江馗語

(遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心，遼寧沈陽 110161)

豬瘟病毒四種不同抗原卵黃抗體中和效力評(píng)價(jià)

江馗語

(遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心，遼寧沈陽 110161)

本研究通過基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中高效表達(dá)了含豬瘟病毒E2基因中抗原指數(shù)較高且含有中和性抗原域的A1/A2區(qū)以及B、C區(qū)中抗原性較高、命名為tE2的重組蛋白和豬瘟病毒重復(fù)中和表位4P1重組蛋白、4P2重組蛋白，將上述3種重組蛋白和豬瘟活疫苗與白油佐劑混合乳化作為免疫原分別免疫產(chǎn)蛋雞制備抗豬瘟病毒卵黃抗體，并對(duì)抗體效價(jià)和對(duì)豬瘟病毒的中和作用進(jìn)行了檢測和初步研究。

豬瘟病毒；E2基因；表位串聯(lián)；卵黃抗體；生物學(xué)功能

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程手段表達(dá)重組蛋白作為免疫原制備卵黃抗體的方法也逐漸受到廣泛關(guān)注并取得了良好效果[1]。本研究以豬瘟病毒重復(fù)中和表位4P1重組蛋白、4P2重組蛋白，含有豬瘟病毒中和抗原區(qū)的tE2重組蛋白和豬瘟活疫苗與白油佐劑混合乳化作為免疫原分別免疫產(chǎn)蛋雞制備了均可不同程度中和豬瘟病毒的抗豬瘟病毒卵黃抗體，為豬瘟的緊急預(yù)防提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，并進(jìn)一步證明了所選中和表位能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在表位疫苗研究及有中和效力的卵黃抗體的制備上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 方法

1.1 免疫原的制備

1.1.1 豬瘟病毒重復(fù)中和表位的串聯(lián)及表達(dá) 根據(jù)文獻(xiàn)[2，3]選擇分別位于E2基因693～716和828～842氨基酸殘基位置的兩個(gè)豬瘟病毒B細(xì)胞線性中和表位（分別命名為P1、P2），對(duì) P1：CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT；P2：，QTAVSPTTLRTEVVK的編碼核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化后，所有序列合成時(shí)均連接到去除所有多克隆位點(diǎn)的克隆載體pUC57上。利用表位串聯(lián)技術(shù)獲得P1-6×His片段和P2-6×His片段。之后將串聯(lián)4次的表位基因片段4P1/4P2連接于表達(dá)載體pET-32a，轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析后用Western blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.1.2 豬瘟病毒tE2基因的克隆及表達(dá) 以豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）的總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增包含具有中和性抗原域的A1/ A2區(qū)以及B、C區(qū)一段抗原性較高的，位于E2基因754～880氨基酸殘基位置的區(qū)域，并克隆于表達(dá)載體pCold I，轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析后用Western blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.2 卵黃抗體的制備

以上述3種重組蛋白和豬瘟活疫苗與白油佐劑混合乳化分別作為免疫原免疫產(chǎn)蛋雞。將乳化好的免疫原采用胸肌分點(diǎn)注射的方法對(duì)9月齡產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行免疫，每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，共免疫三次，免疫劑量：豬瘟活疫苗，一免免疫劑量10頭份，二免10頭份，三免10頭份；tE2純化蛋白，一免免疫0.5mg，二免1.0mg，三免1.5mg；4P1純化蛋白，一免免疫0.4mg，二免0.6mg，三免0.8mg；4P2純化蛋白，一免免疫0.4mg，二免0.6mg，三免0.8mg。上述四種免疫原均免疫4只雞。二免后1周開始收集雞蛋，收至三免后4周。收集的雞蛋采用氯仿提取法提取卵黃抗體。

1.3 卵黃抗體效價(jià)檢測

用優(yōu)化后的最佳抗原包被量和二抗最佳工作濃度，采用間接ELISA方法測定各組卵黃抗體針對(duì)其包被抗原的效價(jià)。

1.4 卵黃抗體效力評(píng)價(jià)

1.4.1 體外細(xì)胞免疫熒光中和試驗(yàn) 將四種卵黃抗體濃縮3倍后和豬瘟陽性血清用雙抗處理，檢驗(yàn)無菌后，56℃，30min滅活，分別用足量與25μl豬瘟活疫苗（兔脾淋源）繁殖出的豬瘟病毒中和，之后進(jìn)行5倍稀釋，防止卵黃抗體不能完全中和豬瘟病毒，接入細(xì)胞后，病毒會(huì)大量迅速繁殖，免疫熒光觀察時(shí)出現(xiàn)大量熒光，不能判定抗體是否有中和作用。稀釋后的卵黃抗體和陽性血清與豬瘟病毒的中和液接入PK-15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陽性接毒對(duì)照。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24h及48h后取出，加入抗豬瘟弱毒苗卵黃抗體作為一抗（1：50稀釋），F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗雞IgG作為二抗（1：100稀釋），熒光顯微鏡下觀察。

1.4.2 兔體中和試驗(yàn) 8只健康的家兔平均分成4組，根據(jù)體外細(xì)胞免疫熒光中和試驗(yàn)結(jié)果，將中和豬瘟病毒效果較好的兩種卵黃抗體（抗豬瘟活疫苗卵黃抗體、抗4P1重組蛋白卵黃抗體）濃縮7倍，之后無菌處理，檢驗(yàn)無菌后取1ml濃縮后的抗體與經(jīng)滅菌生理鹽水稀釋含20RID的豬瘟兔化弱毒（原液每ml含3×105個(gè)RID）1ml等體積混合。搖勻后，置10～15℃中和1～2h（中間振搖2～3次）。中和完畢，分別注射每組2只家兔，每只耳緣靜脈注射1ml，即每只家兔攻入10RID。同時(shí)設(shè)立病毒對(duì)照組和抗體對(duì)照組。每隔6h測一次體溫，每天4次，連續(xù)一周觀察體溫情況，按《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2001）》－豬瘟活疫苗（I）中的規(guī)定判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫原鑒定

2.1.1 串聯(lián)重組蛋白的表達(dá)鑒定 經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析，表達(dá)的串聯(lián)重組蛋白4P1和4P2蛋白大小約33Ku和29Ku，均與預(yù)期大小一致。

1、3、6、7.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);2.純化后的4P1重組蛋白4.純化后的4P2重組蛋白;5.4P1純化蛋白Western blot分析8.4P2純化蛋白Western blot分析

2.1.2 tE2重組蛋白的表達(dá)鑒定 經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析，表達(dá)的tE2重組蛋白大小約18Ku，均與預(yù)期大小一致。

1、3.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);2.純化后的tE2重組蛋白4.tE2純化蛋白Western blot分析

2.2 制備的卵黃抗體效價(jià)檢測

以豬瘟活疫苗和tE2重組蛋白作為免疫原獲得的卵黃抗體用tE2重組蛋白作為包被抗原，ELISA效價(jià)最高值分別為1：1024和1：4096；以4P1重組蛋白作為免疫原獲得的卵黃抗體用4P1重組蛋白作為包被抗原，ELISA效價(jià)最高值為1：4096；以4P2重組蛋白作為免疫原獲得的卵黃抗體用4P2重組蛋白作為包被抗原，ELISA效價(jià)最高值為1：1024。

2.3 卵黃抗體效力評(píng)價(jià)

2.3.1 體外細(xì)胞免疫熒光中和試驗(yàn) 正常細(xì)胞對(duì)照無熒光，陽性接毒對(duì)照，24h和48h免疫熒光檢查均有多數(shù)熒光出現(xiàn)，豬瘟陽性血清、抗豬瘟活疫苗卵黃抗體、抗4P1重組蛋白卵黃抗體與豬瘟病毒中和后進(jìn)行5倍稀釋接入PK-15細(xì)胞，24h和48h免疫熒光檢查均無熒光出現(xiàn)?？箃E2重組蛋白卵黃抗體與豬瘟病毒中和后進(jìn)行5倍稀釋接入PK-15細(xì)胞，24h和48h免疫熒光檢查有熒光出現(xiàn)，但比陽性接毒對(duì)照的熒光數(shù)少，抗4P2重組蛋白卵黃抗體與豬瘟病毒中和后進(jìn)行5倍稀釋接入PK-15細(xì)胞，24h和48h免疫熒光檢查有熒光出現(xiàn)，但也比陽性接毒對(duì)照的熒光數(shù)少。說明抗豬瘟活疫苗卵黃抗體、抗tE2重組蛋白卵黃抗體、抗4P1重組蛋白卵黃抗體、4P2重組蛋白卵黃抗體均可不同程度中和豬瘟病毒，抗豬瘟活疫苗卵黃抗體和抗4P1重組蛋白卵黃抗體中和效果相對(duì)較好。

2.3.2 兔體中和試驗(yàn)結(jié)果 攻毒對(duì)照組的兩只家兔呈現(xiàn)典型的定型熱反應(yīng)（++）：兩只兔體溫均從攻毒后第48h開始上升，體溫最高分別可達(dá)41.5℃和41.7℃，第84h左右恢復(fù)正常體溫，期間有3次體溫升高超過1℃以上，呈現(xiàn)典型的稽留熱。豬瘟活疫苗卵黃抗體效力評(píng)價(jià)組的兩只家兔均出現(xiàn)輕熱反應(yīng)（+）：兩只兔體溫均從攻毒后第54h開始上升，體溫最高分別可達(dá)40.6℃和40.8℃，比攻毒對(duì)照組家兔的最高體溫低1℃左右，第78h左右體溫恢復(fù)正常，體溫升高比較遲緩且曲線較平滑，這表明豬瘟活疫苗卵黃抗體能夠延緩和降低兔體發(fā)熱，具有一定的保護(hù)作用。4P1串聯(lián)蛋白卵黃抗體效力評(píng)價(jià)組的一只家兔體溫正常（－），一只出現(xiàn)輕熱反應(yīng)（+）：出現(xiàn)輕熱反應(yīng)的兔體溫從攻毒后第54h開始上升，體溫最高可達(dá)40.8℃，比攻毒對(duì)照組家兔的最高體溫低1℃左右，第72h左右體溫恢復(fù)正常，體溫升高比較遲緩且曲線較平滑，這表明4P1串聯(lián)蛋白卵黃抗體也能夠延緩和降低兔體發(fā)熱，且有一只兔體溫正常，表明該抗體也具有一定的保護(hù)作用。抗體對(duì)照組兩只家兔體溫?zé)o反應(yīng)（－）：家兔體溫正常。

3 討論

卵黃抗體具有較高的免疫活性，注射后可直接提高機(jī)體抗體水平，與相應(yīng)的抗原發(fā)生快速免疫反應(yīng)，作用迅速、療效確切，可用于一些動(dòng)物傳染病的緊急預(yù)防治療。同時(shí)，卵黃抗體具有產(chǎn)量高、成本低、穩(wěn)定性高、適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢，并且在免疫、提取、純化等方面均已取得了良好進(jìn)展[4]，從而證明了卵黃抗體對(duì)豬瘟緊急預(yù)防的可行性和有效性。而目前研究制備的抗豬瘟病毒卵黃抗體均以豬瘟兔化弱毒疫苗作為免疫原，但不同廠家的疫苗質(zhì)量不一，導(dǎo)致免疫劑量難以確定，同時(shí)疫苗的制備工藝繁瑣，自己繁毒工作量大，使用過程中會(huì)存在散毒的危險(xiǎn)，不利于卵黃抗體的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。卵黃抗體的制備利用重組蛋白作為抗原，抗原的制備具有穩(wěn)定、無感染性、生產(chǎn)周期短、易制備、易純化并且易于定量等優(yōu)點(diǎn)，避免了豬瘟兔化弱毒疫苗作為免疫原的不足。

對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行分析，豬瘟活疫苗包含的豬瘟兔化弱毒全病毒具有病毒基因中所有中和性抗原區(qū)或表位，抗原也具有天然構(gòu)象。以其為抗原制備的卵黃抗體完全針對(duì)靶病毒，其對(duì)病毒的中和效果也相對(duì)較好。tE2基因中雖然包含中和表位且抗原性較高，但可能針對(duì)豬瘟病毒具有中和作用的抗原表位數(shù)量不夠，因此以tE2重組蛋白作為免疫原制備的卵黃抗體對(duì)病毒的中和能力相對(duì)較弱。重復(fù)中和表位4P1和4P2重組蛋白是將E2基因上的兩個(gè)中和表位重復(fù)串聯(lián)4次，在大腸桿菌中表達(dá)獲得的。將中和表位串聯(lián)后表達(dá)的串聯(lián)重組蛋白利用定位精確、氨基酸序列較短的抗原表位，既能夠有效地被免疫系統(tǒng)識(shí)別、遞呈，又能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答，與弱毒活疫苗和抗原區(qū)蛋白相比，它減少了疫苗和抗原區(qū)蛋白中與刺激產(chǎn)生中和抗體無關(guān)的成分，其免疫所產(chǎn)生的抗體全部直接針對(duì)靶抗原，特異性強(qiáng)，更加安全可靠。因此抗4P1重組蛋白卵黃抗體對(duì)豬瘟病毒的中和作用相對(duì)較好?？?P2重組蛋白卵黃抗體對(duì)豬瘟病毒的中和作用相對(duì)抗4P1重組蛋白卵黃抗體和抗豬瘟活疫苗卵黃抗體稍弱，可能是由于中和表位P2與全病毒的結(jié)合能力不如中和表位P1，這在蛋白純化后的Western bolt鑒定結(jié)果中可以看出。

本研究用四種不同抗原制備的抗豬瘟病毒卵黃抗體為豬瘟的緊急預(yù)防提供了候選生物制劑，可以用于生產(chǎn)實(shí)際。

[1] 劉文鑫大腸桿菌F4、F5天然菌毛及表達(dá)蛋白雞卵黃抗體的制備及初步應(yīng)用[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010．

[2] 馮瑜菲.豬水腫病大腸桿菌毒力因子雞卵黃抗體制備及Stx2e基因LAMP方法建立[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011．

[3] 田宏，吳錦燕，李雙輝，等．豬瘟重組E2蛋白的兔體免疫保護(hù)研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，（24）：225-228．