文∕山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

?

新型豬瘟疫苗研究進(jìn)展

文∕山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

摘 要豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種疾病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極為嚴(yán)重，豬瘟疫苗的研制對(duì)于豬瘟的防治工作有著極其重要的意義。文章介紹了幾種豬瘟新型疫苗的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞豬瘟；豬瘟基因工程亞單位疫苗；核酸疫苗；基因缺失疫苗；活載體疫苗

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的豬的一種豬急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，各種日齡豬均可感染，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。國際獸醫(yī)局(OIE)將其列為A類16種法定傳染病之一[3]。疫苗接種是防控豬瘟的重要手段，為了預(yù)防和消滅CSF，減少經(jīng)濟(jì)損失，各國學(xué)者在CSF疫苗研制方面都作了大量的工作，現(xiàn)將近年來國內(nèi)外CSF新型疫苗研究情況綜述如下。

1 基因工程亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗是采用DNA重組技術(shù)，將外源病原體基因與適當(dāng)質(zhì)粒或病毒載體重組后導(dǎo)入受體(細(xì)菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞)，使其在受體中高效表達(dá)，提取所表達(dá)的特定多肽，加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗。Moormann等[4]研究了由昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的CSFV E2糖蛋白亞單位疫苗的免疫效果和穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，按32μg/頭水包油型E2亞單位苗接種，3周后攻毒，保護(hù)率可達(dá)100％。湯德元等[5]構(gòu)建了CSFV貴州流行株E2基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-E2，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，將目的蛋白加入弗氏佐劑免疫小鼠，免疫后采血檢測(cè)抗體，結(jié)果顯示目的蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定抗體水平。董炳梅等[6]在對(duì)E2蛋白(E2)進(jìn)行N-糖基化修飾，并接種BALB/c小鼠評(píng)價(jià)免疫效果。結(jié)果顯示，CSFV E2的糖基化修飾顯著增強(qiáng)了DCs的抗原提呈功能，可以同時(shí)促進(jìn)Th1與Th2免疫應(yīng)答，但主要以Th2體液免疫應(yīng)答為主，刺激機(jī)體產(chǎn)生了快而持久的抗體保護(hù)，并且具有良好的免疫記憶。李文良等[7]將重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞制備CSF E2、E0重組蛋白，單獨(dú)或聯(lián)合免疫家兔，并用CSF兔化弱毒疫苗C株攻毒家兔，檢測(cè)免疫效果，結(jié)果顯示，E2、E2+E0免疫組兔均可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗體和中和抗體，且差異不顯著。攻毒后E2免疫組2/5兔出現(xiàn)輕熱癥狀，1/5兔脾臟病毒陽性；E2+E0組兔均未出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，E0組不能誘導(dǎo)兔產(chǎn)生中和抗體，但也能提供部分保護(hù)(2/5)。徐倩倩等[8]將構(gòu)建了單獨(dú)表達(dá)CSF E0基因和能融合表達(dá)E0與副豬嗜血桿菌Hsp70基因的重組質(zhì)粒pColdI-E0 和pColdI-E0-Hsp70，獲得了E0、Hsp70和E0-Hsp70融合蛋白，分別免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)免疫效果，結(jié)果顯示，E0-Hsp70融合蛋白和E0+Hsp70混合物免疫后均能顯著提高抗E0的抗體效價(jià)、CD4+和CD8+T細(xì)胞水平，并促進(jìn)IFN-γ的釋放。以上研究表明，亞單位疫苗具有很好的免疫效果和廣闊的發(fā)展前景，值得進(jìn)一步研發(fā)。

2 核酸疫苗

核酸疫苗是將外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。Yu等[9]構(gòu)建了含CSFV E2基因的4種真核表達(dá)質(zhì)粒pcDSW、pcDST、pcDWT和pcDWW，并分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，結(jié)果只有前兩種分泌E2抗原，將pcDSW和pcDST分別進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果顯示，pcDSW能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的抗體；且能對(duì)免疫兔和豬產(chǎn)生完全保護(hù)作用，pcDST效果則相對(duì)較差。李娜等[10]構(gòu)建了應(yīng)用甲病毒復(fù)制子載體表達(dá)CSFV E2蛋白的CSF疫苗pSFV1CS-E2，將該疫苗對(duì)豬進(jìn)行免疫后，在攻毒前產(chǎn)生了低水平的中和抗體，攻毒后抗體水平迅速升高，除了個(gè)別豬體溫短時(shí)間升高外，沒有其他的臨床癥狀，剖檢時(shí)未見任何病理變化。而空載體對(duì)照組的豬只均出現(xiàn)典型的CSF癥狀。邱元等[11]將CSFV E2基因和細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)片段插入真核表達(dá)載體pcDNA3.0內(nèi)構(gòu)建pcE2 和pcE2-GF核酸疫苗，并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果顯示，pcE2和pcE2-GF第3次免疫2周后，免疫小鼠IgG抗體水平逐漸增高，淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率也明顯增高，且pcE2-GF免疫組的IgG抗體水平和淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率高于pcE2免疫組。仇華吉等[12]構(gòu)建了高效表達(dá)CSFV E2蛋白的腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗，該疫苗既能發(fā)揮腺病毒載體的高效轉(zhuǎn)移外源基因的能力，又能發(fā)揮甲病毒復(fù)制子載體自我復(fù)制后高效表達(dá)外源基因及其誘導(dǎo)強(qiáng)大細(xì)胞免疫應(yīng)答的優(yōu)勢(shì)，大大增強(qiáng)了疫苗的免疫效力，免疫劑量也大大減少，對(duì)豬只免疫后能誘導(dǎo)高水平的免疫反應(yīng)，可以完全抵抗致死性CSFV強(qiáng)毒的攻擊。

3 基因缺失疫苗

CSFV基因缺失弱毒疫苗是利用基因工程技術(shù)，對(duì)CSF兔化弱毒進(jìn)行改造，使其缺失或替換某些與病毒復(fù)制無關(guān)的毒力基因，但病毒的復(fù)制能力并不喪失，同時(shí)還保持著良好的免疫原性。Widjojoatmodjo等[13]首先構(gòu)建了表達(dá)CSFV糖蛋白E0的細(xì)胞系SK-6c26，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了可在SK6細(xì)胞上復(fù)制的C-株E0缺失突變株：FL22 株(缺66個(gè)氨基酸)、FL23株(缺215個(gè)氨基酸)。該突變體疫苗對(duì)接觸豬無感染性，不能引起病毒傳播，安全性好。分別用兩個(gè)突變株免疫試驗(yàn)豬，均可抵抗致死量CSFVBrescia株強(qiáng)毒的攻擊，而且E0的缺失可用于感染豬和免疫豬的鑒別。De Smit等[14]構(gòu)建了兩株C株E2基因突變株Flc9 和Flc11。其中Flc9突變株是將C株E2基因C端由BVDV5250株同源部分替代，F(xiàn)lc11突變株是將C株E0基因被BVDV同源基因替代。將2個(gè)突變株一次免疫接種敏感豬，免疫1～2周后用強(qiáng)毒Brescia株或Behring株攻擊，結(jié)果均能提供較好的臨床保護(hù)。Van Gennip等[15]報(bào)道，制備了3株C株E2基因突變株Flc4、Flc47及Flc48。其中Flc4缺失E2基因B/C區(qū) 693-746aa，F(xiàn)lc47缺失E2基因A區(qū)800-864aa，F(xiàn)lc48缺失整個(gè)E2基因689-1062aa。這些病毒均可在表達(dá)E2的細(xì)胞系中復(fù)制，以此3個(gè)突變株皮內(nèi)接種免疫豬，結(jié)果Flc4能完全保護(hù)CSFV強(qiáng)毒致死性攻擊其他兩個(gè)突變株僅能提供部分保護(hù)。Mayer等[16]構(gòu)建了基于CSFV Alfort/187(中等毒力株) 和Eystrup株(強(qiáng)毒株)的Npro基因缺失病毒，Npro基因缺失后毒力減弱。結(jié)果顯示，這兩株缺失病毒毒力大大降低，但其復(fù)制能力和母本病毒并無差別。動(dòng)物攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，這兩種突變毒株免疫豬后，均能刺激免疫豬產(chǎn)生可以抵抗致死劑量強(qiáng)毒攻擊的抗體水平。Yang等[17]構(gòu)建了3個(gè)E2基因缺失的感染性DNA，這3個(gè)缺失突變株均不能產(chǎn)生活病毒，表明E2的每一個(gè)抗原區(qū)對(duì)CSFV的生存都是必要的，但是這些缺失突變株接種豬后，均會(huì)產(chǎn)生不同程度的免疫作用，用血清學(xué)試驗(yàn)可以區(qū)別于正常毒株。

4 活載體疫苗

活載體疫苗是將外源病原體基因插入病毒、細(xì)菌弱毒株基因組或其質(zhì)粒的某些部位使之高效表達(dá)，但不影響該疫苗株的生存與繁殖。接種后，除對(duì)原來病毒或細(xì)菌起保護(hù)作用外，還可獲得對(duì)插入基因相關(guān)病原體的保護(hù)力。De Smit等[18]將CSFV疫苗株的E2和Erns部分序列分別用BVDV相應(yīng)區(qū)段替換，構(gòu)建了兩個(gè)鑲嵌病毒(Flc2、Flc3)，在免疫接種1～2周后，即可對(duì)豬產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，檢測(cè)結(jié)果還顯示，重組病毒在兔和豬中均保留了父代C株的生物學(xué)特性和免疫原性。Reimann等[19]以BVDV弱毒CP7株為框架，通過反向遺傳學(xué)方法用CSFV Alfort/187株的E2基因替換CP7株的相應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建了嵌合病毒CP7-⊿E2PacI，接種后可以保護(hù)豬只抵抗CSFV的致死性感染。Lee等[20]構(gòu)建了能表達(dá)CSFV E2蛋白的gD、gE雙缺失的偽狂犬病病毒重組疫苗，免疫接種試驗(yàn)表明，該活載體疫苗能使豬獲得對(duì)偽狂犬病和CSF的雙重保護(hù)。Ganges等[21]構(gòu)建了能表達(dá)CSFVE2的重組豬痘病毒rSPV/CSFV-E2，將該重組病毒免疫豬，進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示免疫保護(hù)效果良好。徐義剛等[22]用能表達(dá)CSFVT細(xì)胞表位E290多肽和豬細(xì)小病毒主要保護(hù)性抗原VP2蛋白的干酪乳桿菌，并經(jīng)口服接種途徑免疫BALB/c小鼠，結(jié)果顯示，小鼠糞便樣品中可檢測(cè)到抗PPV的特異性sIgA抗體，血清樣本中可檢測(cè)到抗PPV及抗E290的特異性IgG。王養(yǎng)會(huì)等[23]構(gòu)建了表達(dá)CSFV石門株E0基因重組雞痘病毒，將該重組病毒3次腹腔接種小鼠，ELISA檢測(cè)血清抗體滴度高達(dá)1∶4,096，免疫豬3次之后，接種CSFV強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果對(duì)免疫組產(chǎn)生75％的保護(hù)率。楊洋等[24]構(gòu)建了含CSFV E2蛋白基因重組人5型腺病毒，并進(jìn)行鑒定，重組腺病毒免疫小鼠后，可產(chǎn)生CSFV抗體。韓國全等[25]構(gòu)建了豬霍亂沙門菌C500(S.C500)運(yùn)載CSFV新型基因疫苗，口服免疫接種家兔，檢測(cè)CSFV、S.C500特異性抗體；并用CSF兔化弱毒疫苗及豬傷寒沙門菌野毒株依次進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示，口服免疫家兔可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗CSFV和S.C500的特異性ELISA抗體，經(jīng)三免后免疫家兔能夠部分抵抗CSF兔化弱毒疫苗與豬傷寒沙門菌野毒株的攻擊。許信剛等[26]構(gòu)建了表達(dá)CSFVE2蛋白的口服重組減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550(pYA3341-E2)，并對(duì)重組菌表達(dá)的E2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 和Western-blot分析、測(cè)定其在體內(nèi)外的穩(wěn)定性、生長(zhǎng)曲線、安全性及動(dòng)物免疫試驗(yàn)。結(jié)果顯示，重組菌能表達(dá)E2蛋白且表達(dá)的蛋白能與CSFV陽性血清特異性結(jié)合。在體外營養(yǎng)選擇壓力下，重組菌株在體外可穩(wěn)定地?cái)y帶重組質(zhì)粒傳代繁殖，在體內(nèi)可穩(wěn)定地定居于腸系膜淋巴結(jié)和脾。小鼠口服試驗(yàn)證實(shí)重組菌無毒性，安全可靠。動(dòng)物免疫試驗(yàn)表明，口服重組菌免疫豬產(chǎn)生了抗E2蛋白抗體。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，重組菌能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。張小苗等[27]為研究表達(dá)CSFV E0-E2基因重組腺病毒疫苗(rAd-E0-E2)在兔體上的免疫原性，并確定其最小免疫保護(hù)劑量。將rAd-E0-E2按10倍梯度稀釋為107IFU、106IFU、105IFU，分別免疫接種家兔，14d后，用CSF脾淋苗對(duì)各組兔子進(jìn)行攻毒。結(jié)果表明，與對(duì)照組均不保護(hù)和CSF脾淋苗組全部保護(hù)相比，rAd-E0-E2在兔體的最小免疫保護(hù)劑量為107IFU。

5 展望

目前，注射疫苗是防控和凈化CSF最有效的方法，傳統(tǒng)的CSF兔化弱毒疫苗已不能滿足防控和根除CSF的要求。新型CSF疫苗的研發(fā)及配套診斷方法的推出具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，將成為有效控制CSF感染和規(guī)?；i場(chǎng)凈化CSF的重要手段。因此，各國專家、學(xué)者致力于新型CSF疫苗的研制，取得了一定的成就，這些新型CSF疫苗各有其優(yōu)勢(shì)，但也存在一定的缺陷。如亞單位疫苗需要多次免疫并配合佐劑才能提供有效保護(hù)，且生產(chǎn)成本高。核酸疫苗其誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的速度慢，接種劑量大，有整合和轉(zhuǎn)化染色體的潛在危險(xiǎn)；對(duì)病毒活載體疫苗，人類不完全了解病毒的自然發(fā)生及變異機(jī)制，無法控制該類病毒的未來走向，存在安全隱患，基因缺失弱毒疫苗因其毒力基因被人為地刪除，往往不可能完全自行修復(fù)，故不會(huì)發(fā)生返祖現(xiàn)象，但弱毒疫苗的長(zhǎng)期使用可能會(huì)改變CSFV原有的生態(tài)環(huán)境和病毒群落，使CSF流行毒株向遠(yuǎn)離疫苗毒的方向演化，這將給CSF的控制帶來新的挑戰(zhàn)?？傊瑹o論是哪一種疫苗都不能作為控制并最終消滅CSF的唯一手段。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不久的將來會(huì)有更多價(jià)廉、安全、有效的新型CSF疫苗誕生?！?/p>

參考文獻(xiàn)：

[1] 于新友,李天芝,王金良,等.基于Erns基因的豬瘟病毒一步法RT-PCR快速檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用[J].養(yǎng)豬,2014(6):93～95.

[2] 于新友,李天芝,苗立中,等.分子生物學(xué)技術(shù)在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷方法中的研究進(jìn)展[J].豬業(yè)科學(xué),2015(1):76～78.

[3] 殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:652～664.

[4] Moormann RJ, Bouma A, Kramps JA, et al. Development of a classica swine fever subunit marker vaccine and companion diagnostic test[J]. Vet Microbiol, 2000,73(2～3):209～219.

[5] 湯德元,李春燕,羅險(xiǎn)峰,等.豬瘟病毒貴州流行株E2基因原核表達(dá)及其免疫原性的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(11):1649～1653.

[6] 董炳梅,謝金文,魏鳳,等.豬瘟病毒E2蛋白靶向化樹突狀細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)的BALB/c小鼠體內(nèi)/外免疫應(yīng)答的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,36(4):305～309.

[7] 李文良,毛立,楊蕾蕾,等.豬瘟病毒糖基化E2蛋自和E0蛋自的協(xié)同免疫保護(hù)作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,31(2):357～361.

[8] 徐倩倩,張小敏,景嬌,等.熱休克蛋白70促進(jìn)豬瘟病毒囊膜糖蛋白E0的小鼠免疫效果[J].病毒學(xué)報(bào),2015,31(4):363～369.

[9] Yu X, Tu C, Li H, et al. DNA-mediated protectionagainst classical swine fever virus[J].Vaccine, 2001, 19(11～12):1520～1525.

[10] 李娜.基于甲病毒復(fù)制子載體的豬瘟DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià)[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[11] 邱元,黃復(fù)深,陳爾曼,等.GM-CSF與豬瘟病毒E2基因共表達(dá)載體的構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007,33(2):200～204.

[12] 仇華吉,孫元,李娜,等.腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗及其應(yīng)用:中國,101966341A[P].2011-02-09.

[13] Widjojoatmoajo M N, Van Gennip HG, Bouma A, et al. Classical swine fever virus E(rns) deletion mutants:trans-complementation and potential use as nontransmissible,modifi ed,live-attenuated marker vaccines[J]. J Virol, 2000,74(7):2973～2980.

[14] De Smit A J, BoumaA, Van Gennip HG, et al. Chimeric (marker)C-strain viruses induced clinical protection against virulent clas-sical swine fever virus (CSFV) and reduce transm ission of CSFV between vaccinated pigs[J].Vaccine, 2001,19(11～12):1467～1476.

[15] Van Gennip HG, Bouma A, Van Rijin PA, et al. Experimental non-transmissible marker vaccine for classical swine fever (CSF) by transcomplementation of E(rns) or E2 of CSFV[J]. Vaccine, 2002,20(11～12):1544～1556.

[16] Mayer D, Hofmann MA, Tratschin JD. Attenuation of classicalswine fever virus by deletion of the viral N(pro)gene[J]. Vaccine, 2004,22(3～4):317～328.

[17] Yang Z, Wu R, Li R W, et al. Chimeric classical swine fever(CSF)-Japanese encephalitis(JE)viral replicon as a nontransmissible vaccine candidate against CSF and JE infections[J]. Virus Res, 2012,165(1):61～70.

[18] De Smit AJ. Laboratory diagnosis, epizootiology and effi cacy of marker vaccines in classical swine fever:a review[J].Vet Q, 2000,22(4):182～188.

[19] Reimann I, Depner K, Trapp S, et al. An avirulent chimericPestivirus with altered cell tropism protects pigs against lethalinfection with classical swine fever virus[J]. Virology, 2004,322(1):143～157.

[20] Lee KS, Sohn MR, Kim BY, et al. Production of classical swine fever virus envelope glycoprotein E2 as recombinant polyhedra in baculovirusinfected silkworm larvae[J]. Mol Biotechnol, 2012,50(3):211～220.

[21] Ganges L, Nú?ez JI, Sobrino F, et al. Recent advances in the development of recombinant vaccines against classical swine fever virus:cellular responses also play a role in protection[J].Vet J, 2008,177(2):169～177.

[22] 徐義剛，崔麗春，葛俊偉，等.豬瘟病毒T細(xì)胞表位E290多肽與豬細(xì)小病毒VP2蛋白在干酪乳桿菌中的共表達(dá)及免疫小鼠特異性抗體的測(cè)定[J].微生物學(xué)報(bào),2007,47(04):667～672.

[23] 王養(yǎng)會(huì),李譜華,張淼濤,等.表達(dá)豬瘟病毒石門株E0基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及動(dòng)物免疫試驗(yàn)[J].病毒學(xué)報(bào),2008,24(1):59～63.

[24] 楊洋,高博,宮婷,等.豬瘟病毒E2蛋白基因重組人5型腺病毒的構(gòu)建及鑒定[J].中國生物制品學(xué)雜志,2012,25(7):805～808,815.

[25] 韓國全,郭萬柱,張博,等.豬霍亂沙門菌C500運(yùn)載豬瘟病毒新型基因疫苗在家兔體內(nèi)的免疫應(yīng)答[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010,30(12):1561～1565.

[26] 許信剛,王丹,童德文.表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白重組減毒鼠傷寒沙門氏菌活載體疫苗株的構(gòu)建及動(dòng)物免疫試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)科學(xué), 2011,41(9):901～906.

[27] 張小苗,張恒,楊玉艾,等.表達(dá)豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗在兔體上的免疫原性分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(9):8～12.

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-012-15)。