蘇韞 張毅 李娟 等

摘要：目的 觀察紅芪對肺間質(zhì)纖維化模型大鼠肺組織膠原面積、透明質(zhì)酸（HA）及層黏連蛋白（LN）表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制，并篩選紅芪最佳有效部位。方法 將144只SPF級Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、強(qiáng)的松組，以及紅芪多糖、黃酮、皂苷的高、中、低劑量組。采用氣管滴注博萊霉素法建立肺纖維化模型，從造模后第2日起，各藥物組分別給予相應(yīng)劑量藥物，每日1次，共28 d。Masson染色觀察肺組織膠原纖維的變化，放射免疫法檢測各組大鼠肺組織勻漿中HA、LN含量。結(jié)果 與模型組比較，紅芪黃酮各劑量組、紅芪多糖低劑量組肺泡炎明顯減輕。紅芪黃酮低劑量組、紅芪多糖中劑量組、紅芪皂苷低劑量組肺組織膠原面積明顯減小。與模型組比較，紅芪多糖高劑量組、紅芪黃酮各劑量組、紅芪皂苷高劑量組HA含量明顯下降。紅芪多糖高劑量組，紅芪黃酮中、低劑量組，紅芪皂苷中、低劑量組LN含量明顯下降。結(jié)論 紅芪多糖、黃酮、皂苷在適宜劑量下均能減輕肺泡炎癥，抑制膠原纖維增生、沉積，降低肺組織中HA、LN含量，其中紅芪黃酮效果較佳。

關(guān)鍵詞：肺纖維化；紅芪有效部位；膠原面積；透明質(zhì)酸；層黏連蛋白；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.019

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）04-0072-05

Effects of Active Ingredients in Radix Hedysari on Collagen Area， Hyaluronic Acid and Laminin of Lung Tissues in Rats with Pulmonary Interstitial Fibrosis SU Yun， ZHANG Yi， LI Juan， LI Xue-yan， LIU Yong-qi， LIN Xing-yao， LI Jin-tian （Gansu University of Chinese Medicine， Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation of Ministry of Education， Provincial Key Laboratory of TCM Pharmacology and Toxicology，， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Radix Hedysari on collagen area， hyaluronic acid （HA） and laminin （LN） of lung tissues in rat with pulmonary interstitial fibrosis； To investigate the mechanism and screen the best active ingredients in Radix Hedysari. Methods Totally 144 SPF Wistar rats were randomly divided into control group， model group， metacortandracin group， and Radix Hedysari polysaccharide， flavone and saponin groups were set as high-， medium-， and low-dose groups. Pulmonary interstitial fibrosis models were set up by dropping bleomycin into air tube of rats. All groups were taken corresponding medicine with appropriate dose daily on day 2 after models were established for 28 days. Collagen fibrils in lung tissue were observed by Masson dying and contents of HA and LN in lung tissue of rats in each group were detected by radioimmunoassay. Results Compared with the model group， pulmonary alveoli in Radix Hedysari flavone high-， medium-， and low-dose groups and Radix Hedysari polysaccharide low-dose group were relieved obviously； collagenous fiber area in Radix Hedysari flavone low-dose group， Radix Hedysari polysaccharide medium-dose group， and Radix Hedysari saponin low-dose group decreased obviously. Compared with the model group， the content of HA in Radix Hedysari polysaccharide high-dose group， Radix Hedysari flavone high-， medium-， and low-dose groups， and Radix Hedysari saponin high-dose group decreased obviously； the content of LN in Radix Hedysari polysaccharide high-dose group， Radix Hedysari flavone

medium- and low-dose groups， and Radix Hedysari saponin medium- and low-dose groups decreased obviously. Conclusion Polysaccharide， flavone and saponin of Radix Hedysari have the abilities to alleviate inflammation of pulmonary alveoli， inhibit proliferation and deposition of collagen fibrils， and reduce the contents of HA and LA in lung tissue. Among these active ingredients， flavone has the best effect.

Key words： pulmonary fibrosis； active ingredients in Radix Hedysari； collagen area； HA； LN； rats

肺纖維化病理改變以大量的成纖維細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)沉積并伴有炎癥和損傷所致組織結(jié)構(gòu)破壞為特征。透明質(zhì)酸（HA）是間質(zhì)中的一種主要的糖胺聚糖，也是細(xì)胞外基質(zhì)的一種主要成分。肺泡間質(zhì)中HA積累提示HA很可能在肺纖維化早期肺泡炎階段的肺間質(zhì)水腫中起重要作用[1-2]。層黏連蛋白（LN）屬于細(xì)胞基質(zhì)中的非膠原糖蛋白，廣泛分布于基底膜的透明層，與膠原一起構(gòu)成基底膜骨架，近年許多研究表明，其參與了內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程，特別在肺纖維化過程中發(fā)揮了重要作用，成為監(jiān)測肺纖維化病變的一個較敏感指標(biāo)[3]。本實驗以博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型，以醋酸潑尼松片為陽性對照藥，通過對肺組織病理形態(tài)學(xué)、膠原面積的影響及HA、LN含量的觀察，探討紅芪有效部位對肺間質(zhì)纖維化的防治作用及其機(jī)制，篩選紅芪最佳有效部位，為臨床防治肺纖維化提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠144只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，2月齡，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心，動物合格證號SCXK（甘）2011-0001。

1.2 藥物

選用甘肅地道藥材紅芪，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心藥物制劑實驗室提取、分離、鑒定，得到紅芪多糖、黃酮、皂苷（純度>50%）。注射用鹽酸平陽霉素（哈爾濱博萊霉素有限公司，批號110424），醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號110810）。

1.3 主要試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號110311），戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司，批號101021），HA放免試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，111220），LN放免試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所111220）。GC-9111型放射免疫γ計數(shù)器（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），KDC-2044低速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），RM2135石蠟切片機(jī)（德國），TEC-VEM-J2石蠟包埋機(jī)（日本），VIP-5JR-J2石蠟脫水機(jī)（日本），SFC-182型生物顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司），Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件（美國Media Cybemetics公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

144只SPF級Wistar用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、強(qiáng)的松組及紅芪多糖、黃酮、皂苷的低、中、高劑量組，共12組，每組12只，SPF級常規(guī)飼養(yǎng)，充足飼料喂養(yǎng)（北京科奧協(xié)力飼料有限公司），自由飲水經(jīng)MF-RO-10型實驗動物飲用水處理器（甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級實驗動物中心提供）。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，采用氣管內(nèi)一次性注入博萊霉素（5 mg/kg）復(fù)制肺纖維化模型[4-5]。注藥后，立即將動物直立旋轉(zhuǎn)，使藥物在肺內(nèi)分布均勻。

2.2 給藥

各給藥組給藥劑量按體表面積和人與動物臨床劑量倍數(shù)直接換算法并參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，結(jié)合可比性原則確定本實驗給藥劑量為紅芪多糖、皂苷高劑量（60 mg/kg）、中劑量（30 mg/kg）、低劑量（15 mg/kg），紅芪黃酮高劑量（22.5 mg/kg）、中劑量（15 mg/kg）、低劑量（7.5 mg/kg）。造模后第2日起，每日上午灌胃1次，連續(xù)28 d。強(qiáng)的松組給予醋酸潑尼松片，給藥劑量為3 mg/kg。各藥物臨用前以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成相應(yīng)濃度的溶液。模型組和空白組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。給藥體積1 mL/100 g。

2.3 取樣

各組大鼠均于實驗第28日腹腔注射麻醉處死取樣。末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射麻醉，剪開胸腔，小心分離肺組織，剪取左肺下葉組織制備勻漿，檢測HA、LN。剪取右肺中葉，行HE、Masson染色，觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

2.4 圖像分析

按Szapiel等[9]方法評價肺泡炎程度，將肺泡炎分為4級：0級：無肺泡炎；1級：輕度肺泡炎，受累面積少于全肺20%；2級：中度肺泡炎，受累面積為全肺20%～50%；3級：重度肺泡炎，受累面積大于全肺50%，呈彌漫性分布。

Masson染色后，用ONLYMPUS AX80全自動熒光顯微鏡采集圖像，在40倍視野下每張切片選定10個視野，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量肺組織膠原纖維平均面積。膠原纖維平均面積=肺間質(zhì)綠染面積÷視野總面積×100%。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)用—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅芪對肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

模型組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，多數(shù)肺泡閉鎖、裂隙、萎陷，部分融合成大泡狀，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞滲出，肺間隔明顯增寬增厚。強(qiáng)的松組肺間隔稍增寬，有成纖維細(xì)胞增生，肺泡炎程度較模型組減輕，炎性細(xì)胞浸潤較模型組少。紅芪多糖、黃酮、皂苷各劑量組肺泡炎程度與模型組相比均有明顯減輕，肺泡腔未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，肺間隔略增寬，間質(zhì)內(nèi)可見不同程度小灶狀膠原組織沉積，部分肺泡融合，結(jié)構(gòu)紊亂。其中紅芪黃酮各劑量組、紅芪多糖低劑量組肺組織炎癥相對較輕，見圖1。

3.2 紅芪對肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織膠原面積及肺泡炎程度的影響

肺組織切片經(jīng)Masson染色后鏡下觀察膠原纖維呈現(xiàn)亮綠色，肌肉、胞漿呈現(xiàn)紅色，胞核呈現(xiàn)藍(lán)黑色?？瞻捉M肺組織結(jié)構(gòu)清晰，沒有纖維化表現(xiàn)。模型組肺泡肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)有炎癥細(xì)胞的滲出，肺間質(zhì)可見大量的膠原纖維增生、沉積，出現(xiàn)條索狀、片狀、灶狀的纖維化區(qū)域。強(qiáng)的松組肺組織結(jié)構(gòu)較清晰，肺泡隔增厚，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)可見膠原纖維增生及炎性細(xì)胞浸潤。紅芪多糖、黃酮、皂苷各劑量組肺纖維化程度與模型組比較均明顯減輕，肺間隔略增寬，間質(zhì)內(nèi)可見小灶狀膠原纖維沉積，病變范圍較小。其中紅芪黃酮低劑量組、紅芪多糖中劑量組、紅芪皂苷低劑量組肺組織膠原纖維沉積較模型組明顯減少，見圖2。

與空白組比較，模型組大鼠肺組織肺泡炎明顯（P<0.01）；與模型組比較，紅芪黃酮低、中劑量組，紅芪多糖低劑量組肺泡炎明顯減輕（P<0.05，P<0.01）。與空白組比較，模型組大鼠肺組織膠原平均面積明顯增大（P<0.01）；與模型組比較，紅芪黃酮低劑量組膠原平均面積明顯減?。≒<0.01），強(qiáng)的松組、紅芪多糖中劑量組、紅芪皂苷低劑量組膠原平均面積減?。≒<0.05），見表1。

3.3 紅芪對肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織透明質(zhì)酸、層黏連蛋白含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織HA、LN含量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，紅芪多糖高劑量組、紅芪黃酮各劑量組、紅芪皂苷高劑量組肺組織HA含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）；紅芪多糖高劑量組，紅芪黃酮中、低劑量組，紅芪皂苷低、中劑量組肺組織LN含量明顯下降（P<0.05，P<0.01），見表2。

4 討論

由于博萊霉素對肺部毒性作用的可預(yù)測性，中醫(yī)藥研究特發(fā)性肺纖維化動物模型一般采用國際上通用的氣管內(nèi)注入博萊霉素方法制作動物肺纖維化模型[10]。

紅芪系豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪的根，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利尿消腫之功效，用于治療心血管、呼吸、免疫、內(nèi)分泌等系統(tǒng)疾病。本課題組前期實驗表明，紅芪有效部位黃酮可從調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）-1的蛋白表達(dá)，使MMPs/TIMPs趨于平衡[11]；抑制微血管內(nèi)皮生長因子及微血管內(nèi)皮生長因子受體-2，抑制肺纖維化大鼠微血管新生[12-13]；改善肺纖維化大鼠的病理損傷、減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)[14]。

本實驗肺纖維化大鼠模型組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁破壞，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)有炎癥細(xì)胞滲出，肺泡隔明顯增厚，可見大量膠原纖維增生、沉積。肺組織LN、HA含量明顯升高，說明肺內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的合成明顯增加，且存在炎癥。經(jīng)紅芪干預(yù)后，大鼠肺部的炎癥明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)較完整，間質(zhì)膠原沉積減少，通過半定量肺泡炎及肺纖維化的結(jié)果觀察，表明紅芪有效部位能夠改善肺纖維化異常的組織結(jié)構(gòu)；紅芪可降低肺組織HA、LN含量，紅芪多糖高劑量組、紅芪黃酮各劑量組、紅芪皂苷高劑量肺組織HA含量明顯降低；紅芪多糖高劑量組，紅芪黃酮中、低劑量，紅芪皂苷低、中劑量組肺組織LN含量明顯降低。

綜上，紅芪多糖、黃酮、皂苷在適宜劑量下均能減輕肺泡炎癥，抑制膠原纖維增生、沉積。降低肺組織中HA、LN的含量，其中紅芪黃酮效果較佳。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫達(dá)，苗淼，張瑋.HA與IPF發(fā)病機(jī)制關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，18（5）：28-29.

[2] 徐波.博萊霉素致肺纖維化大鼠血和支氣管肺泡灌洗液中透明質(zhì)酸和層粘連蛋白含量的動態(tài)變化[J].實驗動物科學(xué)與管理，2004，21（1）：7-8.

[3] 胡迎春，賀性鵬.層粘連蛋白與肺纖維化病變關(guān)系的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2010，16（4）：484-486.

[4] 李金田，魏舒暢，劉永琦，等.黃芪多糖對肺纖維化大鼠肺上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自由基代謝的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（10）：2360- 2362.

[5] 李娟，張毅，劉永琦，等.黃芪多糖對肺纖維化大鼠細(xì)胞因子及肺組織病理結(jié)構(gòu)的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（7）：1684-1685.

[6] 雷豐豐，趙健雄，王學(xué)習(xí)，等.紅芪總多糖對大鼠肺間質(zhì)纖維化及其轉(zhuǎn)化生長因子β1干預(yù)的實驗觀察[J].中藥材，31（6）：873-877.

[7] 李淑華，馮芹喜，劉亞威，等.黃芪黃酮（AF）對衰老過程中小鼠胸腺組織及腦組織NO、SOD、MDA指標(biāo)的影響[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006， 27（5）：12-14.

[8] 李淑華，馮芹喜.黃芪黃酮（AF）延緩衰老作用的實驗研究[J].醫(yī)藥世界，2007，13（2）：40-41.

[9] SZAPIEL S V， ELSON N A， FULMER J D， et al. Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse[J]. The American Review of Respiratory Disease，1979，120：893.

[10] 王健.肺纖維化的實驗研究[J].國外醫(yī)學(xué)：臨床放射學(xué)分冊，2007， （2）：74-77.

[11] 蘇韞，張毅，李娟，等.紅芪黃酮對肺纖維化模型大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2及其抑制劑-1蛋白表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2015， 22（1）：47-49.

[12] 舍雅莉，蘇韞，張毅，等.紅芪黃酮對肺間質(zhì)纖維化模型大鼠微血管密度的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（4）：43-45.

[13] 蘇韞，張毅，李娟，等.紅芪黃酮在不同時間點對肺間質(zhì)纖維化模型大鼠微血管新生指標(biāo)的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（3）：129- 132.

[14] 張毅，李娟，蘇韞，等.紅芪黃酮對肺纖維化模型大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志， 2014， 21（3）：47-49.