袁裕鈞胡細(xì)枚宋婷尹靜茹鄭東明馬英

·論 著·

Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒免疫接種AD鼠后對(duì)腦內(nèi)BACE1的影響☆

袁裕鈞*胡細(xì)枚*宋婷*尹靜茹*鄭東明*馬英*

目的探討Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒免疫接種3月齡APPswe/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因(AD)鼠腦內(nèi)BACE1的影響。方法應(yīng)用Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒免疫3月齡APPswe/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因鼠，同等劑量的PBS免疫對(duì)照組及C57BL/6J組小鼠，各組小鼠均在免疫后2、4、6次后通過RT-PCR法檢測(cè)BACE1 mRNA水平，Western blotting法檢測(cè)BACE1/GFAP/NF-κB蛋白水平，免疫組化法觀察Aβ1-42腦內(nèi)分布情況。水迷宮檢測(cè)其行為學(xué)改變。結(jié)果在免疫2次后BACE1 mRNA表達(dá)水平C57BL/6J組＜Aβ3-10組＜對(duì)照組（F=4.649,P=0.021）；免疫4次Aβ3-10組＜C57BL/6J組＜對(duì)照組（F=115.683,P=0.001）；免疫6次C57BL/6J組＜Aβ3-10組＜對(duì)照組（F=86.600,P＜0.001）。BACE1的蛋白表達(dá)水平在免疫2、4、6次后C57BL/6J組＜Aβ3-10組＜對(duì)照組（F=432.843,P＜0.001;F= 57.673,P＜0.001;F=26.550,P=0.001),NF-κB的蛋白表達(dá)水平在免疫2次后C57BL/6J組＜Aβ3-10組＜對(duì)照組（F=109.127,P＜0.001）；免疫4,6次后Aβ3-10組＜C57BL/6J組＜對(duì)照組（F=30.301,P＜0.001；F=129.967，P＜0.001）。GFAP的蛋白表達(dá)水平在免疫2、4、6次后C57BL/6J組＜Aβ3-10組＜對(duì)照組（F=27.782,P=0.001;F= 26.132,P=0.001;F=26.450,P=0.001）；Aβ1-42在腦內(nèi)的分布C57BL/6J組＜Aβ3-10組＜對(duì)照組（皮質(zhì)：F=5.395,P= 0.021;F=47.135,P=0.000;F=25.306,P=0.000,海馬：F=11.023,P=0.002;F=14.936,P=0.001;F=50.132,P= 0.000）。總潛伏期C57BL/6J組＜Aβ3-10組＜對(duì)照組（F=8.938,P=0.016;F=5.745,P=0.04;F=7.073,P=0.017）。結(jié)論Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒可以影響腦內(nèi)BACE1的表達(dá)，影響Aβ產(chǎn)生，改善空間記憶能力。

質(zhì)粒 免疫療法 β-分泌酶（BACE1）阿爾茨海默病 β-淀粉樣蛋白

1907年，Alois Alzheimer在德國(guó)Tubingen的一次會(huì)議中首次報(bào)告1例病例，其典型臨床癥狀表現(xiàn)為記憶障礙及行為改變，病理表現(xiàn)為粟粒樣小體（淀粉樣板塊）和致密纖維束（神經(jīng)纖維纏結(jié)），多年后由Kraepelin命名為阿爾茨海默?。ˋD）[1]。AD的病理機(jī)制很復(fù)雜，病因也尚未明確，但有證據(jù)表明淀粉樣前體蛋白（APP）的異常代謝在產(chǎn)生毒性Aβ的過程中發(fā)揮重要作用。ɑ-，β-，γ-分泌酶均參與APP代謝過程，APP在生理?xiàng)l件下被ɑ-分泌酶裂解產(chǎn)生可溶性非淀粉樣神經(jīng)片段（sAPPɑ），在β-分泌酶（BACE1）、γ-分泌酶的作用下產(chǎn)生Aβ[2-3]，因此推測(cè)BACE1，γ-分泌酶是預(yù)防和治療AD的兩大主要研究靶點(diǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討經(jīng)質(zhì)粒免疫治療小鼠后是否能有效減少其腦內(nèi)BACE1表達(dá)，減少Aβ的形成及改善認(rèn)知功能。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組將3月齡鼠分別分成3組（均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部）：①Aβ3-10質(zhì)粒組：轉(zhuǎn)基因鼠，pcDNA3.1-(Aβ3-10)10-CPG 100μg（體積約100μL；②3月齡對(duì)照組：轉(zhuǎn)基因鼠，PBS（滅菌、0.01 mol/L、pH 7.4）100μL；3月齡C57BL/6J組：PBS（滅菌、0.01 mol/L、pH 7.4）100μL，（文中略寫為Aβ3-10組，對(duì)照組，C57BL/6J組）。每組15只鼠，雌性，共免疫6次，每個(gè)月免疫注射1次，部位為小鼠大腿內(nèi)側(cè)股四頭肌。每次間隔1個(gè)月[4]。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-(Aβ3-10)10-CPG的構(gòu)建由長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司完成。Aβ 3-10-cpG序列片段由南京金斯瑞合成。采用克隆位點(diǎn)HindIII和EcoRI進(jìn)行酶切，陽(yáng)性質(zhì)粒切出約300 bp左右的Aβ3-10-cpG片段帶和約5.4 kb左右的載體帶。將鑒定的陽(yáng)性菌種送長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 組織樣本取材在分別免疫2、4、6次后1個(gè)月對(duì)每組小鼠進(jìn)行檢測(cè)，麻醉小鼠后分離大腦用于進(jìn)一步檢測(cè)。

1.4 BACE1的mRNA水平檢測(cè)應(yīng)用TRI試劑（Life technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA）按照操作說明提取總RNA。以β-actin為內(nèi)參照，RT-PCR法測(cè)定BACE1mRNA相對(duì)表達(dá)量。用凝膠成像系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物電泳條帶光密度值，表達(dá)水平以待測(cè)mRNA與β-actin mRNA的光密度值之比來(lái)表示。應(yīng)用PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitro?gen，Camarillo,CA）合成cDNA的第一條鏈。應(yīng)用Taq DNA聚合酶進(jìn)一步擴(kuò)增。最后相對(duì)定量分析用2－Δct計(jì)算。

1.5 BACE1,GFAP,NF-κB蛋白水平檢測(cè)取冰凍標(biāo)本數(shù)例，裂解剪碎組織，離心后取上清，酚試劑法測(cè)濃度。加入100 μL 5XBuffer,沸水變性5 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白（每孔上樣20 μL）；濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉2 h；加入抗BACE1抗體(AB5832 EMD Millipore Corporation,Temecula, CA92590,USA，1:500)；抗GFAP抗體（ab68428 ab?cam，USA，1:1000)；抗NF-κB p65抗體112A1021（ab13594 abcam，USA，1:500）4℃過夜，加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（LOT571001100，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，1:5000)，洗膜3次后應(yīng)用Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行照相和條帶密度掃描（上海天能），應(yīng)用ImageJ（USA）軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定用于統(tǒng)計(jì)分析，目標(biāo)灰度值/內(nèi)參灰度值作為相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

1.6 檢測(cè)Aβ腦內(nèi)的分布應(yīng)用免疫組化SP法（ZA?GB-BIO，Catalog Number:70B12A）進(jìn)行組織分析。常規(guī)二甲苯脫蠟，酒精脫水后水洗5次；3%雙氧水37℃孵育10 min，PBS沖洗；抗原修復(fù)，冷卻，PBS沖洗3次；封閉；滴加單克隆抗Aβ蛋白抗體（Sigma,USA,CloneBam-10,ProductNo. A5231），4℃過夜，PBS沖洗3次；滴加生物素標(biāo)記辣根沒標(biāo)記的山羊抗兔IgG（LOT571001100，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司），37℃孵育30 min，PBS沖洗3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次；DAB顯色，沖洗；蘇木素復(fù)染，脫水，透明，干燥，中性樹膠封片，計(jì)算Aβ沉積所占面積百分比。圖像分析應(yīng)用MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)（USA）。1.7水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)是否有行為學(xué)損害，每次免疫接種結(jié)束后4周，采用Morris水迷宮恒溫游泳池（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司http:// www.6062307.com）多方面記錄并分析小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)量資料應(yīng)用單因素分析，方差齊時(shí)選用LSD方法，方差不齊時(shí)選用Dunnett T3方法比較三組間差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 pCDNA3.1（+）-Aβ3-10-cpG載體構(gòu)建與測(cè)序用HindIII和EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒，切出約300 bp左右的rno-mir124片段帶和約5.4 kb左右的載體帶，如圖1（箭頭）所示。測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒DNA為成功構(gòu)建pcDNA3.1-（Aβ3-10）10-CPG（圖2）。

2.2 水迷宮測(cè)試結(jié)果Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果如表1、2所示。經(jīng)Aβ3-10免疫治療AD小鼠可以改善其空間記憶能力。

2.3 RT-PCR法檢測(cè)BACE1 mRNA水平如圖3所示，免疫4,6次后對(duì)照組BACE1 mRNA表達(dá)均比Aβ3-10組、C57BL/6J組高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 pLVX-EN-rno-mir124酶切鑒定圖 M：2K Plus II；1：pCD?NA3.1(+)-Aβ3-10-cpG經(jīng)HindIII和EcoRI酶切結(jié)果

表1 3月齡小鼠總平均潛伏期(s)

2.4 小鼠腦內(nèi)BACE1/GFAP/NF-κB蛋白水平如圖4所示免疫2,4,6次后BACE1蛋白相對(duì)表達(dá)量在3組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=432.893，P=0.000;F= 57.673，P=0.000;F=26.550;P=0.001)，GFAP的蛋白相對(duì)表達(dá)量在3組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=27.782，P= 0.001;F=26.123，P=0.001;F=25.560;P=0.001)；NF-κB的蛋白相對(duì)表達(dá)量在3組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=109.127，P=0.001;F=30.301，P=0.001;F= 129.967,P=0.000)。

圖2 pUC57-Aβ3-10-cpG測(cè)序比對(duì)圖 Sequence 0：Aβ3-10-cpG序列；Sequence 2：pUC57-Aβ3-10-cpG.ab1序列

圖3 BACE1 mRNA水平##：C57BL/6J組與對(duì)照組比較P＜0.01; **：Aβ3-10組與對(duì)照組比較P＜0.01

2.5 免疫組化法檢測(cè)腦內(nèi)Aβ分布情況圖5為海馬及皮層區(qū)Aβ沉積情況，經(jīng)統(tǒng)計(jì)Aβ沉積所占面積百分比依次為：對(duì)照組＞Aβ3-10組＞C57BL/6J組，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

十多年前有5個(gè)研究小組經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，均發(fā)現(xiàn)一種新型具有β分泌酶活性的天冬氨酸蛋白酶，后被起名為BACE或BACE1。BACE1在組織中廣泛表達(dá)，比如在胰腺中BACE1的mRNA含量很高，但其作用是一種選擇性的剪切變異體僅能裂解少量的APP，在腦內(nèi)很多區(qū)域可以檢測(cè)到BACE1 mRNA，其中在皮層的水平最高[5]。在AD腦中，BACE1表達(dá)及活性的增加影響了Aβ的沉積，有研究證實(shí)BACE1缺乏的小鼠腦內(nèi)病理性淀粉樣沉積明顯減少[6]，這些發(fā)現(xiàn)更說明了BACE1在介導(dǎo)APP轉(zhuǎn)化成Aβ過程中所發(fā)揮的重要作用，因此這也意味著BACE1成為了治療AD的重要研究目標(biāo)[7]。

BACE1的表達(dá)水平從轉(zhuǎn)錄到翻譯受很多因素調(diào)節(jié)[8]，缺血，氧化應(yīng)激和腦創(chuàng)傷均會(huì)增加BACE1的表達(dá)和活性[9]。暴露于應(yīng)激狀態(tài)下的AD小鼠模型中可以加速Aβ沉積及tau神經(jīng)病變[10]，其中兩種基因即APP，BACE1對(duì)其影響意義重大[11-12]。而在CORDNER等[13]研究進(jìn)一步證明慢性應(yīng)激可以降低腦內(nèi)DNA的甲基化，增加BACE1的表達(dá)，因此形成一系列惡性關(guān)聯(lián)，即應(yīng)激-病理性Aβ-AD，并且他們的研究表明幼齡和老齡鼠均會(huì)出現(xiàn)此現(xiàn)象，但老齡鼠對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)更敏感。

表2 小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=15）

表3 Aβ沉積所占面積的百分比（n=15）

BACE1除了介導(dǎo)產(chǎn)生Aβ外還參與很多重要的生理過程，包括活化神經(jīng)元，參與髓鞘形成，指導(dǎo)軸索形成，活化突觸前膜和保持認(rèn)知行為[14]。BACE1的這些生理功能也是我們研制BACE1抑制劑的安全隱患[15]。有實(shí)驗(yàn)證明Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒免疫轉(zhuǎn)基因小鼠可以減少其炎癥反應(yīng)，改善小鼠空間及記憶能力，并且沒有出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)[4]。

通過文獻(xiàn)我們了解免疫療法是AD治療的新發(fā)展，而在以往的研究中大多是探索及證實(shí)質(zhì)粒免疫治療的效果，并且我們的前期工作已經(jīng)證實(shí)Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒免疫接種AD鼠后可以產(chǎn)生抗Aβ抗體并且安全有效[4]。因此本文在繼以往的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索質(zhì)粒免疫治療AD對(duì)BACE1的影響及其機(jī)制。結(jié)果顯示，經(jīng)過免疫治療后的AD小鼠其腦內(nèi)BACE1mRNA及蛋白的表達(dá)水平下降，GFAP，NF-κB的蛋白表達(dá)水平下降，Aβ沉積減少，小鼠的空間記憶能力也明顯得到改善，提示Aβ的沉積多少與BACE1，GFAP，NF-κB的表達(dá)有關(guān)。YANG等[9]報(bào)告經(jīng)質(zhì)粒免疫可以降低小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，下調(diào)BACE1的表達(dá)及活性，GU等[16]證明通過質(zhì)粒免疫可以降低NF-κB的活性從而使BACE1的表達(dá)及活性降低，減少了對(duì)APP的裂解。NF-κB是APP,BACE1，γ-分泌酶基因的轉(zhuǎn)錄因子，可以激活其活性，因此可以增加Aβ的產(chǎn)生[16]。本研究也證實(shí)經(jīng)免疫治療的AD小鼠腦內(nèi)BACE1，GFAP，NF-κB的表達(dá)均有所下降，驗(yàn)證其機(jī)制為降低BACE1的表達(dá)，減少對(duì)APP的裂解從而減少Aβ產(chǎn)生[2,6];減少炎性反應(yīng)，減少NF-κB活化，從而間接減少BACE1表達(dá)，減少Aβ產(chǎn)生[7,17]。在尸檢AD患者神經(jīng)元我們發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)纖維纏結(jié)和發(fā)育不全的神經(jīng)突觸中均有NF-κB的存在，并且NF-κB更可以被神經(jīng)元周圍斑塊的Aβ激活。因此在BACE1介導(dǎo)的Aβ產(chǎn)生過程中NF-κB途徑有著非同小可的作用[18]。

圖4 Western blotting檢測(cè)BACE1/GFAP/NF-κB蛋白表達(dá)及相對(duì)表達(dá)量 “-”表示未接受Aβ3-10免疫，“+”表示接受Aβ3-10免疫治療，“A”為C57BL/6J組，“B”為Aβ3-10組，“C”為對(duì)照組“##”表示C57BL/6J組與對(duì)照組比較P＜0.01;“**”表示Aβ3-10與對(duì)照組比較P＜0.01

圖5 小鼠海馬與皮質(zhì)中Aβ沉積情況（40×）A為Aβ3-10組，B為對(duì)照組，C為C57BL/6J組，“1”為免疫2次，“2”為免疫4次，“3”為免疫6次

綜上所述Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒對(duì)AD鼠腦內(nèi)BACE1的表達(dá)水平具有一定影響，可直接影響B(tài)ACE1的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而使Aβ產(chǎn)生減少；另一方面可降低腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，降低NF-κB水平,從而間接影響B(tài)ACE1介導(dǎo)APP的產(chǎn)生Aβ通路，減少Aβ產(chǎn)生，改善小鼠空間記憶能力。

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The effects of Aβ3-10 repeat fragment plasmid immunotherapy on the BACE1 in the AD mice.

YUAN Yu?jun,HU Ximei,SONG Ting,YING Jingru,ZHENG Dongming,MA Ying.Department of Neurology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China.Tel:024-96615-28111.

Objective To explore the effects of Aβ3-10 repeat fragment plasmid immunotherapy on BACE1 in AP?Pswe/PSEN1 double transgenic(AD)mouse brains.Method Aβ3-10 repeat fragment plasmid was used to immune 3 months APPswe/PSEN1 double transgenic mice.Equal amount of PBS was used to immune the control and C57BL/6J groups.RT-PCR method,Western blotting methods immunohistochemical method were used to detect BACE1 mRNA level,BACE1/GFAP/NF-κB protein levels and Aβ1-42distribution in the brain after 2,4 and 6 immunization injections in every group,respectively.Morris water maze was used to detect the changes of behaviors.Result After two injections, the BACE1 mRNA expression levels was,in a descent order,C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group（F=4.649, P=0.021）.After four injections,the BACE1 mRNA expression levels was,in a descent order,the Aβ3-10 group＜C57BL/6J group＜control group（F=115.683,P=0.001）;after six injections,the BACE1 mRNA expression levels was,ina descent order,the C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group(F=86.600,P＜0.001).After two,four and six injec?tions,the protein expression level of BACE1 was C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group（F=432.843,P＜0.001;F=57.673,P＜0.001;F=26.550,P=0.001）;the protein expression level of GFAP was C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group（F=27.782,P=0.001;F=26.132,P=0.001;F=26.450,P=0.001);and Aβ1-42distribution in the brain was C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group(cortex：F=5.395,P=0.021;F=47.135,P=0.000;F=25.306,P= 0.000,hippocampus：F=11.023,P=0.002;F=14.936,P=0.001;F=50.132,P=0.000).The total latent period was C57BL/6J group＜Aβ3-10 group＜control group(F=8.938,P=0.016;F=5.745,P=0.04;F=7.073,P=0.017).Conclu?sion Aβ3-10 repeat fragment plasmid immunotherapy can affect the expression level of BACE1 and Aβ production,im?proving spatial memory.

Plasmid Immunotherapy β-secretase Alzheimer disease β-amyloid protein

R742.9

A

2016-07-28）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.11.005

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* 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院（沈陽(yáng) 110004）

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