王曉華，王倩，趙建美

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

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MMP-9、AECA、ANCA蛋白在川崎病外周血的表達(dá)及其與冠狀動(dòng)脈損害的關(guān)系

王曉華，王倩，趙建美

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

摘要：目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)和抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(ANCA)在川崎病(KD)冠狀動(dòng)脈損害中的作用及臨床意義。方法選取KD患兒42例，分為冠脈損害(CAL)組16例，無(wú)冠脈損害(NCAL)組26例，以20例普通發(fā)熱患兒、15例擇期手術(shù)患兒作為對(duì)照組。ELISA檢測(cè)各組血清MMP-9、AECA和ANCA蛋白水平；熒光定量PCR、明膠酶譜法分別測(cè)定單個(gè)核細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)及血清MMP-9酶活性。結(jié)果KD急性期外周血MMP-9 mRNA表達(dá)、蛋白水平及酶活性均高于兩對(duì)照組(P均<0.01)，CAL組較NCAL組升高更顯著(P均<0.05)。KD緩解期MMP-9 mRNA表達(dá)、蛋白水平及酶活性較急性期降低(P均<0.01)。KD急性期AECA、ANCA蛋白水平均高于兩對(duì)照組(P均<0.01)。CAL組ANCA蛋白水平高于NCAL組(P<0.01)。KD急性期血清AECA水平與MMP-9呈正相關(guān)(r=0.77，P<0.01)。急性期CAL組MMP-9、ANCA與冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑/主動(dòng)脈瓣環(huán)內(nèi)徑比值呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.57，P<0.05；r=0.88，P<0.01)。結(jié)果MMP-9、AECA、ANCA蛋白參與KD血管炎及冠脈損害過(guò)程，檢測(cè)其血清水平對(duì)早期預(yù)測(cè)冠脈損害有一定價(jià)值。

關(guān)鍵詞：川崎??；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體；抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體；冠狀動(dòng)脈損害

川崎病(KD)是一種病因不明的全身中小血管炎性疾病，該病最嚴(yán)重的并發(fā)癥是冠狀動(dòng)脈損害，約4%的患兒因冠狀動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致成人期缺血性心臟病?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是由內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等合成分泌的具有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用的蛋白酶?？箖?nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)和抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(ANCA)是存在于循環(huán)中的自身抗體，被視為原發(fā)性小血管炎特異的血清標(biāo)志[1,2]，與多種血管炎性免疫性疾病有關(guān)。本研究觀察KD患兒外周血MMP-9、ANCA、AECA水平變化，探討KD血管炎及冠狀動(dòng)脈損害的病理機(jī)制，為預(yù)測(cè)KD冠脈損傷及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1 臨床資料 2012年6月～2013年12月本院診斷明確KD患兒42例，男25例、女17例，年齡(24.2±21.2)月；均符合第七次世界小兒KD研討會(huì)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。42例患兒中，冠脈損害16例(CAL組)、左冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑(LCA)/主動(dòng)脈瓣環(huán)內(nèi)徑(AAO)比值為0.26±0.04，無(wú)冠脈損害26例、LCA/AAO比值為0.16±0.02。超聲心動(dòng)圖冠脈損害判斷標(biāo)準(zhǔn)：①冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜回聲增強(qiáng)；②LCA超過(guò)鄰近節(jié)段內(nèi)徑的1.5倍；③LCA/AAO比值>0.2[4]。CAL組16例中，單純冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜回聲增強(qiáng)2例，LCA/AAO比值>0.2者14例(其中3例伴管壁內(nèi)膜回聲增強(qiáng)，1例同時(shí)有LCA超過(guò)鄰近節(jié)段內(nèi)徑的1.5倍)。隨機(jī)選取年齡、性別相仿的同期住院發(fā)熱(體溫≥38.5 ℃，主要為下呼吸道感染)患兒20例和兒外科擇期手術(shù)患兒15例分別作為發(fā)熱對(duì)照組和正常對(duì)照組。各組年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

1.2血液樣品采集分別于KD急性期(治療前)及緩解期(治療7~10 d)各采集外周靜脈血5 mL，取3 mL全血立即注入肝素抗凝試管，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。另2 mL血離心后取血清，保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。兩對(duì)照組患兒只采血1次，樣品處理方法同上。

1.3血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白水平檢測(cè)人MMP-9、AECA、ANCA ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟操作，根據(jù)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.4單個(gè)核細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)檢測(cè)采用熒光定量PCR法。在分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞中加1 mL TRIzol勻漿，依次經(jīng)過(guò)氯仿、異丙醇等提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μL。取1μL cDNA行PCR，反應(yīng)體系20 μL：Fast SYBR Green Master Mix(Roche) 10 μL，上下游引物各1μL，ddH2O 7μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min, 共45個(gè)循環(huán)(95 ℃、20 s，63 ℃、20 s，72 ℃、40 s)。

1.5血清MMP-9酶活性測(cè)定采用明膠酶譜法。冷凍血清室溫解凍后，取20 μL與等體積上樣緩沖液混勻，于含1%明膠溶液的10%丙烯酰胺凝膠垂直電泳槽中電泳，電泳結(jié)束后凝膠用含Triton X-100的明膠洗脫液振蕩洗滌1 h以洗去SDS。37 ℃孵育24 h，0.1%考馬斯亮藍(lán)染液染色約30 min，A、B、C脫色液(由甲醇、乙酸、三蒸水配制)脫色1 h，直至藍(lán)色背景上出現(xiàn)白色條帶。用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果，以白色條帶的凈光密度值為相對(duì)定量樣品中酶活性大小。

2結(jié)果

2.1各組血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及單個(gè)核細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)見(jiàn)表1。

表1　各組血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及單個(gè)核細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與發(fā)熱對(duì)照組比較，aP<0.01，bP<0.05；與KD組緩解期比較，#P<0.01。

2.2CAL組、NCAL組血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及單個(gè)核細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)見(jiàn)表2。

表2　CAL組、NCAL組血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及單個(gè)核細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)比較

注：與NCAL組同期比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

2.3各組外周血清MMP-9酶活性血清MMP-9酶活性凈光密度值CAL組急性期、緩解期分別為13.19±4.07、4.80±2.01，NCAL組分別為9.61±3.01、4.68±1.99，發(fā)熱對(duì)照組為4.92±1.26，正常對(duì)照組為2.65±0.99。CAL組、NCAL組急性期與緩解期比較血清MMP-9酶活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.01)；CAL組、NCAL組急性期與發(fā)熱對(duì)照組、正常對(duì)照組比較血清MMP-9酶活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.01)。

2.4各檢查指標(biāo)的相關(guān)性KD急性期血清AECA水平與MMP-9水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.77，P<0.01)。CAL組急性期血清MMP-9、ANCA水平均與LCA/AAO比值呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.57，P<0.05；r=0.88，P<0.01)。

3討論

在MMPs超家族中，MMP-9與KD血管病變關(guān)系最為緊密。MMP-9能夠降解膠原酶和彈性蛋白酶，破壞血管內(nèi)膜的內(nèi)皮下層，有利于中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等向血管壁深層浸潤(rùn)，導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)的破壞[5]。Sakata等[6]在死亡KD患兒的冠狀動(dòng)脈標(biāo)本中檢測(cè)到異常增高的MMP-9，且發(fā)現(xiàn)急性期血清MMP-9水平高于對(duì)照組。我們的研究顯示，KD急性期MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)都增高，CAL組增高更顯著。由于在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)作用的只有激活狀態(tài)的MMP-9，即MMP-9酶，血清MMP-9蛋白水平升高不代表MMP-9酶活性增強(qiáng)，因此我們又測(cè)定外周血清MMP-9酶活性。結(jié)果顯示，KD急性期MMP-9酶活性亦增強(qiáng)，在CAL組尤為明顯。相關(guān)分析提示血清MMP-9與LCA/AAO比值呈正相關(guān)，即與冠脈損害嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。故監(jiān)測(cè)外周血MMP-9蛋白水平可了解血管基底膜降解情況，有助于早期預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈損害。

內(nèi)皮細(xì)胞功能異常是導(dǎo)致KD血管炎及并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害的重要環(huán)節(jié)。AECA是B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性的自身抗體，與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后可以通過(guò)以下途徑介導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷和功能障礙：①上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，吸引單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的遷移和聚集；②增加炎性細(xì)胞因子、趨化因子的合成，活化內(nèi)皮細(xì)胞；③通過(guò)補(bǔ)體或抗體的細(xì)胞毒作用引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和溶解；④與磷脂或者熱休克蛋白60結(jié)合誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；⑤刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血管性假血友病因子、組織因子，促進(jìn)血栓形成[1,7,8]。早期研究顯示，AECA水平與KD患兒疾病的活動(dòng)性相關(guān)，治療后AECA水平下降[9]。本研究顯示，KD組血清AECA水平高于兩對(duì)照組，但CAL組與NCAL組無(wú)差異，CAL組血清AECA與LCA/AAO比值也無(wú)相關(guān)性。由此可見(jiàn)，雖然AECA介導(dǎo)內(nèi)皮損傷及功能障礙是引起KD血管炎及冠脈損害的因素之一，但急性期血清AECA增高不能預(yù)測(cè)是否并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害。

ANCA作用主要表現(xiàn)為介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化、釋放活性氧、細(xì)胞因子、蛋白溶解酶等毒性介質(zhì)，誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致局部血管功能異常[10，11]。近年來(lái)ANCA與KD的相關(guān)研究各家報(bào)道存在爭(zhēng)議[12，13]。我們結(jié)果顯示，KD急性期ANCA水平高于兩對(duì)照組，CAL組升高更明顯，CAL組血清ANCA與LCA/AAO比值呈正相關(guān)；緩解期ANCA水平降低。提示ANCA與KD病情活動(dòng)有關(guān)，且在冠脈損害過(guò)程中發(fā)揮一定作用，檢測(cè)血清ANCA水平對(duì)冠脈損害的發(fā)生有預(yù)警意義。

綜上所述，MMP-9降解血管壁細(xì)胞外基質(zhì)，AECA、ANCA損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，三者均作為重要致病因素參與KD血管炎及冠狀動(dòng)脈損害的發(fā)生發(fā)展；MMP-9與AECA可能通過(guò)細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞介導(dǎo)存在協(xié)同增強(qiáng)作用；檢測(cè)血清MMP-9和ANCA蛋白水平對(duì)于早期預(yù)測(cè)冠脈損害有一定指導(dǎo)價(jià)值。

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Expression of MMP-9, AECA and ANCA in peripheral blood of patients with Kawasaki disease and its relationship with coronary artery lesions

WANGXiaohua,WANGQian,ZHAOJianmei

(TheAffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the potential role and clinical significance of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), anti-endothelial cell antibodies (AECA) and anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) in vasculitis and coronary artery lesions (CAL) of patients with Kawasaki disease (KD). MethodsForty-two children with KD were divided into two groups: CAL group (n=16) and non-coronary artery lesion (NCAL) group (n=26). Twenty febrile children and 15 children for selective operation were chosen as the control group. Serum levels of MMP-9, AECA and ANCA were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence quantitative-PCR and gelatin zymography were respectively used to detect MMP-9 mRNA expression and enzyme activity. ResultsThe MMP-9 mRNA expression, protein level and enzymatic activity in the acute phase of KD patients were all higher than those in the two control groups (all P<0.01), and they were significantly higher in the CAL group than in the NCAL group (all P<0.05). Moreover, MMP-9 mRNA expression, enzymatic activity and protein level were decreased significantly in the remission phase (all P<0.01). Serum AECA and ANCA protein levels of KD patients in the acute phase were significantly higher as compared with those of the two control groups (all P<0.01). The protein level of ANCA in the CAL group was significantly higher than that of the NCAL group (P<0.01). There was a positive correlation between serum MMP-9 and AECA protein in the acute phase of KD (r=0.77, P<0.01). The serum MMP-9 and ANCA protein levels of the CAL group in the acute phase were both positively correlated with LCA/AAO ratio (r=0.57, P<0.05; r=0.88, P<0.01). ConclusionsMMP-9, AECA and ANCA are potential pathological factors in the formation of KD vasculitis and CAL. The serum level detection has a certain value for early prediction of CAL.

Key words:Kawasaki disease; matrix metalloproteinase 9; anti-endothelial cell antibody; anti-neutrophil cytoplasmic antibody; coronary artery lesions

(收稿日期：2015-11-05)

通信作者簡(jiǎn)介：趙建美(1971-)，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事川崎病發(fā)病機(jī)制及干預(yù)的研究，為江蘇省“六大人才高峰”人才、南通市“226”人才培養(yǎng)對(duì)象。近五年主持江蘇省衛(wèi)生廳、江蘇省人力資源社會(huì)保障廳醫(yī)學(xué)項(xiàng)目各1項(xiàng)，參與國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目1項(xiàng)，獲江蘇省衛(wèi)生廳新技術(shù)引進(jìn)二等獎(jiǎng)2項(xiàng)。E-mail：zjmheart@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R725.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)05-0010-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.004

作者簡(jiǎn)介：第一王曉華(1988-)，女，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要研究方向?yàn)閮和腥炯靶难芗膊?。E-mail：sherran004@126.com

基金項(xiàng)目：江蘇省衛(wèi)生廳資助科研項(xiàng)目(H201423)；2015年度南通市市級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目。