李利華，盧濱，吳紅科，張浩，姚菲菲（鄭州人民醫(yī)院呼吸科，河南鄭州450000）

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白藜蘆醇抑制Sonic hedgehog信號并減輕大鼠肺纖維化的研究

李利華，盧濱，吳紅科，張浩，姚菲菲
（鄭州人民醫(yī)院呼吸科，河南鄭州450000）

摘要：目的研究白藜蘆醇對博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的影響。方法完全隨機(jī)分組法將40只SD雄性大鼠分為4組：對照組、模型組、25μmol白藜蘆醇組和50μmol白藜蘆醇組。模型組大鼠氣管內(nèi)滴注博萊霉素，25和50μmol白藜蘆醇組大鼠氣管內(nèi)滴注博萊霉素后分別用25和50μmol白藜蘆醇灌胃，對照組大鼠氣管內(nèi)滴注生理鹽水。處理30 d后，觀察各處理組大鼠肺組織病理變化并檢測大鼠肺組織羥脯氨酸（HYP）和Ⅰ型膠原蛋白含量。分離各組大鼠肺成纖維細(xì)胞，并利用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和Western blot檢測細(xì)胞中SHH（Sonic hedgehog，SHH）、Smo、Gli-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，同時檢測細(xì)胞增殖和凋亡。結(jié)果模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞并伴有膠原纖維沉淀，白藜蘆醇處理可減輕纖維化病變。白藜蘆醇可降低肺組織中博萊霉素誘導(dǎo)的HYP和Ⅰ型膠原蛋白含量。博萊霉素能顯著上調(diào)成纖維細(xì)胞中SHH、Smo、Gli-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，而白藜蘆醇則可抑制SHH、Smo和Gli-1的表達(dá)。博萊霉素促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖并減少凋亡，白藜蘆醇抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)論白藜蘆醇可抑制博萊霉素誘導(dǎo)的SHH信號活化并減輕大鼠肺纖維化。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；sonic hedgehog信號；肺纖維化；博萊霉素；成纖維細(xì)胞

肺間質(zhì)纖維化是一種多誘因的慢性肺疾病[1]。肺間質(zhì)纖維化病變過程中，肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，肺泡基底膜破壞，細(xì)胞外基質(zhì)沉積并成纖維細(xì)胞聚集和增殖[2]。白藜蘆醇是非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物中，有抗氧化、消炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)激素等作用[3]。近年來，多個實(shí)驗(yàn)證明白藜蘆醇可對實(shí)驗(yàn)動物肺纖維化疾病進(jìn)展產(chǎn)生影響[4-6]，但具體作用機(jī)制還不清楚。因此，本研究著眼于白藜蘆醇對博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的影響，分析白藜蘆醇的作用機(jī)制，為肺纖維化的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑

40只4周齡雄性SD大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司，將實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于12 h晝/夜循環(huán)照明、恒溫、恒濕的清潔級環(huán)境中，自由飲食，飼養(yǎng)1周后備用。白藜蘆醇、戊巴比妥鈉、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Sigma公司，博萊霉素購自美國Invitrogen公司，羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）檢測試劑盒購自南京建成生物，Trizol試劑和Dy NAmo SYBR Green熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒購自大連寶生生物有限公司，抗Ⅰ型膠原蛋白抗體、抗SHH（sonic hedgehog，SHH）抗體、抗Smo抗體、抗Gli-1抗體購自美國Santa Cruz Biotech公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗購自英國Abcam公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司，噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethyl- 2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]試劑盒購自北京百浩生物公司，其余常見試劑為國產(chǎn)。

1.2動物分組處理

利用隨機(jī)數(shù)字法將40只5周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：對照組、模型組、25μmol白藜蘆醇組和50μmol白藜蘆醇組，每組10只。模型組大鼠氣管內(nèi)注射4 mg/kg博萊霉素建立肺纖維化模型，25和50μmol白藜蘆醇組大鼠氣管注射博萊霉素后第2天分別用25和50μmol白藜蘆醇灌胃，處理30 d。對照組和模型組利用生理鹽水灌胃。模型組大鼠于博萊霉素滴注后死亡2只，對照組和50μmol白藜蘆醇組灌胃第6天分別死亡1只大鼠，25μmol白藜蘆醇組分別于博萊霉素滴注后及白藜蘆醇灌胃第3天死亡1只大鼠。處理結(jié)束后，利用戊巴比妥鈉深度麻醉處死大鼠，分離大鼠肺成纖維細(xì)胞備用。檢測各組大鼠肺組織HYP和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，制作病理切片，觀察肺纖維化病變。

1.3肺成纖維細(xì)胞分離和培養(yǎng)

大鼠肺成纖維細(xì)胞的分離參考朱天琦等[7]的方法。將分離得到的成纖維細(xì)胞置于37℃、5％二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，用含15％胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的H-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液1次。細(xì)胞生長接近融合時，棄培養(yǎng)液，D-Hanks液輕洗3次，加入0.25％胰酶消化1min，用含15％FBS的H-DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心2 min，棄上清液，用15％ FBS 的H-DMEM培養(yǎng)液，按1∶2接種傳代培養(yǎng)。利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞中波形蛋白和CD31的表達(dá)，對原代肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.4MTT檢測細(xì)胞增殖

分離肺成纖維細(xì)胞，將來源于對照組、模型組、25和50μmol白藜蘆醇組大鼠的肺成纖維細(xì)胞，按3×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板。每孔細(xì)胞加入含15％FBS的H-DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72和96 h后分別進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測。按實(shí)驗(yàn)分組，每孔加入20μl MTT（5 mg/ml）后培養(yǎng)4 h。去上清液，每孔加入150μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。混勻后用酶標(biāo)儀（Instruments，美國Bio-tek公司）測定（測量波長為490 nm）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集分離培養(yǎng)的大鼠肺成纖維細(xì)胞，分別對應(yīng)對照組、模型組、25和50μmol白藜蘆醇組。首先用PBS洗滌細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/L，制成單細(xì)胞懸液，加入100μl結(jié)合緩沖液與FITCAnnexinⅤ（20μg/ml）10μl，室溫避光放置30 min，加入5μl PI（50μg/ml），室內(nèi)避光反應(yīng)5 min，加入400μl結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6HYP含量測定

采用商業(yè)化HYP試劑盒檢測各組大鼠肺組織中HYP含量。試劑盒主要原理是利用氧化HYP與4-（二甲氨基）苯甲醛（DMAB）的生色反應(yīng)來測定HYP濃度，反應(yīng)生成與樣品中HYP含量成正比的比色（560 nm）產(chǎn)物。

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）使用Trizol試劑提取大鼠肺組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板擴(kuò)增基因片段，所用引物見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后染色、拍照。采用ABI 7500型實(shí)時熒光定量PCR儀和Dy NAmo SYBR Green qPCR試劑盒對目的基因表達(dá)進(jìn)行測定。分別根據(jù)產(chǎn)生的Ct值從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得目的基因和β-actin基因的拷貝數(shù)。取3次的平均值，以目的基因的拷貝數(shù)除以β-actin的拷貝數(shù)作為靶基因的相對表達(dá)量。

表1　實(shí)時定量PCR引物序列

1.7Western blot檢測

提取肺組織總蛋白，利用10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，用含5％脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween（TBS+Tween，TBST）室溫下水平搖床慢搖封閉1 h。利用抗Ⅰ型膠原蛋白抗體、抗SHH抗體、抗Smo抗體或抗Gli-1抗體4℃孵育過夜。隔天TBST漂洗3遍，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶20 000），室溫下水平搖床慢搖孵育1 h。選取β-actin作為蛋白表達(dá)內(nèi)參。TBST漂洗3遍后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

1.8肺組織病理切片與Masson染色

將大鼠肺組織用4％甲醛固定，將固定好的樣本按順序置于脫水機(jī)中脫水。將過夜的肺組織取出，置于沾有少量蠟液的包埋盒中包埋。將蠟塊固定于切片機(jī)上，切成4～6μm薄片。采用Masson三色染色法分析，切片常規(guī)脫蠟至水，置于Bouin液室溫過夜或56℃中處理1 h，自來水沖洗至黃色消失后蒸餾水洗滌。Weigert鐵蘇木精染核10 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗10 min，蒸餾水洗滌。按照Ⅰ液染2 min，Ⅱ液染15 min，Ⅲ液染5 min的順序進(jìn)行處理；蒸餾水洗滌1 min后，1％冰乙酸溶液浸洗5 min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1白藜蘆醇抑制博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化

病理結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠肺組織肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，可見大量膠原纖維沉淀以及成纖維細(xì)胞增生。白藜蘆醇處理大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞相對較輕，同時可見少量膠原纖維沉淀和成纖維細(xì)胞增生，肺組織中性粒細(xì)胞浸潤減少。見圖1。

圖1　各組大鼠肺組織病理切片觀察（Masson染色×400）

2.2白藜蘆醇降低模型大鼠肺組織HYP和Ⅰ型膠原蛋白的含量

與對照組比較，模型組大鼠肺組織HYP含量明顯升高（P=0.002）。白藜蘆醇可明顯降低肺組織HYP含量，并具有劑量效應(yīng)；25μmol白藜蘆醇組HYP含量與對照組、模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.024和0.015）；50μmol白藜蘆醇組HYP含量與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）（見表2）。與對照組比較，博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P=0.001）；白藜蘆醇則顯著下調(diào)模型大鼠Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)（25μmol白藜蘆醇組P=0.032，50μmol白藜蘆醇組P=0.011。見圖2。

表2　各組大鼠肺組織HYP含量測定

圖2　各組大鼠肺組織Ⅰ型膠原蛋白免疫印跡法定量分析

2.3白藜蘆醇下調(diào)模型大鼠肺成纖維細(xì)胞SHH信號的表達(dá)

與對照組比較，模型組大鼠成纖維細(xì)胞中SHH、Smo和Gli-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上升（mRNA：PSHH=0.000，PSmo=0.000，PGli-1=0.000；蛋白：PSHH=0.000，PSmo=0.000，PGli-1=0.000）；白藜蘆醇顯著降低博萊霉素誘導(dǎo)的SHH、Smo和Gli-1 mRNA和蛋白表達(dá)（25μmol白藜蘆醇組mRNA：PSHH=0.000， PSmo=0.022，PGli-1=0.000；蛋白：PSHH==0.002，PSmo=0.024，PGli-1=0.021；50μmol白藜蘆醇組mRNA：PSHH= 0.000，PSmo=0.013，PGli-1=0.000；蛋白：PSHH=0.000，PSmo= 0.018，PGli-1=0.000）。見圖3、4。

2.4白藜蘆醇降低成纖維細(xì)胞的增殖

與對照組比較，博萊霉素能顯著提高大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖速率（P=0.033）；與模型組比較，白藜蘆醇能明顯降低成纖維細(xì)胞的增殖（25μmol白藜蘆醇組P=0.027，50μmol白藜蘆醇組P=0.024）。見圖5。

圖3　各組大鼠肺成纖維細(xì)胞SHH、Smo和Gli-1 mRNA的熒光定量PCR

圖4　各組大鼠肺成纖維細(xì)胞SHH、Smo和Gli-1蛋白的熒光定量PCR

圖5　MTT法測定各組大鼠肺成纖維細(xì)胞體外增殖

2.5白藜蘆醇促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，博萊霉素能降低成纖維細(xì)胞凋亡率（P=0.041），而白藜蘆醇則能顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡（25μmol白藜蘆醇組P=0.036，50μmol白藜蘆醇組P=0.021）。見圖6。

圖6　流式細(xì)胞術(shù)測定各組大鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡比率

3　討論

作為一種進(jìn)行性肺疾病，肺纖維化患者在診斷后5年病死率達(dá)65％[8]，目前還沒有公認(rèn)的有效治療方法，主要采用抗炎、抗纖維化、抗凝血及肺移植等治療措施，療效各有優(yōu)劣[9]。因此，迫切需要探索新的有效而副作用低的治療方法。白藜蘆醇是一種從植物中提取的天然藥物，在抗腫瘤、治療心血管疾病、抗氧化等方面療效顯著，毒性低，便于長期服藥[10]。白藜蘆醇在實(shí)驗(yàn)性肺纖維化模型中的作用越來越受到關(guān)注，有望開發(fā)為治療人體肺纖維化的臨床用藥。

本研究通過向大鼠氣管滴注博萊霉素建立肺間質(zhì)纖維化模型，病理、組織結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型大鼠較對照組肺泡結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，有明顯的膠原蛋白沉積，成纖維細(xì)胞大量增生。另建的立白藜蘆醇處理組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠保護(hù)肺泡結(jié)構(gòu)，減少組織損傷，并減輕模型大鼠肺間質(zhì)纖維化和炎癥反應(yīng)，表明白藜蘆醇有拮抗博萊霉素的作用，能減輕博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化。

本研究中，肺纖維化模型大鼠肺組織HYP含量和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯增高。白藜蘆醇處理后，模型大鼠肺組織中HYP含量減少，Ⅰ型膠原蛋白水平降低。多種信號途徑包括STAT、酪氨酸蛋白激酶、MAPK、TGF-β參與肺纖維化進(jìn)展[11]。SHH途徑參與肺臟在胚胎期的發(fā)育[12]，并且在成體胚胎干細(xì)胞的維持中具有重要作用[13]。Teglund等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)其參與多種癌癥的發(fā)生。最近多個研究發(fā)現(xiàn)，SHH參與肺纖維化病變[15]。Hu等[16]證明SHH在體外可通過Smo和Gli1促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞。Moshai等[17]發(fā)現(xiàn)，抑制Gli的活性可減緩小鼠肺纖維化，減小肺膠原蛋白的沉積，促進(jìn)肺組織內(nèi)抗炎、抗纖維化環(huán)境形成。國內(nèi)研究報道，百草枯可導(dǎo)致SHH途徑中Smo、Gli1的表達(dá)水平在肺纖維化大鼠肺組織中顯著上調(diào)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在模型大鼠肺成纖維細(xì)胞中，SHH、Smo、Gli-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)，而白藜蘆醇則可以抑制SHH、Smo和Gli-1的表達(dá)，結(jié)果表明，博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化過程具有活化成纖維細(xì)胞中SHH信號途徑的作用；與之相反，白藜蘆醇則可以抑制成纖維細(xì)胞中SHH信號的活化，下調(diào)相關(guān)信號蛋白的表達(dá)水平。其他研究同樣證明白藜蘆醇對SHH信號的調(diào)控作用。在急性髓系白血病HL-60細(xì)胞中，白藜蘆醇能夠拮抗白介素-6（interleukin-6，IL-6）的作用，降低細(xì)胞中SHH和Gli-1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞生長[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，博萊霉素促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，而白藜蘆醇則可以抑制細(xì)胞增殖。此外，博萊霉素降低成纖維細(xì)胞凋亡，白藜蘆醇則促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究觀察到白藜蘆醇可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，抑制成纖維細(xì)胞干細(xì)胞SHH信號活化及成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為明確白藜蘆醇在預(yù)防和治療肺纖維化中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)和理論支持。

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（童穎丹編輯）

Resveratrol inactivates sonic hedgehog signaling and alleviates lung fibrosis in rats

Li-hua Li, Bin Lu, Hong-ke Wu, Hao Zhang, Fei-fei Yao
(Department of Respiratory Diseases, People's Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou, Henan 450000, China)

Abstract:Objective To investigate the effect of resveratrol on lung fibrosis in rats.Methods Forty SD male rats were randomly allocated to four groups: control, model, 25-μmol resveratrol and 50-μmol resveratrol groups.Rats in the model group were intratracheally administrated with Bleomycin.Rats in the 25-μmol resveratrol and 50-μmol resveratrol groups were administrated with Bleomycin before intragastric administration of resveratrol.Rats in the control group were administrated with normal saline.After 30 d pathological changes of the lungs in each group were observed and the levels of hydroxyproline(HYP) and typeⅠcollagen were determined.Lung fibroblasts in the rats of each group were isolated and the expression of SHH, Smo and Gli-1 were analyzed by qRT-PCR and Western blot, along with the evaluation of proliferation and apoptosis in these cells.Results The pulmonary alveoli structures of model rats were damaged seriously with the deposition of collagen, while resveratrol attenuated the progression of lung fibrosis.Resveratrol reduced HYP content and typeⅠcollagen expression induced by Bleomycin in the lung tissue.Moreover, Bleomycin significantly upregulated the expressions of Sonic hedgehog(SHH), Smo and Gli-1 mRNAs and proteins, which were inhibited by resveratrol.In addition, Bleomycin enhanced the proliferation and reduced apoptosis of fibroblasts, while resveratrol inhibited fibroblst proliferation and promoted apoptosis.Conclusions Resveratrolbook=36,ebook=41might impede Bleomycin-induced SHH signaling and contribute to the alleviation of lung fibrosis in rats.

Keywords:resveratrol; sonic hedgehog; lung fibrosis; Bleomycin; fibroblast

收稿日期：2015-10-14

文章編號：1005-8982（2016）01-0035-06

中圖分類號：R563.9；R332

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A