陶素媛， 叢培旭， 徐　杰， 曹　建， 李兆杰， 薛長湖

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

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馬糞海膽單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)鑒定?

陶素媛， 叢培旭， 徐杰??， 曹建， 李兆杰， 薛長湖

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

摘要：為研究馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)。首先，用Sevennerholm法分配提取其生殖腺，經(jīng)正相硅膠柱、DEAE-Sephadex A25離子交換柱純化后，得到2種神經(jīng)節(jié)苷脂組分，分別為HPG-A和HPG-B。其次,進(jìn)行酸解，獲得唾液酸、中性單糖、脂肪酸和長鏈堿。然后,采用甲基化處理，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定基本組成結(jié)構(gòu)，經(jīng)濕法消化和離子色譜法測定硫酸根含量。實(shí)驗(yàn)表明：HPG-A的唾液酸組成為N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)和少量N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，而HPG-B為8位硫酸化的N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc8S)，且均以2-6鍵與葡萄糖相連；HPG-A和HPG-B神經(jīng)酰胺(Cer)的主鏈長鏈堿(LCB)組成類似，主要為d16∶0和d18∶0；脂肪酸(FA)組成均以C22∶1和C22∶1 h為主。鑒定出HPG-A為單唾液酸己糖神經(jīng)節(jié)苷脂Neu5Gc2-6Glc1-1Cer和Neu5Ac2-6Glc1-1Cer的混合物，HPG-B為硫酸酯化單唾液酸己糖神經(jīng)節(jié)苷脂Neu5Gc8S2-6Glc1-1Cer。本文為研究馬糞海膽單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的構(gòu)效關(guān)系提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)節(jié)苷脂；海膽；GC-MS；唾液酸

TAO Su-Yuan, CONG Pei-Xu, XU Jie, et al. Structure analysis of monosialoganglioside from the sea urchin Hemicentrotus pulcherrimus [J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(2)： 61-68.

神經(jīng)節(jié)苷脂(Ganglioside)是一種含有唾液酸的鞘糖脂化合物，由糖鏈、脂肪酸和一個(gè)作為骨架的鞘氨醇類堿基三部分組成。組成神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖鏈的糖通常為D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰氨基半乳糖和唾液酸。唾液酸是構(gòu)成神經(jīng)節(jié)苷脂的必要分子，為一種九碳糖，哺乳動物體內(nèi)最常見的唾液酸是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，在一些炎癥組織或癌變組織中則會出現(xiàn)N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)。神經(jīng)節(jié)苷脂在正常細(xì)胞的生長、分化、調(diào)節(jié)以及信息傳遞過程中發(fā)揮著重要作用，尤其是神經(jīng)元的成熟和損傷神經(jīng)的修復(fù)再生過程其作用備受關(guān)注[1-2]。

目前，常用的神經(jīng)節(jié)苷脂的提取方法是1957年Folch建立的基于氯仿/甲醇/水分配體系[3]。該方法操作簡單，適用于大多數(shù)脂質(zhì)的提取，但是，F(xiàn)olch分配提取法容易引入硫苷脂、磷脂酰絲氨酸和其它非脂雜質(zhì)。Sevennerholm在Folch法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化[4]，目前被廣泛使用。神經(jīng)節(jié)苷脂分子本身帶負(fù)電荷，因此最常用的分離手段為陰離子交換柱層析[5-8]。常用的神經(jīng)節(jié)苷脂分析手段是薄層層析技術(shù)，但是由于其靈敏性低不適用于微量分析而逐漸被高效液相色譜和酶聯(lián)免疫技術(shù)等取代[9-11]。但是，這些技術(shù)往往需要制備大量的樣品和繁瑣的步驟。隨著技術(shù)的發(fā)展，氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法等開始運(yùn)用到神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)鑒定當(dāng)中，并逐漸取代傳統(tǒng)的方法。氣質(zhì)聯(lián)用法一直是分析神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)的常規(guī)手段，并且由于其在分析脂肪酸和長鏈堿時(shí)的靈敏性和選擇性，使其至今仍無法被替代[12]。

海膽(Echinoids,sea urchin)為棘皮動物門(Echinodermata)海膽綱(Echinoidea)動物，屬珍貴的海洋食品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，海膽的骨殼、棘刺、生殖腺等部位都具有良好的藥用價(jià)值，是開發(fā)海洋藥物的重要資源[13]。海膽的主要活性成分包括多糖、蛋白、脂肪酸、色素、微量元素等[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，海膽生殖腺及精子中含有豐富的神經(jīng)節(jié)苷脂類物質(zhì)[15-17]。本文以馬糞海膽為原料，對其中的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行分離純化，并利用化學(xué)手段和波譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為其它棘皮動物神經(jīng)節(jié)苷脂的分離、鑒定提供方法基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 原料

馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)購自大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)股份有限公司。新鮮海膽去殼取生殖腺，凍干后備用。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1100型，配置二極管陣列檢測器(DAD)和熒光(FLD)檢測器，美國Agilent公司；氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀：6890N-5973i型，美國Agilent公司；離子色譜儀：ICS-2000型，美國Dionex公司；冷凍干燥機(jī)：ALPHA 1-4LD，德國CHRIST公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Heidolph Laborota 4000型，德國Heidolph公司。

正相硅膠薄層層析板(硅膠60)，德國Merck公司；正相硅膠填料(200～400目)，青島海洋化工廠；反相C8硅膠填料(40～75 μm)，日本Fuji公司；離子交換凝膠(DEAE Sephadex-A25)，美國GE Healthcare Bio-Sciences公司；ZORBAX Eclipse XDB-C18分析柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，ZORBAX SB-C18分析柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，HP-5 ms(30 m×0.32 mm,0.25 μm)，DB225 ms(30 m×0.25 mm,0.25 μm)，DB-1701(30 m×0.25 mm,0.32 μm)，美國Agilent公司；Ionpac AS11-HC(4 mm×250 mm)，IonPac AG11-HC(4 mm×50 mm)，美國Dionex公司。

三甲基硅咪唑(TMS)、乙酸酐(Ac2O)、硼氫化鈉、二甲亞砜(DMSO)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)標(biāo)準(zhǔn)品、Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品等購于美國Sigma公司。鄰苯二胺基鹽酸鹽(OPD)購于Bio Basic公司。色譜純甲醇、乙腈為美國Muskegon公司生產(chǎn)。氯仿、甲醇、丙酮、鹽酸、硫酸鉀、三氟乙酸(TFA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、吡啶、碘甲烷、氫化鈉、氨水、間苯二酚、硫酸銅均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 馬糞海膽單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的分離純化稱取200 mg馬糞海膽生殖腺凍干粉，先用10倍體積的氯仿/甲醇(1∶2, v/v)溶液浸提1次，再用氯仿/甲醇(2∶1, v/v)溶液提取2次。提取液合并、過濾后，37 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得總脂。然后，向總脂中加入3倍體積的水和正己烷進(jìn)行分配，收集正己烷層，37 ℃下旋蒸干后，再用-20 ℃預(yù)冷的丙酮洗滌3次，得丙酮不溶物。該丙酮不溶物經(jīng)正相硅膠柱層析分離，依次使用氯仿/甲醇/水(80∶15∶1→70∶30∶5→5∶5∶1, v/v)梯度洗脫，各洗脫成分經(jīng)正相硅膠TLC板檢測，展開溶劑為氯仿/甲醇/水(70∶30∶5, v/v)溶液，顯色劑為間苯二酚(與唾液酸特異性顯紫紅色)或硫酸乙醇，合并Rf值相同的組分并旋蒸除去溶劑。將各組分分別加入適量氯仿/甲醇/水(30∶60∶8, v/v)溶解，上樣至DEAE-Sephadex A25離子交換層析柱中，以3倍柱體積的氯仿/甲醇/水(30∶60∶8, v/v)溶液淋洗以除去中性脂質(zhì)，最后，采用含0.1 mol/L乙酸銨的氯仿/甲醇/水(30∶60∶8, v/v)溶液洗脫，收集含唾液酸的組分并濃縮、凍干，得神經(jīng)節(jié)苷脂樣品[19]。

1.3.2 基本組成分析

1.3.2.1 脂肪酸與長鏈堿組成

樣品衍生：分別稱取1.3.1提純的神經(jīng)節(jié)苷脂樣品1 mg于安瓿管中，加入5%的鹽酸-甲醇溶液1 mL，充氮?dú)獗Ｗo(hù)、封管，再于70 ℃下反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1 mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，共萃取3次。合并正己烷層，減壓濃縮后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冷藏，待進(jìn)行脂肪酸組成分析。余下甲醇層用氨水中和后旋蒸濃縮，再放至50 ℃真空干燥箱中干燥過夜，取出后加入200 μL吡啶溶解后再加入200 μL TMS，70 ℃硅烷化反應(yīng)30 min后加入200 μL Ac2O/吡啶(1∶1, v/v)，90 ℃加熱數(shù)分鐘促溶后100 ℃再反應(yīng)1 h，加入1 mL水終止反應(yīng)，4 ℃冷藏，待進(jìn)行長鏈堿組成分析。

GC-MS條件：HP-5 ms色譜柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm, J&W)；進(jìn)樣口溫度設(shè)為250 ℃，不分流進(jìn)樣；脂肪酸升溫程序：從140 ℃開始，以5 ℃/min或7 ℃/min的速度升溫至280 ℃，保持10 min；長鏈堿升溫程序：從180 ℃開始，以4 ℃/min的速度程序升溫至250 ℃，保持10 min；載氣流速為1.2 mL/min，傳輸線溫度：280 ℃；質(zhì)譜掃描范圍：m/z45～550[18]。

對于獲得的總離子流圖(TIC)和質(zhì)譜圖，采用NIST02數(shù)據(jù)庫比對分析質(zhì)譜碎片，對峰面積進(jìn)行歸一化處理，得到其脂肪酸和長鏈堿的相對含量比例。

1.3.2.2 中性單糖組成

樣品衍生：取1 mg神經(jīng)節(jié)甘脂樣品，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸降解8 h，用PMP進(jìn)行衍生，定容至5 mL過膜，待進(jìn)行HPLC分析。

HPLC條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；紫外檢測器，檢測波長250 nm；流動相：溶劑A：15% (v/v)乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH, pH=6.9)，溶劑B：40% (v/v)乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH, pH=6.9)；梯度模式：時(shí)間梯度，0→10→30 min；對應(yīng)的溶劑B濃度梯度，0→8%→20%；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為20 μL。

通過Glc和Gal標(biāo)準(zhǔn)品的PMP衍生物的保留時(shí)間和峰面積，確定樣品的單糖組成及含量比例。

1.3.2.3 唾液酸組成稱取1 mg神經(jīng)節(jié)甘脂樣品于安瓿管中，加入1 mL 25 mmol/L HCl后超聲促溶，封管，80 ℃水解1 h后取出，加入5 mg/mL OPD，溶于1 mL的0.25 mol/L NaHSO4中再置于80 ℃衍生反應(yīng)30 min，定容至5 mL過膜，待進(jìn)行HPLC分析[21]；唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品按同樣步驟衍生及分析。

HPLC條件：ZORBAX SB C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動相：0.5%磷酸水-乙腈-四氫呋喃(94∶5∶1, v/v)，紫外檢測波長230 nm，熒光激發(fā)波長230 nm，熒光發(fā)射波長425 nm。

1.3.2.4 硫酸根含量的測定

樣品處理：采用濕法消化，取少量待測樣品，以P2O5減壓干燥24 h，準(zhǔn)確稱取1 mg樣品溶于安瓿瓶，加入1 mL 6 mol/L HCl，封管，于110 ℃消化24 h，80 ℃左右氮?dú)獯蹈?，加超純水定容?5 mL，用于測定分析。

離子色譜條件：Ionpac AS11-HC色譜柱(4 mm×250 mm)；IonPac AG11-HC保護(hù)柱(4 mm×50 mm)；抑制器為ASRS ULTRA II陰離子抑制器，抑制電流為90 mA；電導(dǎo)檢測器；20 mmol/L KOH等度洗脫，流速為1.2 mL/min；程序時(shí)間為8 min，數(shù)據(jù)采集速率為5.0 Hz；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積：25 μL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液為25 mmol/L K2SO4。

1.3.3 結(jié)構(gòu)分析

1.3.3.1 甲基化分析按改良的Hakomori法進(jìn)行甲基化。步驟如下：1 mg樣品中加入1 mL DMSO，轉(zhuǎn)移至50 mL燒瓶中加熱攪拌，加入100 mg NaH反應(yīng)約30 min至溶液呈橙黃色；避光慢慢加入750 μL碘甲烷繼續(xù)反應(yīng)1 h后加入1 mL水終止反應(yīng)，用2 mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷層，并水洗3次；置50 ℃烘箱中烘干，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸后轉(zhuǎn)移至安瓿管中封管，于105 ℃下降解6 h，減壓旋蒸干燥，反復(fù)加入2 mL甲醇旋蒸除去三氟乙酸(至瓶壁上附著物呈白色)；加入5 mg NaBH4和1 mL 2 mmol/L NaOH 70 ℃條件下反應(yīng)1 h，轉(zhuǎn)入旋蒸瓶中旋蒸干燥，反復(fù)加入1 mL甲醇旋蒸除硼酸(瓶壁附著物呈白色)，揮干后減壓干燥過夜；加入2 mL Ac2O/吡啶(1∶1, v/v)90 ℃條件下加熱數(shù)分鐘促溶后，100 ℃反應(yīng)1 h，加入1 mL蒸餾水終止反應(yīng)，二氯甲烷萃取3次再水洗3次，減壓濃縮后進(jìn)行GC-MS分析中性單糖連接方式。唾液酸在強(qiáng)酸溶液中不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)易遭破壞，水解時(shí)必須使用較弱的酸性條件，一般以含5%～10%鹽酸的無水甲醇溶液70 ℃條件下進(jìn)行甲醇解。水解結(jié)束后直接進(jìn)行乙?；磻?yīng)，溫度設(shè)為80 ℃。減壓濃縮后進(jìn)行GC-MS分析唾液酸取代位置。

1.3.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)構(gòu)鑒定GC-MS分析條件：中性單糖衍生物使用DB-225 ms色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)分析，采用程序升溫的方法，起始溫度為170 ℃，保持1 min，再以2 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持20 min，載氣為氦氣，流速1 mL/min。質(zhì)量掃描范圍為m/z40～450 amu。酸性唾液酸分析使用DB-1701色譜柱(30 m×0.25 mm,0.32 μm)，升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟葹?00 ℃，以2.5 ℃/min的速度升溫至250 ℃，保持10 min，載氣流速1.2 mL/min，質(zhì)量掃描范圍為m/z40～500 amu。質(zhì)譜進(jìn)樣口溫度設(shè)為250 ℃，傳輸線溫度280 ℃，EI離子源230 ℃。將所獲得的中心單糖衍生物、唾液酸的質(zhì)譜圖分別與NIST02標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫及文獻(xiàn)進(jìn)行比對，得到其結(jié)構(gòu)信息。

2結(jié)果與討論

2.1 馬糞海膽單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的提取純化

馬糞海膽總脂經(jīng)硅膠柱層析，薄層色譜法檢測合并Rf值相同的組分，獲得2個(gè)組分記為HPG-A和HPG-B，Rf值分別為0.42和0.35，二者表現(xiàn)出較大的極性；經(jīng)間苯二酚顯色確定分子中含有唾液酸組分，進(jìn)而推測這2種組分為神經(jīng)節(jié)苷脂，硅膠柱層析后的樣品中殘留有磷脂雜質(zhì)，需進(jìn)一步采用離子交換柱層析除雜，分別對2組化合物進(jìn)行純化以除去磷脂，得到不含磷脂的樣品。

2.2 基本組成分析

2.2.1 脂肪酸和長鏈堿組成按照1.3.2.1中的方法對樣品HPG-A和HPG-B進(jìn)行衍生，通過GC-MS法分別測定脂肪酸(FA)和長鏈堿(LCB)組成，所獲得的質(zhì)譜圖與NIST02標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫進(jìn)行比對，對峰面積進(jìn)行歸一化處理，獲得各脂肪酸和長鏈堿的相對含量。結(jié)果顯示，樣品HPG-A和HPG-B主要的脂肪酸和長鏈堿組成大致相同，脂肪酸中有羥基脂肪酸，不含多不飽和脂肪酸，主要脂肪酸為C22∶1和C22∶1 h；長鏈堿主要由植物鞘氨醇型堿基(t系)組成，主要長鏈堿為t18∶0和t16∶0，只含有少量d系鞘氨醇，結(jié)果見表1。

馬糞海膽單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂與海參來源的神經(jīng)節(jié)苷脂相比，脂肪酸組成相似，但是其長鏈堿結(jié)構(gòu)簡單，海參中除了植物鞘氨醇型還有鞘氨醇型。而海星神經(jīng)節(jié)苷脂脂肪酸和長鏈堿結(jié)構(gòu)較為固定，一般由α羥基脂肪酸和植物鞘氨醇組成[18]。與哺乳動物來源的神經(jīng)節(jié)苷脂相比，海洋棘皮動物來源神經(jīng)節(jié)苷脂的脂肪酸鏈明顯增長，不飽和脂肪酸比例升高，出現(xiàn)了明顯的羥基化，這也可能是其生物活性明顯增強(qiáng)的原因[19]。

2.2.2 單糖、唾液酸及硫酸根分析采用文獻(xiàn)[20]中的方法，分析樣品中的中性單糖組成，發(fā)現(xiàn)海膽中2種神經(jīng)節(jié)苷脂均只含有葡萄糖。每毫克HPG-A樣品約含0.87 μmol葡萄糖；按1.3.2.3中的方法對樣品進(jìn)行水解衍生，水解后唾液酸開環(huán)形成α-酮酸類物質(zhì)，鄰苯二胺可專一地與之反應(yīng)生成喹諾啉類物質(zhì)，在230 nm紫外光激發(fā)下會產(chǎn)生熒光，串聯(lián)HPLC可實(shí)現(xiàn)對不同唾液酸的分離從而進(jìn)行定量分析[21]。分析樣品中的唾液酸組成，發(fā)現(xiàn)樣品HPG-A中的唾液酸主要為N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)，另有少量的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，兩者峰面積比約為15∶1，唾液酸含量約為0.84 μmol，樣品HPG-A中總唾液酸含量與葡萄糖的摩爾比接近1∶1，見表2。硫酸根測定結(jié)果顯示樣品HPG-A中不含硫酸根。推測樣品HPG-A結(jié)構(gòu)為Neu5Gc(或Neu5Ac)-Glc-Cer。

表1　HPG-A和HPG-B脂肪酸及長鏈堿組成

表2　HPG-A和HPG-B中糖組分及硫酸根的摩爾比

注：數(shù)值為摩爾比，設(shè)葡萄糖摩爾含量為1；“-”表示未檢出。

Note: The values represent molar ratios, and molar content of glucose is set to be 1; “-” means undetected.

每毫克樣品HPG-B約含0.81 μmol葡萄糖；只有Neu5Gc一種唾液酸；根據(jù)HPG-B中硫酸根在離子色譜上的色譜圖[22]，計(jì)算出樣品中硫酸根含量為0.86 μmol/mg。樣品HPG-B中葡萄糖、Neu5Gc和硫酸根的物質(zhì)的量近似相等。棘皮動物神經(jīng)節(jié)苷脂中硫酸酯基通常位于唾液酸上[19]，由此推測樣品HPG-B結(jié)構(gòu)為Neu5Gc8S-Glc-Cer。與馬糞海膽相比，海星和海膽神經(jīng)節(jié)苷脂糖鏈中基本上也都存在一個(gè)二糖基本結(jié)構(gòu)，海星為Neu5Ac(或Neu5Gc)-Gal-Glc-Cer，與哺乳動物相似，而海參為Neu5Ac(或Neu5Gc)-Glc-Cer，硫酸酯化僅在海膽與海參中出現(xiàn)[19]。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

糖脂樣品中含有脂鏈，在其甲基化衍生物的GC-MS圖中除有單糖的甲基化衍生物峰外，還有一些歸屬于脂肪酸和LCB的峰。根據(jù)基本組成測定結(jié)果，樣品HPG-A和HPG-B中只有葡萄糖一種中性單糖，在分析中性單糖時(shí)，以m/z=117(糖環(huán)中2-羥基未被取代的己糖均產(chǎn)生該碎片)作為特征離子進(jìn)行提取，可獲得簡化的中性單糖部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物(PMAA)的提取離子色譜(EIC)圖(見圖1)。

圖1　HPG-A和HPG-B中性單糖部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物的EIC圖(m/z=117)

圖2　2,3,4-三氧甲基-三乙?；?D-葡萄糖醇的質(zhì)譜圖(衍生自6-位取代葡萄糖)

樣品HPG-A和HPG-B的測定結(jié)果顯示，兩者含有同一種中性單糖甲基化衍生物，在EIC譜圖上保留時(shí)間為30.17 min(見圖1)；峰1產(chǎn)生m/z=117、161、189的特征峰，鑒定出其的結(jié)構(gòu)為2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙?；?D-葡萄糖醇(見圖2)，檢索NIST 02譜庫與標(biāo)準(zhǔn)譜圖匹配度為98%，葡萄糖的C6位被唾液酸取代，可推斷唾液酸是以2-6鍵連接于葡萄糖上。

根據(jù)唾液酸組成測定結(jié)果，樣品HPG-A中只含有Neu5Gc和Neu5Ac，以二者共有的離子碎片(脫掉與2位碳相連的羧甲酯、5位碳上的N-乙?；八信c氧相連的甲基)其m/z=201為特征離子提取色譜圖，獲得簡化的色譜圖，圖3。各峰質(zhì)譜圖見圖4a和圖4b，根據(jù)m/z=155、318、376特征峰，鑒定出峰2為甲基化N-乙?；?2,4,7,8,9-四氧甲基神經(jīng)氨酸(衍生自NeuAc)[23]，根據(jù)m/z=159、284、378特征峰，鑒定出峰3為甲基化N-羥乙?；?2,4,7,8,9-四氧甲基神經(jīng)氨酸(衍生自NeuGc)[24]。根據(jù)唾液酸和硫酸根測定結(jié)果，樣品HPG-B中唾液酸被硫酸酯化，提取m/z=406，HPG-B唾液酸特有的離子碎片(脫掉與8位碳相連的氧乙酰基)作為特征離子獲得簡化的色譜圖(見圖3)，根據(jù)m/z=183、375、406特征峰，鑒定出色譜峰4(Rt=13.5 min)為甲基化N-羥乙?；?8-氧乙?；?2,4,7,9,11-五氧甲基神經(jīng)氨酸[25]，C8位上乙酰基說明硫酸酯化發(fā)生于該位點(diǎn)。色譜圖中未發(fā)現(xiàn)其它唾液酸衍生物色譜峰。

圖3　HPG-A(m/z=201)和HPG-B (m/z=406)中部分甲基化唾液酸乙酯的EIC圖

綜合甲基化分析的結(jié)果，推斷出馬糞海膽HPG-A的結(jié)構(gòu)為非硫酸酯化單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂Neu5Gc(或Neu5Ac)2-6Glc1-1Cer；HPG-B的結(jié)構(gòu)為硫酸酯化單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂Neu5Gc8S2-6Glc1-1Cer。研究表明，海膽和海參神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸通過α2-6鍵與葡萄糖相連，但是海星中唾液酸通過α2-3鍵與乳糖相連，哺乳動物中唾液酸通過α2-3鍵與半乳糖相連。糖基和連接方式的差異都會影響神經(jīng)節(jié)苷脂的活性[26]。

3結(jié)語

采用氯仿/甲醇/水體系提取，經(jīng)過正相硅膠柱層析和離子交換柱層析，從馬糞海膽中分離得到2種單唾液酸單己糖神經(jīng)節(jié)苷脂。HPG-A相對含量在1‰左右，提取率在70%～80%；HPG-B相對含量在2‰左右，提取率大于90%。通過HPLC、GC-MS等化學(xué)、光譜、質(zhì)譜等手段鑒定了2種化合物的單糖、脂肪酸、長鏈堿和硫酸根的組成及其唾液酸、糖鏈的連接方式，進(jìn)而推測出其結(jié)構(gòu)。HPG-A和HPG-B的長鏈堿組成基本相同，主要為2-氨基-1,3,4-三羥基-十六烷和2-氨基-1,3,4-三羥基-十八烷；脂肪酸組成也大致相同，主要以C22∶1和C22∶1h為主(二者含量占總脂肪酸的80%以上)，C20∶0、C22∶1、C22∶1h、C23∶1、C23∶1h和C24∶1h等脂肪酸相對含量略有差異。鑒定出HPG-A為Neu5Gc2-6Glc1-1Cer和Neu5Ac2-6Glc1-1Cer組成的混合物，HPG-B為Neu5Gc8S2-6Glc1-1Cer。由于海洋特殊的生態(tài)環(huán)境，使得海洋生物中所含神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)和活性都比較獨(dú)特，從棘皮動物中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)神經(jīng)節(jié)苷脂其結(jié)構(gòu)均明顯有別于陸生哺乳動物體內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂，具有良好的研究前景。通過對馬糞海膽神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)的初步分析，可為以后其它棘皮動物神經(jīng)節(jié)苷脂生物活性研究及其產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖4　峰2(a)，峰3(b)，峰4(c)的質(zhì)譜圖

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責(zé)任編輯朱寶象

Structure Analysis of Monosialoganglioside from the Sea UrchinHemicentrotuspulcherrimus

TAO Su-Yuan, CONG Pei-Xu, XU Jie, CAO Jian, LI Zhao-Jie, XUE Chang-Hu

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract:Gangliosides are a group of glycosphingolipids containing one or more sialic acid residues. It has been proved to be one of the most important bioactive compositions of echinodermata and play essential roles in severe pathologies. To research the structure of gangliosides in sea urchin, a method of extraction, purification and identification of monosialoganglioside has been developed. Two ganglisides, HPG-A and HPG-B, with different structures, were isolated with Sevennerholm method from the germen of the sea urchin Hemicentrotus pulcherrimus using silica gel column chromatography and DEAE-Sephadex A25 column chromatography, their chemical structures were determined by methylation analysis using gas chromatography-mass spectrometry, and the content of sulfate radical wasdetermined by wet digestion and high performance ion chromatography. Compared to the NIST02 standard mass spectral library, the sialic acid of HPG-A was identified to be a mixture of Neu5Gc and a small amount of Neu5Ac while HPG-B was identified to be Neu5Gc8S. All of them were 2～6 linked sialic acid, which is different from that in mammals where the monosaccharide components were both glucose. The long-chain bases of HPG-A were t16∶0 and t18∶0, which were similar to those of HPG-B. The main fatty acids were C22∶1 and C22∶1 h, but the relative amount of C20∶0, C22∶1, C22∶1 h, C23∶1, C23∶1 h, C24∶1 h was different. HPG-A was identified to be a mixture of Neu5Gc2-6Glc1-1Cer and a small amount of Neu5Ac2-6Glc1-1Cer, and HPG-B was identified to be Neu5Gc8S2-6Glc1-1Cer. The relative content of HPG-A was about 1‰ and the extraction rate was between 70% and 80%. It was twice more in HPG-B than in HPG-A with a higher extraction rate (more than 90%). Because of the special ecological environment, the structure and activity of gangliosides in the marine lives are unique. And it has been proved that the gangliosides with different structures have different bioactivities. The research of gangliosides from sea urchin Hemicentrotus pulcherrimus will make sense for the further research of structure-activity relationship.

Key words:ganglioside; sea urchin; GC-MS; sialic acid

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20150002

中圖法分類號：TS201.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)02-061-08

作者簡介：陶素媛(1990-)， 女， 碩士生。E-mail：taosuyuan@163.com??通訊作者：E-mail：xujie9@ouc.edu.cn

收稿日期：2015-01-12；

修訂日期：2015-07-07

基金項(xiàng)目：?國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31330060；31201329)；新世紀(jì)優(yōu)秀人才項(xiàng)目(NCET-13-0534)資助

引用格式：陶素媛， 叢培旭， 徐杰， 等. 馬糞海膽單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2016, 46(2)： 61-68.

Supported by National Natural Science Foundation of China (31330060；31201329)； New Century Excellent Talents in University (NCET-13-0534)