耿 倩,張淑榮,段 妍,劉 巖,孫典榮

( 1.天津農(nóng)學(xué)院,天津 300384; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510300; 3.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院, 遼寧 大連 116023 )

熒光標(biāo)記技術(shù)在增殖放流中的應(yīng)用現(xiàn)狀

耿 倩1,2,張淑榮1,段 妍3,劉 巖2,孫典榮2

( 1.天津農(nóng)學(xué)院,天津 300384; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510300; 3.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院, 遼寧 大連 116023 )

熒光標(biāo)記技術(shù)；增殖放流；熒光色素可見標(biāo)志；熒光染料標(biāo)記法

S937.3

標(biāo)志技術(shù)是用來區(qū)分不同個體或種群的常用方法。自Petersen等[1]利用標(biāo)志方法估算封閉水體中魚類的利用率及種群大小后，標(biāo)志技術(shù)在漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中得到廣泛的發(fā)展和應(yīng)用，標(biāo)記技術(shù)也不斷更新。熒光標(biāo)記技術(shù)是漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中常用標(biāo)志技術(shù)手段之一，其通過特定技術(shù)方法在標(biāo)志對象上形成熒光標(biāo)記進(jìn)而通過肉眼或借助儀器發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記，主要有將熒光物質(zhì)注入水生生物皮下形成熒光標(biāo)記和應(yīng)用熒光染料在水生生物鈣質(zhì)和骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上形成熒光標(biāo)記兩種技術(shù)方法。熒光標(biāo)記技術(shù)通常應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中體外培養(yǎng)骨組織，也用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的優(yōu)質(zhì)苗種選育。其在增殖放流應(yīng)用中，與以往標(biāo)志標(biāo)記方法相比，熒光標(biāo)記具有效果顯著、成本較低、對標(biāo)記對象傷害較小等優(yōu)點。近十幾年來，科研人員開展了熒光標(biāo)記技術(shù)的相關(guān)研究，取得了一些成果。筆者介紹了熒光標(biāo)記技術(shù)的相關(guān)方法，闡述了有關(guān)熒光標(biāo)記技術(shù)的主要成果，綜述了各類標(biāo)記方法的應(yīng)用，比較了不同標(biāo)記方法的優(yōu)缺點及標(biāo)記效果，探討了熒光標(biāo)記中存在的不足，展望了今后的研究方向，為進(jìn)一步開展增殖放流試驗研究和其他漁業(yè)水產(chǎn)研究提供理論參考。

1 熒光標(biāo)記技術(shù)

在漁業(yè)資源增殖放流試驗中熒光標(biāo)記技術(shù)主要有熒光色素可見標(biāo)志法和熒光染料標(biāo)記法兩種。其中熒光色素可見標(biāo)志法通常利用標(biāo)志槍將某種橡膠狀物質(zhì)和熒光染料組成的混合物植入標(biāo)記目標(biāo)皮下組織以形成有顏色的標(biāo)志，是內(nèi)部標(biāo)志的一種；熒光染料標(biāo)記法是將熒光染料通過投喂、浸染或注射等手段使其附著沉積于標(biāo)志目標(biāo)身體的鈣化組織如鱗片、耳石和其他硬骨組織上，以產(chǎn)生在熒光顯微鏡下可識別的熒光標(biāo)記或著色點標(biāo)記，屬化學(xué)標(biāo)記技術(shù)，也屬內(nèi)部標(biāo)記。

2 熒光標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

2.1 熒光色素可見標(biāo)志法的應(yīng)用

熒光色素可見標(biāo)志由熒光顏料和生物硅膠組成，以液態(tài)的方式注入到標(biāo)記對象后可變?yōu)楣虘B(tài)，其標(biāo)志效果與標(biāo)志時所選擇的標(biāo)志位置和標(biāo)記顏色密切相關(guān)，一般將其注入到標(biāo)記對象比較透明的部位，如魚體頭頂部、眼眶后部或背鰭和胸鰭之間，靠近胸鰭等部位，熒光的顏色通常有紅色、橙色、黃色和綠色等[2]。與傳統(tǒng)掛牌法相比較，熒光色素可見標(biāo)志法更為有效。由于熒光色素可見標(biāo)志法主要是通過漁民回收標(biāo)志目標(biāo)，因此標(biāo)志位置需要較為醒目，以提高標(biāo)記的可視性[3]。

熒光色素可見標(biāo)志方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同種類個體，依據(jù)種類、大小、標(biāo)記位置的不同，其標(biāo)志時間和保持率也不盡相同。例如在Pierson等[4]的試驗中，飼養(yǎng)標(biāo)志莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambica)110 d之后,熒光物質(zhì)保持率為78%，而試驗中草魚(Ctenopharyngodonidella)經(jīng)過238 d飼養(yǎng)之后,標(biāo)志保持率為80%。Crook等[5]在試驗中將熒光色素可見標(biāo)志注入南乳魚(Galaxiastruttaceus)魚體的前鰓蓋骨上，4 d和131 d后，標(biāo)志保持率分別為100%和92%。Close等[6]采用熒光色素可見標(biāo)志法標(biāo)志虹鱒(Oncorhynchusmykiss)1齡幼魚，主要標(biāo)志位置在眼后脂肪組織及下頜腹面，在暗處可以采用紫外燈檢測到熒光。Doupé等[7]應(yīng)用熒光色素標(biāo)記布氏棘鯛(Acanthopagrusbutcheri)的成活率高達(dá)100%，且將其注入尾鰭鰭條間的保持率最高。用熒光色素標(biāo)記虹鱒和大西洋笛鯛(Lutjanuscampechanus)，結(jié)果顯示該方法脫標(biāo)率和死亡率均較低[8-9]。

很多研究表明熒光色素可見標(biāo)志法適用于小型水生生物，并且標(biāo)志對象與未標(biāo)志對象在生長和死亡上沒有明顯不同[10]。在不同熒光色下研究這些標(biāo)志對象，橘黃色標(biāo)志在水中可見范圍為8～10 m，遠(yuǎn)大于紅色、綠色和黃色[11]。通過對紅鰭東方鲀(Fugurubripes)、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、黑鯛(Sparusmacrocephlus)、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)等不同個體研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的試驗對象標(biāo)記效果有所不同[12-14]。

2.2 熒光染料標(biāo)記法的應(yīng)用

熒光染料標(biāo)記法是將熒光染料通過投喂、浸染或注射等手段使其附著沉積于標(biāo)志目標(biāo)身體的鈣化組織(如鱗片、耳石和其他硬骨組織)上,以產(chǎn)生在熒光顯微鏡下可識別的熒光標(biāo)記或著色點標(biāo)記。使用熒光染料標(biāo)記法能在短時間內(nèi)對處于魚類生活史不同階段的受精卵、仔稚魚等實現(xiàn)大規(guī)模標(biāo)記。漁業(yè)中較常見的熒光染料種類主要有氧四環(huán)素、鹽酸四環(huán)素、鈣黃綠素、茜素紅以及茜素絡(luò)合指示劑等，這些染料已經(jīng)被證明能通過浸泡、投喂或注射等方法在標(biāo)記目標(biāo)身體的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上形成穩(wěn)定的螯合物，從而在骨組織上生成生長標(biāo)記，這種骨組織上的標(biāo)記能夠在熒光顯微鏡下被清楚地檢測和觀察，使用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記的標(biāo)志方法在漁業(yè)的相關(guān)研究中已得到越來越多的支持和應(yīng)用[15]。

熒光染料標(biāo)記法在魚類、海綿類、腕足類、棘皮類等多種水生動物中作為生長標(biāo)記的研究方法被廣泛使用。研究結(jié)果表明，該標(biāo)記方法在水生動物生長率調(diào)查、年輪和年齡鑒定以及種群區(qū)域鑒定等方面具有顯著的效果[16-23]。例如，熒光染料標(biāo)記魚類耳石，通過熒光染料的浸泡，可在耳石上產(chǎn)生明顯的化學(xué)標(biāo)記[24]。

熒光物質(zhì)會在魚類耳石、鱗片和其他硬骨組織上形成永久性標(biāo)記[25]，現(xiàn)今已有多種不同的熒光物質(zhì)被廣泛研究并使用[25-27]。不同標(biāo)記染料應(yīng)用在不同種類上，其染料用量、染色效果、染色時間和對目標(biāo)生物的影響等，均會存在較大差異。從標(biāo)記效果、標(biāo)記效率、對目標(biāo)生物的影響等方面來看，與掛牌標(biāo)志法相比，熒光染料標(biāo)記法更為有效。

在試驗研究中，鹽酸四環(huán)素作為化學(xué)染料，同時也是一種抗生素，若使用含量過高則對標(biāo)記目標(biāo)安全產(chǎn)生威脅。歐陽斌等[26]采用鹽酸四環(huán)素浸泡標(biāo)記稀有鯽(Gobiocyprisrarus)和彭澤鯽(Carassiusauratusvar. Pengze)，標(biāo)記效果良好，標(biāo)記率可達(dá)100%。付自東等[27]用熒光物質(zhì)對胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)仔、稚魚浸泡標(biāo)記試驗結(jié)果表明，鹽酸四環(huán)素溶液對仔、稚魚耳石的標(biāo)記效果很差，且150 mg/L及以上質(zhì)量濃度的浸泡液對稚魚有較高致死作用，鹽酸四環(huán)素不適于標(biāo)記該魚的耳石。許莉佳等[28]利用鹽酸四環(huán)素標(biāo)記斑馬魚(Dmiorerio)稚魚，標(biāo)記效果較好。何春林等[29]在浸泡標(biāo)記重口裂腹魚(Schizothoraxdavidi)仔魚的試驗中得出鹽酸四環(huán)素不適合標(biāo)記該魚的結(jié)論。李敏達(dá)等[30]在對翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaeformis)稚魚進(jìn)行浸泡標(biāo)記試驗中，鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度低時標(biāo)記耳石效果不明顯，并且在質(zhì)量濃度為200 mg/L及以上時試驗魚出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，稚魚死亡率隨質(zhì)量濃度增大而增加，據(jù)此，鹽酸四環(huán)素不適合用來標(biāo)記該種魚稚魚。

鈣黃綠素是熒光指示劑，主要用于絡(luò)合滴定鈣。但鈣黃綠素產(chǎn)生的背景熒光較強(qiáng)，對某些硬骨組織具有自發(fā)熒光現(xiàn)象的魚種可能其標(biāo)記檢測效果較差。許莉佳等[28]利用鈣黃綠素標(biāo)記斑馬魚稚魚，由于試驗中斑馬魚耳石自發(fā)熒光與鈣黃綠素標(biāo)記熒光相近，得出鈣黃綠素不適合標(biāo)記斑馬魚稚魚的結(jié)論。李敏達(dá)等[30]使用鈣黃綠素對翹嘴紅鲌稚魚進(jìn)行浸泡標(biāo)記試驗，結(jié)果表明用300～350 mg/L的鈣黃綠素浸泡該魚，耳石可觀察到較明顯的標(biāo)記。Moran[31]指出，鈣黃綠素浸泡標(biāo)記方法可以精確測量貝類生長情況，且不會影響貝類的存活或生長，是一種便于熒光檢測并且標(biāo)記持久的標(biāo)志方法。Purcell等[32]應(yīng)用鈣黃綠素與四環(huán)素對仿刺參(Apostichopusjaponicus)幼苗進(jìn)行浸泡標(biāo)記，在12個月后，檢測到標(biāo)記保持率為100%，并且采樣對刺參幾乎無損傷。趙鵬等[33]用鈣黃綠素標(biāo)記仿刺參體壁、觸手、管足、疣足真皮表層的骨片。綜合以上研究結(jié)果，鈣黃綠素應(yīng)用于熒光標(biāo)記中對標(biāo)記生物影響較小，標(biāo)記生物對鈣黃綠素的適應(yīng)性更強(qiáng)。

茜素紅溶液是一種化工產(chǎn)品，常用作絡(luò)合滴定指示劑和酸堿指示劑，亦可在水產(chǎn)研究中用作熒光染料。梁小雙[2]采用茜素紅浸泡標(biāo)記紅鰭笛鯛(L.erythopterus)，養(yǎng)殖60 d后，熒光標(biāo)記依然明顯可見，標(biāo)記組與空白組的存活率、體長、體質(zhì)量無顯著差異。李敏達(dá)等[30]應(yīng)用茜素紅溶液對翹嘴紅鲌稚魚進(jìn)行浸泡標(biāo)記，結(jié)果表明，150 mg/L的茜素紅溶液對稚魚耳石有良好的標(biāo)記效果，茜素紅是標(biāo)記翹嘴紅鲌早期魚苗的適宜熒光物質(zhì)。趙亞鵬等[34]利用茜素紅溶液對6日齡、20日齡及90日齡的滇池金線鲃(Sinocyclocheilusgrahami)仔稚魚進(jìn)行標(biāo)志，標(biāo)記物能在其耳石上形成深紅色標(biāo)記環(huán)帶，標(biāo)記率可達(dá)100%。王臣等[35]用茜素紅標(biāo)記大麻哈魚(Oncorhynchusketa)發(fā)眼后胚胎，經(jīng)檢測，茜素紅可在矢耳石和微耳石上都能形成良好標(biāo)記，在可見光和黃綠激光下均檢測到標(biāo)記帶，但隨著暫養(yǎng)時間的延長，可見光下標(biāo)記逐漸減弱，至80 d基本消失，而在黃綠激光下標(biāo)記區(qū)能長久保持，熒光強(qiáng)度無減弱跡象。Lagardere等[36]發(fā)現(xiàn)用高質(zhì)量濃度的茜素紅溶液可以在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)仔魚耳石上形成清晰的熒光標(biāo)記。

諸多研究也表明，用茜素絡(luò)合物形成的標(biāo)記質(zhì)量要優(yōu)于四環(huán)素[25,27，37]。采用茜素絡(luò)合物溶液對魚卵或仔魚進(jìn)行浸泡，可在耳石上形成可識別的熒光標(biāo)記，其浸泡用量常為50～400 mg/L[36,38-39]。

付自東等[27]用熒光物質(zhì)對胭脂魚仔、稚魚浸泡標(biāo)記的試驗結(jié)果表明，茜素絡(luò)合物是對胭脂魚早期魚苗進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記比較合適的熒光物質(zhì)，100～200 mg/L的茜素絡(luò)合物溶液浸泡24 h對胭脂魚仔、稚魚耳石有很好的標(biāo)記效果。歐陽斌等[26]采用茜素絡(luò)合物浸泡標(biāo)記稀有鯽和彭澤鯽魚，標(biāo)記效果良好，標(biāo)記率可達(dá)100%。何春林等[29]在浸泡標(biāo)記重口裂腹魚仔魚的試驗中，得出茜素絡(luò)合物對該魚是較合適的化學(xué)標(biāo)記熒光物質(zhì)的結(jié)論。靳建波等[40]釆用茜素絡(luò)合物浸泡標(biāo)記秦嶺細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenoktsinlingensis)發(fā)眼卵和幼魚，浸泡發(fā)眼卵的最佳質(zhì)量濃度為30 mg/L，浸泡18 h，標(biāo)記率可達(dá)100%，出膜后幼魚存活率可達(dá)91%，耳石標(biāo)記明顯；幼魚浸泡的最佳質(zhì)量濃度為120 mg/L，浸泡12 h，標(biāo)記率可達(dá)83.3%，15 d后，存活率可達(dá)92.3%，耳石標(biāo)記較明顯。郝振林等[41]用茜素配合指示劑浸泡標(biāo)記金烏賊(Sepiaesculenta)幼體，標(biāo)記金烏賊的成活率可達(dá)標(biāo)記效果明顯，標(biāo)記可用肉眼直接觀察。梁小雙[2]采用茜素配合指示劑浸泡標(biāo)記紅鰭笛鯛，養(yǎng)殖60 d后，熒光標(biāo)記依然明顯可見，標(biāo)記組魚與空白組魚的存活率、體長、體質(zhì)量無顯著差異。趙天等[42]在用茜素絡(luò)合物浸泡處理唐魚(Tanichthysalbonubes)仔魚、稚魚和成魚時，水溫28～30 ℃，浸泡時間24 h，唐魚仔、稚魚最適的茜素絡(luò)合物溶液浸泡用量為80 mg/L，唐魚成魚最適浸泡用量為150 mg/L，并且，茜素絡(luò)合物對唐魚仔稚魚魚體生長沒有明顯影響。趙亞鵬等[34]利用茜素絡(luò)合物水溶液對6日齡、20日齡及90日齡滇池金線鲃仔稚魚進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記物能在其耳石上形成深紅色標(biāo)記環(huán)帶，可以保證100%的標(biāo)記率。

以上提到的4種染料，除鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度過大會降低標(biāo)記目標(biāo)的存活率、鈣黃綠素產(chǎn)生的背景熒光較強(qiáng)外，其他3種在熒光標(biāo)記應(yīng)用中表現(xiàn)良好，對標(biāo)記目標(biāo)無明顯損害，可以保證標(biāo)記質(zhì)量，是有效的標(biāo)記方法。

3 熒光標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)缺點

在增殖放流的應(yīng)用研究中，熒光標(biāo)記技術(shù)有成本低廉、對標(biāo)記目標(biāo)傷害刺激小標(biāo)記時間長的優(yōu)點，但也有標(biāo)記不明顯、有時需用專業(yè)設(shè)備檢測、不利于回捕的缺點。

3.1 熒光色素可見標(biāo)志的優(yōu)缺點

優(yōu)點：熒光色素可見標(biāo)志法適于許多魚類和甲殼類，可用于小型水生動物(或生物幼體)的標(biāo)記；操作容易簡單，標(biāo)志明顯；標(biāo)志樣式可個體鑒定；高保留率；對存活、生長、行為影響限度小；標(biāo)志費用低；檢測直觀，發(fā)熒光時可見度大大增強(qiáng)，在夜晚用藍(lán)色發(fā)光二極管觀察標(biāo)志明顯。

缺點：熒光色素可見標(biāo)志法不具備編碼功能，一般無法使用單獨加標(biāo)；檢測難度較大，需要特殊的設(shè)備和工具；加標(biāo)于頭部的種類假如頭部失去，則標(biāo)志丟失；當(dāng)該標(biāo)志處在色素組織下方時檢測困難。

3.2 熒光染料浸泡標(biāo)記法的優(yōu)缺點

優(yōu)點：熒光染料標(biāo)記法標(biāo)記方法簡單，可用于大規(guī)模標(biāo)記，其適用范圍廣，標(biāo)記保存率高且易于被發(fā)現(xiàn)，對標(biāo)記目標(biāo)損傷較小。使用熒光物質(zhì)標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記能夠減少對標(biāo)記目標(biāo)的操作，降低脅迫和死亡率，并且該方法能夠?qū)崿F(xiàn)一次性的大規(guī)模放流標(biāo)記活動。

缺點：過高的染料浸泡用量、過長的浸泡時間等都可能對被標(biāo)記生物產(chǎn)生急性或慢性毒害作用，影響被標(biāo)記生物的生長、發(fā)育、行為，甚至?xí)斐伤劳?。并且，?biāo)記相對于體外掛牌法等常用方法可能不明顯，在應(yīng)用于標(biāo)志回捕時不易于被漁民發(fā)現(xiàn)、回收。

4 總結(jié)與展望

熒光標(biāo)記技術(shù)具有適用種類廣、標(biāo)記顯著、操作簡單、對標(biāo)記對象影響小的技術(shù)特點，尤其在生活史早期階段具有其他標(biāo)志技術(shù)所不具備的優(yōu)勢，這些特點使其能夠在水生生物標(biāo)志技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域占有一席之地，國內(nèi)外學(xué)者紛紛開展了許多與之相關(guān)的研究工作，取得了豐碩的研究成果，該技術(shù)在水生生物標(biāo)志技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊的研究應(yīng)用前景。

熒光染色標(biāo)記技術(shù)為我國引進(jìn)的標(biāo)記方法之一，該技術(shù)在漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中仍然具有很大的應(yīng)用潛力。在未來的研究中，筆者認(rèn)為，此項技術(shù)或可從以下幾個方面進(jìn)行突破：(1)改進(jìn)檢測設(shè)備，進(jìn)行研究升級使之更加小巧靈活便于攜帶，提高對標(biāo)記的識別率；(2)對標(biāo)記所用材料、方法進(jìn)行研究，提高標(biāo)記的被識別率；(3)熒光染料浸泡標(biāo)記法中所形成的熒光標(biāo)記是永久性標(biāo)記，形成的螯合物雖然對標(biāo)記目標(biāo)損傷較小，但如今食品安全問題備受關(guān)注，被標(biāo)記后的個體是否存在食品安全問題，尚未得知，亟需科研工作者進(jìn)行回答；(4)開發(fā)新型安全、穩(wěn)定、可食用染料，為漁業(yè)和增殖放流試驗中熒光標(biāo)記法提供更多的染料選擇，也應(yīng)在將來開展有關(guān)研究的考慮范圍之內(nèi)。

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ApplicationStatusofFluorescence-labeledTechniqueinStockEnhancement

GENG Qian1,2, ZHANG Shurong1,DUAN Yan3,LIU Yan2, SUN Dianrong2

( 1.Tianjin Agriculture University,Tianjin 300384,China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 3. Liaoning Ocean Fishery Science Research Institute, Dalian 116023, China )

fluorescent marking;stock enhancement;visible implant elastomer tag;fluorescein labeling method

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.021

C

0308-05

1003-1111(2016)03-

2015-11-09；

2016-01-21.

珠江及河口漁業(yè)資源評價與增殖養(yǎng)護(hù)技術(shù)研究項目(201303048);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(2015TS07)； 大亞灣增殖放流效果評估和跟蹤監(jiān)測項目(2130135020).

耿倩(1991—), 女, 碩士研究生; 研究方向:漁業(yè)資源調(diào)查與增殖放流效果評估.E-mail:gengsd@163.com. 通訊作者: 孫典榮(1973—),男,研究員;研究方向:海洋漁業(yè)資源評估與海洋生態(tài).E-mail:drsun73@163.com.