侯清娥，董建偉，王錄軍

（渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南　714000）

糖蛋白的研究概述

侯清娥，董建偉，王錄軍

（渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南714000）

天然糖蛋白的研究成為繼多糖之后生物活性成分研究的又一熱點(diǎn)，它是一類具有重要生理和藥理活性作用的功能活性成分。針對(duì)糖蛋白的結(jié)構(gòu)、提取、純化、生理功能做簡(jiǎn)要概述，旨在建立糖蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，為改變擴(kuò)展蛋白質(zhì)的生理作用設(shè)計(jì)提供新思路。

糖蛋白；分子結(jié)構(gòu)；提取；純化；生理功能

0　引言

糖蛋白為生物體內(nèi)重要生物大分子之一，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，甚至在單細(xì)胞有機(jī)體和病毒中也有發(fā)現(xiàn)，其以各種形式、種類分布于生物體的細(xì)胞內(nèi)外液及組織中，構(gòu)成生物體內(nèi)的多種活性物質(zhì)。糖蛋白對(duì)于生長(zhǎng)發(fā)育、信息傳遞、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種生命活動(dòng)起重要作用，同時(shí)與多種疾?。ㄈ缧难芗膊?、肝腎病、糖尿病及腫瘤癌癥等） 的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［1-2］。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，天然糖蛋白功能性質(zhì)的研究已成為國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)，并在各個(gè)領(lǐng)域（如生物、化學(xué)、免疫、醫(yī)學(xué)及食品等）展開深入研究。

1　糖蛋白的結(jié)構(gòu)

1.1糖蛋白的組成

糖蛋白的結(jié)構(gòu)主要包括多肽鏈和糖2部分，二者之間以共價(jià)鍵連接［3］。已知糖蛋白中的多肽鏈含有幾乎所有的氨基酸，其中含量較高的主要包括絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、天門冬酞胺（Asn）、羥脯氨酸（Hyp）及羥賴氨酸（Hyl）等幾種氨基酸。對(duì)于單糖而言，通常出現(xiàn)在糖鏈中單糖主要包括D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、L-阿拉伯糖等［4］。

1.2糖肽鍵

糖蛋白中連接糖鏈和多肽鏈的共價(jià)鍵稱為糖肽鍵，主要連接方式有N型連接、O型連接、糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白及C型連接4種，其中以N型和O型糖蛋白最為常見(jiàn)［5］。

1.3糖鏈

糖蛋白的糖鏈在多肽鏈上的分布具有十分普遍的微觀不均一性，因此糖鏈結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜性。但在生物體內(nèi)一些不同種類糖蛋白得的N-糖肽鍵型糖鏈可包括3種類型：簡(jiǎn)單型糖鏈（或甘露糖型糖鏈）、復(fù)雜型糖鏈、混和型（或雜種型）糖鏈，其都具有相同的五糖核心結(jié)構(gòu)［6］。

2　糖蛋白的研究方法

2.1糖蛋白的分離、純化及純度鑒定

對(duì)糖蛋白的研究，首先對(duì)生物體樣品經(jīng)過(guò)提取、分離、純化所得糖蛋白為研究對(duì)象，通過(guò)結(jié)構(gòu)均一的純度鑒定證明之后再進(jìn)行進(jìn)一步研究。常見(jiàn)的提取純化步驟為生物材料→粉碎→浸提→濃縮→沉淀→干燥→糖蛋白粗品→除雜→純化→純度鑒定。

2.1.1糖蛋白的提取

在糖蛋白提取過(guò)程中，有水提、醇提、稀鹽溶液和緩沖溶液浸提、酸堿溶液提取以及酶解法等提取法。因?yàn)樘堑鞍字刑擎溇哂懈叨扔H水性，可采用蒸餾水直接提取，有時(shí)提取前利用醇或醚回流將原料脫脂、脫色，然后采用水浸提，水溫可根據(jù)糖蛋白的熱穩(wěn)定性而定。所得糖蛋白提取液采用（真空式）膜分離技術(shù)進(jìn)行濃縮，再通過(guò)有機(jī)溶劑或鹽析方式進(jìn)行沉淀。沉淀后的樣品可采用真空冷凍或者有機(jī)溶劑等干燥方法進(jìn)行干燥處理，由此獲得的糖蛋白為粗糖蛋白。

2.1.2糖蛋白的純化

糖蛋白純化有除雜和分級(jí)2個(gè)步驟。雜蛋白一般采用Sevag法除去，對(duì)于粗糖蛋白樣品中一些小分子雜質(zhì)（如色素、無(wú)機(jī)鹽和低聚糖等）可采用膜分離法、透析法、凝膠過(guò)濾法等多種方法將其除去。分級(jí)純化常用方法有凝膠柱層析法、離子交換柱層法和親和層析法，其次有沉淀法、電泳法、超濾法、超離心法等，要實(shí)現(xiàn)糖蛋白的純化需要幾種方法結(jié)合處理進(jìn)行分離提取?？傊?，尋找確定一種適合某種樣品分級(jí)純化是一個(gè)需要進(jìn)行大量試驗(yàn)來(lái)研究和探索的過(guò)程。

2.1.3糖蛋白的純度鑒定

糖蛋白為大分子化合物，因其小分子種類的比例及種類的多樣性，其純度通常不能用小分子化合物的純度標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量。純度鑒定方法包括超離心法、層析法、色譜法、電泳法等，通常在實(shí)際的操作中需要2種及2種以上的鑒定方法才能完成其純度鑒定。

2.2糖蛋白分子量的測(cè)定

物質(zhì)的性質(zhì)常與其結(jié)構(gòu)、分子量大小相關(guān)，因此對(duì)糖蛋白結(jié)構(gòu)及分子量的測(cè)定成為糖蛋白研究的前提。測(cè)定糖蛋白分子量的方法有SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、凝膠色譜法、超濾法、高效液相色譜法，以及滲透壓法、端基法、黏度法和光散射法等。糖蛋白的分子量一般是不均一的，采用不同的測(cè)量方法所得分子量結(jié)果存在一定差異，因此在記錄糖蛋白的分子量測(cè)定值時(shí)一定要說(shuō)明測(cè)定方法及其相關(guān)信息。

2.3糖蛋白中糖肽鏈的鑒定

2.3.1N-糖肽鍵的確定

N-糖肽鍵即D-GlcNAc β-Asn，又稱Ⅰ型糖肽鍵，其天冬酰胺（Asn）總出現(xiàn)在多肽鏈中的Asn-X-Thr/Ser順序中。因此，確定了糖蛋白中肽鏈的氨基酸連接順序，即可初步判定N-糖肽鍵的連接位點(diǎn)。采用生物酶解或化學(xué)方法釋放與天冬酰胺連接的糖鏈，特異地使N-糖肽鍵斷裂，從而證明該糖蛋白為N-糖肽鍵類型［4］。

2.3.2O-糖肽鍵的確定

O-糖肽鍵（Ⅱ型、Ⅲ型糖苷鍵） 在溫和條件下，采用稀堿水解糖蛋白，即可將與肽鏈上絲氨酸或蘇氨酸羥基相連的糖鏈或單糖水解下來(lái)。水解后，肽鏈上的絲氨酸和蘇氨酸分別轉(zhuǎn)變?yōu)榘被┧岷桶被∠┧?，而后者于紫外?40 nm處有明顯的吸收峰。因此，根據(jù)糖蛋白水解前后吸光度的變化來(lái)判定糖蛋白中O-糖肽鍵的存在情況。

3　糖蛋白的生物活性

通常糖蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為1.5×104～1.5×106Da，其以溶解狀態(tài)或與細(xì)胞膜結(jié)合狀態(tài)廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)外。糖蛋白作為生物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，在生物體內(nèi)起著信號(hào)的傳遞和識(shí)別、物質(zhì)的運(yùn)輸、刺激生長(zhǎng)和分裂等一系列生物活性功能［2］。

3.1糖蛋白免疫調(diào)節(jié)活性

截至目前，已發(fā)現(xiàn)許多糖蛋白具有免疫調(diào)節(jié)作用。程顯好等人［7］對(duì)蟲花菌菌絲體中糖蛋白活性研究中表明糖蛋白可增強(qiáng)小鼠免疫能力，具體表現(xiàn)在小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬能力的提高和免疫器官脾臟的明顯增重。闞健全等人［8］在甘薯中提取的糖蛋白，對(duì)其活性研究發(fā)現(xiàn)，其能促進(jìn)人體免疫細(xì)胞活性的提高，同時(shí)使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活力和增殖明顯增強(qiáng)，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。彭雪梅等人［9］采用枸杞提取分離得到糖蛋白化合物，試驗(yàn)結(jié)果表明，糖蛋白不僅具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，而且還具有很好抗氧化性。顧謙群等人［10］用熱水煮提和凝膠過(guò)濾層析，從櫛孔扇貝分離而得到的糖蛋白，研究表明該糖蛋白具有顯著的腫瘤抑制作用，該作用可能與小鼠免疫功能增強(qiáng)密切相關(guān)。

3.2糖蛋白的抗氧化活性

自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的化合物，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的細(xì)胞及組織，并與多種疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)，因此從生物活性成分來(lái)尋找無(wú)毒高效的自由基清除劑及抗氧化劑的研究成為熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，許多糖復(fù)合物都具有提高抗氧化酶、清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等活性。高居易等人［11］對(duì)紅花建蓮的蓮子通過(guò)鹽析沉淀，進(jìn)而采用親和層析和凝膠層析分離純化得到2種糖蛋白GLP-Ⅰ和GLP-Ⅱ，活性研究表明2種糖蛋白均有清除自由基的作用。王仲孚等人［12］從鈍頂螺旋藻中分離純化得到的糖綴合物對(duì)氧自由基及氫基自由基都有良好的清除作用。聶少平等人［13］對(duì)茶葉糖蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)超氧自由基及DPPH自由基有一定的清除作用。

3.3糖蛋白的降血脂、降血糖活性

高血脂是指血液中的血脂水平過(guò)高的病癥，研究表明糖蛋白具有良好的降血脂功效。于秋英等人［14］利用高血脂癥模擬小鼠的灌胃試驗(yàn)，表明莼菜多糖蛋白有降低小鼠血脂功效。李亞娜等人［15］從甘薯中提取的一種所謂蛋白薯糖卵白的甘薯糖蛋白，其具有明顯的降血脂功能，并具有顯著抑制肝臟膽固醇含量升高的功效。楊立明等人［16］曾報(bào)導(dǎo)日本研究人員從甘薯中發(fā)現(xiàn)的一種糖蛋白，對(duì)人體中血液黏稠、血管阻塞以及器官老化速度等都有一定的抑制及減緩作用。劉主等人［17］研究發(fā)現(xiàn)，甘薯中的一種糖蛋白明顯降低高血糖大鼠的血糖值，并增強(qiáng)其胰島素的分泌功能。張琪等人［18］從小麥中獲得一種糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)糖尿病小鼠的淀粉耐量有明顯增強(qiáng)作用，從而起到降低小鼠血糖的作用，其作用機(jī)制可能與多糖復(fù)合物調(diào)節(jié)小腸內(nèi)各腸段代謝酶的活性有關(guān)。

3.4糖蛋白的抗腫瘤活性

據(jù)報(bào)道，有科研人員從扇貝中分離所得幾種抗腫瘤組分最大抑瘤率達(dá)99%以上，經(jīng)鑒定其主要成分為糖蛋白，其作用機(jī)制是通過(guò)影響宿主的免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用［19］。童朝陽(yáng)等人［20］從褶紋冠蚌（Cristaria plicata）中提取的相對(duì)分子質(zhì)量約為30 kDa的糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠病瘤細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抵抗效果，并對(duì)免疫細(xì)胞的殺傷活性有明顯增強(qiáng)作用。張夢(mèng)杰等人［21］從陰溝腸桿菌中提取到一種糖蛋白，并對(duì)其研究表明該糖蛋白對(duì)肝、肺、腸、胃等癌細(xì)胞均有明顯殺傷作用。Sasaki T等人［22］對(duì)一些軟體動(dòng)物進(jìn)行研究，證明從其體內(nèi)分離的一種糖蛋白，具有顯著抑制小鼠腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和抗白血病作用。

結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了其生物學(xué)活性的多樣性。糖蛋白除上述生物學(xué)活性外，還具有包括抗凝血、抗炎、抗菌、抗水腫、抗輻射、止喘等其他生物活性。

4　展望

糖蛋白的性質(zhì)特殊，其價(jià)值被廣泛認(rèn)可并大量研究應(yīng)用。目前，主要在生化試劑、新型特種藥物和功能性食品中有相應(yīng)的應(yīng)用，如一些保健食品、特殊人群食品中免疫球蛋白的添加來(lái)提高人體對(duì)各種疾病的免疫力；采用基因工程應(yīng)用于糖蛋白對(duì)其進(jìn)行研究及改善，從而得到新型的重組產(chǎn)物?，F(xiàn)在，科學(xué)家們結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件專業(yè)對(duì)糖鏈轉(zhuǎn)移酶和代謝酶的基因芯片攻關(guān)，建立糖蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，為擴(kuò)展蛋白質(zhì)的生理作用設(shè)計(jì)提供新思路。

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Review on Glycoprotein Research Progress

HOU Qing'e，DONG Jianwei，WANG Lujun
（Weinan Vocational&Techical College，Winan，Shaanxi 714000，China）

The research on natural glycoprotein has become another spotlight after the bioactive constituents of polysaccharide. glycoprotein is a kind of functional active components which have important physiological and pharmacological activities.This article reviews the latest research on configuration，extraction purification and physiological function.In order to buildagly coprotein database，and to provide new methods on the design of protein's funcation.

glycoprotein；molecules structure；extraction；purification；physiological function

R979.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.050

2016-11-23

渭南市科技創(chuàng)新扶持資金項(xiàng)目（2014TCPT-7）。

侯清娥（1983— ），女，碩士，助教，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品深加工及貯藏。