè)TUC40- 可能與人和小鼠的胚胎心臟發(fā)育及室缺發(fā)生有關(guān)，并可能是通過(guò)調(diào)控Pbx1來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但以上推測(cè)尚需要進(jìn)一步功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證明。

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Bioinformatic and Expression Analysis of Ventricular Septal Defect-associated Long Non-coding RNA TUC40-

LI Hui-juan1，JIANG Li1，YU Zhang-bin2，HAN Shu-ping2，LIU Xue-hua2

1Department of Pediatrics，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing 210009，China2Department of Pediatrics，Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital， Nanjing Medical University，Nanjing 210004，China Corresponding author：YU Zhang-binTel/Fax：025- 52226561，E-mail：zhangbinyu@njmu.edu.cn

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the potential role of TUC40- in human and mouse embryonic heart development. MethodsBioinformatics databases including NCBI，UCSC，and Uniprot and software including Clustal，DNAMAN，and MEGA 6 were used to collect information of TUC40- and uc.40-. The expression profile at key time points of heart development was investigated by strand-specific quantitative real time polymerase chain reaction. ResultsUc.40- was conservative in sequence，genomic location，and transcription factor binding sites across human and mouse. Pbx1/TUC40- showed negative trend during embryonic mouse heart maturation. ConclusionsVarious levels of conservation of uc.40- suggests similar functions of TUC40- in these two species. TUC40- may play its roles in human and mouse embryonic heart development by regulating Pbx1.

Key words：long non-coding RNA；bioinformatics；conservation；expression profile；ventricular septal defect

(收稿日期：2015- 03- 23)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.001

中圖分類(lèi)號(hào):Q752

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1000- 503X(2016)01- 0001- 08

通信作者：余章斌電話/傳真：025- 52226561，電子郵件：zhangbinyu@njmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81470376)、江蘇省自然科學(xué)基金(BK20141077)和南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展資金(YKK14123)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81470376)，the Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20141077)，and the Medicine and Technology Development Foundation of Nanjing(YKK14123)