周吉芳 黃越燕

摘要：龍葵為雙子葉茄科茄屬一年生草本植物，生物堿類化合物是龍葵的主要生物活性成分，具有較強的抗腫瘤活性。目前，龍葵生物堿的提取方法有溶劑提取、超聲提取、微波提取、超臨界萃取、柱層析等，檢測方法有酸性染料比色法、薄層掃描法、高效液相色譜法、反相高效液相色譜法、超高效液相色譜法等。本文對近年來龍葵生物堿提取及檢測方法的研究進展進行綜述，旨在為龍葵堿的研究和開發(fā)提供參考。

關鍵詞：龍葵生物堿；提?。粰z測；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.040

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）04-0133-04

Research Progress in Extraction and Detection Methods of Alkaloids from Solanum Nigrum ZHOU Ji-fang， HUANG Yue-yan （College of Medicine， Jiaxing University， Jiaxing 314001， China）

Abstract： Solanum Nigrum is a kind of dicotyledon solanaceae annual herb， and alkaloids are its main bioactive constituents， with good antitumor activity. The current extraction methods for alkaloids include solvent extraction， ultrasonic extraction， microwave extraction， supercritical fluid extraction， and column chromatography etc， while the detection methods include acid dye colorimetry， thin layer scanning， high performance liquid chromatography， reversed-phase high performance liquid chromatography， and ultra-high performance liquid chromatography etc. This article reviewed the research progress in extraction and detection methods of alkaloid from Solanum Nigrum in recent years， so as to provide references for further research and development of alkaloid from Solanum Nigrum.

Key words： alkaloids from Solanum Nigrum； extraction； detection； review

龍葵Solanum nigrum L.系雙子葉茄科茄屬一年生草本植物，全國各地均有分布。其性寒，味苦、微甘，有小毒，有清熱解毒、活血散瘀、利水消腫、止咳祛痰功效。龍葵全草含生物堿、多糖、皂苷等多種成分，其中龍葵生物堿類成分包括龍葵堿（Solanine）、龍葵定堿（Solanigridine）、澳洲茄堿（Solasonine）、澳洲茄邊堿（Solamargine）、澳洲茄明堿（Solasodamine）和糖苷生物堿（glycoalkaloids）等[1]，其抗腫瘤作用及其機制研究是近年的研究熱點[2]。茲綜述近年來國內外對龍葵生物堿提取分離和檢測方面新技術的研究現(xiàn)狀，分析其原理及優(yōu)缺點，以期為龍葵生物堿研究和開發(fā)提供參考。

1 提取方法

1.1 傳統(tǒng)提取方法

1.1.1 水或酸水回流提取法 堿性較強的生物堿在植物體中多成鹽，可溶于水；而堿性較弱或中性生物

基金項目：浙江省教育廳科研項目（Y201431468）；嘉興市科技局科技項目（2009AY2067）；嘉興學院校級SRT項目（2014年）；浙江省教育科學規(guī)劃課題（2015SCG060）

堿則以不穩(wěn)定的鹽或游離堿的形式存在。因此，可采用0.5%～1%的乙酸、硫酸、鹽酸等作為提取溶劑，提取液經濃縮后，再以堿化使生物堿游離出來，用有機溶劑萃取。周氏[3]采用乙醇回流、水回流及乙醇滲漉法分別提取龍葵總生物堿，結果水提取的總堿得率為1.05%，低于乙醇回流和乙醇滲漉。張氏等[4]采用80%乙醇、1%鹽酸、3%醋酸分別從龍葵中提取澳洲茄邊堿，提取率分別為0.51、0.39、0.28 mg/g。黃氏等[5]采用酸水回流提取龍葵生物堿用于體外抑瘤細胞生長實驗，在龍葵粉末中加入15倍量的2 mol/L HCl與90%乙醇1∶4（V∶V）的混合溶劑，密閉浸泡后加熱回流提取2次，每次3 h，提取液回收乙醇后濃縮至浸膏，加酸溶解后用氯仿萃取，水層調節(jié)pH值至堿性，棄去上清，收集沉淀，干燥后得到龍葵堿。以水或酸水為提取溶劑，操作簡便，成本低，但提取次數(shù)多，提取液體積大、雜質多，濃縮和后續(xù)處理較困難。

1.1.2 醇回流提取法 游離生物堿及其鹽類一般能溶于甲醇和乙醇，因甲醇毒性較大，故常用乙醇作為生物堿的提取溶劑。劉氏等[6]采用乙醇提取龍葵生物堿，分別考察了乙醇濃度、提取溫度、提取時間三因素，確定的最佳工藝條件為乙醇濃度90%、提取時間5 h、提取溫度40 ℃，提取率可達1.8%～2.7%。張氏等[4]在研究澳洲茄邊堿的提取工藝時發(fā)現(xiàn)，提取溶劑用量對提取率影響最大，回流次數(shù)影響最小，經正交試驗得到最佳提取工藝為料液比1∶20時用80%乙醇回流提取2次、每次4 h，澳洲茄邊堿的平均提取率為0.621 mg/g。該研究認為，酸水中加熱易導致澳洲茄邊堿水解，故不宜采用酸水熱浸或回流提取。唐氏等[7]用80%乙醇回流對龍葵藥材提取后，經純化用于抗腫瘤活性研究，其提取工藝為粗粉用12倍量80%乙醇回流提取2次，每次2 h，回收乙醇后調節(jié)pH=9，離心得到沉淀，經干燥后用甲醇溶解拌樣，硅膠柱分離，依次用氯仿-甲醇極性遞增梯度洗脫，當氯仿-甲醇8∶1時洗脫得粗澳洲茄邊堿，經甲醇重結晶得澳洲茄邊堿。王氏等[8]采用Box-Behnken效應面法考察了乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)等因素對龍葵總生物堿醇提工藝的影響，結果確定最佳工藝條件：乙醇體積分數(shù)63.72%，料液比1∶41.23，提取時間54.93 min，提取2次，龍葵總生物堿提取率為1.40 mg/g。

1.2 現(xiàn)代提取分離方法

隨著科技發(fā)展，一些新技術開始用于生物堿的提取，如超臨界流體萃取、生物酶法、膜分離技術、分子印跡技術等，能夠提高提取效率，降低過程能耗，保持生物堿的品質和活性。其中超聲提取、微波提取、超臨界流體提取等方法已在龍葵生物堿類化合物的提取過程中得到應用。

1.2.1 超聲提取法 超聲波提?。║E）是利用超聲波產生的高頻機械振動波在溶液體系中產生的空化作用，使植物細胞壁破壞和溶劑快速滲透，從而使細胞中的成分溶解于溶劑，實現(xiàn)固液萃取分離。UE具有時間短、效率高、節(jié)約能源等優(yōu)點，可用于熱敏性成分的提取。

欒氏等[9]采用超聲輔助提取龍葵生物總堿，在傳統(tǒng)醇提的最佳工藝基礎上，分別考察了提取時間和超聲頻率對提取效果的影響，結果采用頻率59 kHz超聲輔助提取30 min得到的生物堿收率略高于傳統(tǒng)乙醇提取。該方法所用時間短，不需另外加熱，是節(jié)能可行的提取方式。 1.2.2 微波提取法 微波提?。∕AE）是利用微波與介質的離子和偶極子分子的相互作用，促使介質轉動能力躍遷，加劇熱運動，使細胞壁破裂，胞外溶劑易于進入細胞內，溶解并釋放胞內產物。MAE具有加熱均勻、熱效率高、節(jié)能省時的優(yōu)點。劉氏等[10]研究了龍葵生物堿的MAE技術，以酸性染料比色法為分析手段，選取提取時間、提取功率及料液比等因素設計正交試驗，得到最佳提取工藝是以95%乙醇為溶劑、料液比1∶20、在585 W功率下提取8 min，并認為微波作用對龍葵總生物堿結構基本無破壞影響。么氏等[11]比較了回流、微波和超臨界二氧化碳（CO2）萃取3種方法對龍葵總生物堿的提取作用，認為最佳提取方法為MAE。但MAE受提取溶劑、提取時間、提取溫度等因素影響，選擇不同參數(shù)調節(jié)，會得到不同提取效果。

1.2.3 超臨界流體萃取法 超臨界流體是處于臨界溫度和臨界壓力以上的流體，兼有氣體和液體的雙重特性，既具有與氣體相當?shù)母邤U散系數(shù)和低黏度，又具有與液體相近的密度，對物質具有良好的溶解力，可作溶劑進行萃取分離。CO2因無色無毒、無腐蝕、化學惰性、安全價廉、高純度等優(yōu)點，是首選的清潔型工業(yè)萃取劑。么氏等[11]采用超臨界CO2流體萃取探索龍葵果總生物堿的提取工藝，以萃取溫度、壓力和時間為影響因素進行正交試驗和分析，確定最佳條件為萃取溫度50 ℃、萃取壓30 MPa、萃取時間100 min。超臨界流體萃取法具有萃取和分離的雙重作用，提取效率高，節(jié)能明顯，無有機溶劑殘留，無環(huán)境污染，但僅適于分子量較小、低極性化合物的萃取，且因其生產成本和設備投資高，故多用于實驗室研究，尚未用于工業(yè)生產。

1.2.4 柱層析法 該法是將固定相裝于柱內，流動相為液體，樣品沿豎直方向由上而下移動可達到分離提取的目的。李氏等[12]采用柱層析方法分離龍葵中的化學成分，龍葵藥粉以10倍量80%乙醇提取2次后，減壓回收乙醇，經HPD100大孔樹脂分離純化，分別用水、15%乙醇除雜，收集70%乙醇洗脫部分，回收乙醇，調pH=9，靜置離心，所得沉淀上葡聚糖凝膠LH-20純化，可得澳洲茄堿、澳洲茄邊堿純品。

2 檢測方法

2.1 酸性染料比色法

生物堿鹽與酸性染料溴甲酚綠在醋酸-醋酸鈉緩沖液中形成有色離子對化合物，可被有機溶劑定量萃取，用比色法測定該有機相溶液的吸光度，對照標準曲線可確定生物堿含量。王氏等[8]在研究龍葵總生物堿提取工藝時采用酸性染料比色法，以紫外分光光度計測定總生物堿的含量。

2.2 薄層掃描法

薄層掃描法是用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜有紫外光和可見光吸收的斑點，或經激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點進行掃描，掃描得到的圖譜及積分數(shù)據(jù)可用于藥品的鑒別、檢查和含量測定，具有分離效能高、快速、簡便等優(yōu)點。梁氏等[13]用薄層掃描法測定龍葵中茄堿的苷元澳洲茄胺的含量，樣品及對照品以苯-甲醇（10∶2）為展開劑，0.5 g/L多聚甲醛的磷酸溶液為顯色劑，于薄層掃描儀上進行測定：λS=510 nm，λR=700 nm。結果顯示，澳洲茄胺在1.965～11.79 μg呈一不通過原點的直線，采用外標兩點法定量，測得龍葵果實及全草中澳洲茄胺含量分別為1.16%、0.092 8%。

2.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）采用了梯度洗脫裝置，應用范圍廣、分離效能高、靈敏度高、分析速度快，可用于高沸點、相對分子質量大、熱穩(wěn)定性差、性質和結構類似生物堿的分離及分析，因此在龍葵生物堿類的含量檢測中應用較多[14-16]。袁氏等[17]采用HPLC測定龍葵中澳洲茄堿，采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm），以乙腈-1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長205 nm，柱溫30 ℃。結果顯示，澳洲茄堿在0.812～8.120 μg范圍內呈良好線性關系，r=0.999 8，平均加樣回收率為100.22%。羅氏等[18]采用HPLC對龍葵中澳洲茄胺的含量測定進行探索，以甲醇-酸水超聲提取龍葵生物堿，在回流條件下對生物堿苷進行酸性水解，得到澳洲茄胺，進行HPLC檢測，色譜柱為Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm），乙腈-0.05%七氟丁酸（30∶70）體系為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長210 nm。結果澳洲茄胺線性范圍在102～612 μg/mL（r=0.999 9），加樣回收率96.0%，RSD為3.35%。李氏等[19]通過HPLC測定澳洲茄胺鹽酸鹽含量，色譜柱為ZorbaxExtend-C18（250 mm×4.5 mm），乙腈-甲醇-乙酸銨為流動相（60∶35∶5），檢測波長204 nm，測定得澳洲茄胺鹽酸鹽在0.8～160 mg/L時線性關系良好，平均回收率為98.6%。李氏等[12]測定龍葵藥材澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×150 mm），流動相為乙腈-2 mmol/L Na2HPO4水溶液（39∶61），檢測波長203 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，結果澳洲茄堿在0.395～6.32 μg（r=0.999 6）線性關系良好，澳洲茄邊堿在0.40～6.40 μg（r=0.999 9）線性關系良好。

2.4 反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜法（RP-HPLC）的典型固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型流動相是甲醇和乙腈。袁氏等[20]采用RP-HPLC同時分析龍葵中3種甾體生物堿，采用Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱，以乙腈-1%磷酸為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，于205 nm波長檢測，梯度洗脫分離澳洲茄堿、澳洲茄邊堿和khasianine 3種生物堿。結果澳洲茄堿含量測定的線性范圍為0.860～10.320 μg（r=0.999 7），澳洲茄邊堿含量測定的線性范圍為0.726～8.710 μg（r=0.999 7），khasianine含量測定的線性范圍為0.696～8.352 μg（r=0.999 8），平均回收率分別為100.18%、99.08%、99.88%。表明該方法簡便快速、準確度高。

2.5 超高效液相色譜法

李氏等[21]建立澳洲茄堿、澳洲茄邊堿和khasianine超高效液相色譜同時檢測方法，采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×250 mm，1.7 μm），甲醇-0.5%乙酸水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為205 nm，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，結果3個成分依次在0.865～17.300 μg、0.730～14.600 μg、0.700～14.000 μg內線性關系良好（r=0.999 9），平均加樣回收率分別為98.86%、98.91%、98.27%，均RSD<1.50%。

3 展望

龍葵生物堿類化合物是龍葵具有生理活性的重要成分，在傳統(tǒng)提取方法的基礎上合理使用新技術輔助提取或合用，可有效改善提取及純化效果。但超臨界萃取等方法還存在分離產量低、成本高等問題，如何將一些提取新技術用到生產中去，還有許多問題有待解決。隨著含量分析測定技術的發(fā)展，多組分同時檢測逐漸成為龍葵生物堿類化合物分析領域的發(fā)展趨勢，HPLC因其高分辨率、高靈敏度、高效性、重現(xiàn)性好、適用性強等優(yōu)點，用于龍葵生物堿的分離和鑒定具有較好的優(yōu)勢。

參考文獻：

[1] YANG H， CHEN X Q， ZHAO Y， et al. Analysis of steroidal alkaloid and research of its formation and transformation in Solalum nigrum L[J]. Fine Chem，2006，23（4）：358-361.

[2] 歸小龍.龍葵堿抗腫瘤作用機制研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志， 2009，16（z1）：80-82.

[3] 周琴音.龍葵總生物堿提取方法的考察[J].當代醫(yī)學，2007，11（19）：136-138.

[4] 張巖，徐連明，陳祥，等.龍葵中澳洲茄邊堿的提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（17）：5-7.

[5] 黃越燕，朱琦峰，周燕，等.龍葵生物堿體外抑制腫瘤細胞增殖作用的實驗研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（9）：31-33.

[6] 劉穎，張燕玲，王雁.從天然植物龍葵中提取生物堿的工藝研究[J].遼寧絲綢，2003，32（2）：4-5，32.

[7] 唐朝輝，張巖，李娜，等.澳洲茄邊堿提取純化工藝及其抗腫瘤作用的研究[J].中國中藥雜志，2011，36（16）：2192-2195.

[8] 王桂玲，房建強，王克娜，等.Box-Behnken效應面法優(yōu)化龍葵中總生物堿的提取工藝[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2014，31（10）：1202-1207.

[9] 欒國顏，楊艷輝.超聲輔助乙醇提取龍葵生物總堿的研究[J].吉林化工學院學報，2010，27（4）：4-8.

[10] 劉覃，陳曉青，蔣新宇，等.微波輔助提取龍葵中總生物堿的研究[J].天然產物研究與開發(fā)，2005，17（1）：65-69.

[11] 么宏偉，謝晨陽，吳洪軍，等.龍葵果總生物堿的提取研究1）[J].中國林副特產，2013，122（1）：14-18.

[12] 李明慧，丁崗，孟兆青，等.龍葵藥材中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的含量測定[J].中國天然藥物，2007，5（5）：360-362.

[13] 粱生旺，王裕銘，張廣強.薄層掃描法測定龍葵中澳洲茄胺的含量[J].中國藥學雜志，1997，32（8）：493-494.

[14] 蔣新宇，楊輝，趙宇.龍葵中甾體類生物總堿的含量測定[J].食品科學，2006，27（8）：224-227.

[15] 袁海建，賈曉斌，陳彥，等.不同產地龍葵藥材中澳洲茄堿量的分析研究[J].中草藥，2008，39（5）：772-774.

[16] 潘愛萍.中藥龍葵的有效化學成分的色譜分析[J].佳木斯教育學院學報，2011（5）：382.

[17] 袁海建，安益強，陳彥，等.高效液相色譜法測定龍葵中澳洲茄堿的含量[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（1）：96-97.

[18] 羅習珍，陳來，劉建軍，等.高效液相色譜法測定龍葵中的澳洲茄胺[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（2）：273-274.

[19] 李立英，孫麗光，劉良.龍葵制劑中澳洲茄胺鹽酸鹽含量測定[J].東北林業(yè)大學學報，2009，37（6）：104-105.

[20] 袁海建，陳宜剛，蔡寶昌，等.反相高效液相色譜法同時分析龍葵中3種甾體生物堿[J].中國中藥雜志，2011，36（12）：1630-1632.

[21] 李志輝，孟軍華，肖暉.龍葵的質量分析研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，23（6）：661-664.

（收稿日期：2015-03-21）

（修回日期：2015-06-27；編輯：梅智勝）