李紅偉，陳圓，范紅英

（惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007）

惠陽胡須雞中A-FABP和H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的研究

李紅偉，陳圓，范紅英

（惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007）

本研究旨在通過分析與脂肪性狀相關(guān)的A-FABP和H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性，找出優(yōu)勢基因型個體即保持胡須雞的肉質(zhì)口感又能克服生長速度慢的特點，為下一步的基因型選擇提供理論基礎(chǔ)。本實驗以惠陽胡須雞作為實驗材料，從雞血液中提取DNA，通過PCR擴增、測序等分子生物學(xué)技術(shù)分析了A-FABP和H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果表明：1）A-FABP基因發(fā)現(xiàn)了兩處堿基突變，一個在第1685堿基處由C突變T，但由于不在編碼區(qū)，沒有氨基酸的改變，而另一個在第1830堿基處缺失了G，引起編碼氨基酸的改變即缺失了D（天冬酰胺），進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。2）H-FABP基因發(fā)現(xiàn)兩個堿基突變，其中一個突變位點不在編碼區(qū)，沒有相應(yīng)氨基酸改變，而另一個在第746堿基處由A突變?yōu)镚，使得編碼的氨基酸由賴氨酸變成谷氨酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這些結(jié)果說明在惠陽胡須雞中，A-FABP和H-FABP基因存在單核苷酸多態(tài)性，為下一步的基因型選擇奠定了理論依據(jù)。

惠陽胡須雞；A-FABP；H-FABP；單核苷酸多態(tài)性

惠陽胡須雞為地方優(yōu)良肉用型品種，又被稱為三黃胡須雞、惠州雞、龍門雞、龍崗雞。體質(zhì)結(jié)實，以肉嫩骨細，皮脆味鮮與三黃胡須的外貌馳名中外，在育種、生產(chǎn)和外貿(mào)活雞市場上都具有較高的經(jīng)濟價值，但存在生長速度慢的特點。隨著人們生活水平的提高，人們越來越追求高品質(zhì)的食物，對于肉類的肉質(zhì)品質(zhì)要求也越來越高。而脂肪性狀，特別是肌間脂肪含量與肉質(zhì)口感密切相關(guān)。因此，尋找與脂肪性狀相關(guān)的分子標(biāo)記成為了家禽育種中的研究熱點。

IMF（Intramuscular Fat，肌內(nèi)脂肪）是判斷肉類品質(zhì)的一個重要指標(biāo)[1]。IMF含量影響肉質(zhì)口感，適當(dāng)?shù)靥岣逫MF含量會使這些因素得到改善，從而提高肉的品質(zhì)。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）基因和脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（A-FABP）基因是影響IMF含量的候選基因[2，3，4]。

A-FABP即脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白，主要參與細胞內(nèi)脂肪酸的攝取，并將其轉(zhuǎn)運至β-氧化場所以及甘油三酯和磷脂合成部位，并且通過調(diào)節(jié)脂肪酸濃度來調(diào)控機體內(nèi)脂類代謝的過程[5]。A-FABP定位于雞的第2號染色體，主要包括4個外顯子，分別編碼24、5 8、34和16個氨基酸[6]。通過高低脂肪資源家系，發(fā)現(xiàn)A-FABP基因的表達水平差異能顯著影響腹部脂肪沉積[7]。由于A-FABP能在肌內(nèi)脂肪細胞中沉積甘油三酯，從而增加肌內(nèi)脂肪，因此，它被作為影響肌內(nèi)脂肪含量的候選基因而加以研究[8]。IMF含量和體重密切相關(guān)，而A-FABP基因表達量與雞屠體重、全凈膛率存在顯著的正相關(guān)[9]。

H-FABP即心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白，參與脂肪酸在細胞內(nèi)的運輸，將脂肪酸從細胞膜運送到脂肪酸氧化、甘油三酯和磷脂合成的位置[7]。它在細胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，使細胞內(nèi)外保持一定的脂肪酸濃度差，促進細胞攝取脂肪酸[8]。雞的H-FABP基因定位于23號染色體上，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成[9]。H-FABP是一種脂溶性蛋白，對甘油三酯的積累和氧化以及脂肪酸在細胞內(nèi)的運輸起重要作用，當(dāng)心肌梗塞或萎縮的時候它常常作為一種生物標(biāo)記被釋放到血液循環(huán)中。正因為H-FABP能在心肌和脂肪細胞中沉積甘油三酯，從而增加IMF，因此，把它作為影響肌內(nèi)脂肪含量的候選基因加以研究。

本研究旨在通過分析與脂肪性狀相關(guān)的A-FABP和H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性，找出優(yōu)勢基因型個體即保持胡須雞的肉質(zhì)口感又能克服生長速度慢的特點。研究結(jié)果顯示惠陽胡須雞中A-FABP和H-FABP基因存在單核苷酸多態(tài)性，為下一步的基因型選擇奠定了理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 實驗材料

選用惠陽胡須雞作為實驗材料，樣品采集于惠州金種家禽發(fā)展有限公司的保育場。將血樣放入含肝素鈉的采血管，放-20℃下保存。

1.2 總DNA的提取

利用DNA提取試劑盒（北京匯天東方科技有限公司）提取總DNA，步驟如下：

1.2.1 將保存在-20℃下的血樣，放進4℃冰箱下凍融3-4個小時，待血樣融后，取出30μL到離心管，補充緩沖液BB（來自DNA提取試劑盒）至200μL；

1.2.2 加入20μL蛋白酶K（來自DNA提取試劑盒），再加入200μL結(jié)合液CB（來自DNA提取試劑盒），放置在已經(jīng)預(yù)熱到70℃的水浴鍋10分鐘；

1.2.3 冷卻后加入100μL的異丙醇，充分震蕩、混勻；

1.2.4 將混合物加入吸附柱（來自DNA提取試劑盒），13000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液；

1.2.5 加入500μL去除物IR（來自DNA提取試劑盒），12000rpm離心30秒，倒掉廢液；

1.2.6 加入500μL漂洗液WB（來自DNA提取試劑盒），12000rmp離心30秒，倒掉廢液；

1.2.7 將吸附柱放入空的收集管，13000rmp離心2分鐘盡量除去漂洗液；

1.2.8 取出吸附柱放進干凈的離心管，加入已經(jīng)在65℃預(yù)熱的洗脫緩沖液EB（來自DNA提取試劑盒），放置5分鐘，12000rmp離心1分鐘。

1.2.9 將所得的溶液重新加入離心吸附柱中，12000rmp離心1分鐘。所得的溶液就是提取的DNA。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

1.3.1 A-FABP的聚合酶鏈反應(yīng)

PCR擴增體系為25μL，包括以下成分：

Green Mix12.5μL

無菌水11.5μL，

上游引物0.25μL，

下游引物0.25μL

模板DNA0.5μL

引物序列根據(jù)文獻報道[5]，F(xiàn) 5’CCTTGTCTCATCCCATCT3’，R 5’AACTCTGCCCTCCTTATC 3’，引物由上海生物技術(shù)有限公司廣東分部合成。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.2％凝膠瓊脂糖電泳檢測。

1.3.2 H-FABP的聚合酶鏈反應(yīng)

PCR擴增體系為25μL，包括以下成分：

Green Mix12.5μL

無菌水11.5μL，

上游引物0.25μL，

下游引物0.25μL

模板DNA0.5μL

引物序列根據(jù)文獻報道[12]，F(xiàn)1 5’TGAGTACATGAAGGCGTTGG 3’，R15′CGCGCTTTCCTATTCCTA3′；F25’AGGTGCAGCATCTGAGTG3’，R25’TTCACCGTCGCCTTGT 3’，由上海生物技術(shù)有限公司廣東分部合成。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性8 min，（94℃45 s；53.2℃1 min，72℃1 min）35個循環(huán)后，72℃終延伸10 min，4℃保存。

1.4 電泳體系

用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增結(jié)果進行檢測，電泳體系如下：

瓊脂糖凝膠濃度1.2％（1.2g瓊脂糖，100ml 1× TBE，2μl Goldview染料），電泳液1×TBE（108gTris，55g硼酸，0.5M EDTA（pH8.0）40ml加蒸餾水至1000ml后稀釋10倍），6×Loading buffer 1μl與5μlPCR擴增產(chǎn)物混勻點樣，電壓100V，電泳40-60 min后，于WD-9413A凝膠成像分析儀下觀察電泳條帶。

1.5 DNA的純化

利用DNA純化試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）將PCR產(chǎn)物進行純化，其步驟如下：

1.5.1 隨機取20支PCR產(chǎn)物，分別將10支PCR產(chǎn)物混合加入一個大離心管，在大離心管中加入5倍體積的溶液A（來自DNA純化試劑盒）充分混勻。

1.5.2 加入50μL的溶液B（來自DNA純化試劑盒），震蕩搖勻。將混合液體加入離心柱，靜止2min。

1.5.3 12000 rmp離心30s。倒掉廢棄液，

1.5.4 加入500μL溶液C（來自DNA純化試劑盒），12000rmp離心30s。倒掉液體，

1.5.5 加入500μL溶液C（來自DNA純化試劑盒），12000rmp離心30s，倒棄液體。

1.5.613000 rmp離心1min，洗去乙醇。

1.5.7 將離心柱室溫敞開，靜止10min，使得乙醇揮發(fā)干凈。

1.5.8 加入已經(jīng)預(yù)熱的溶液D（來自DNA純化試劑盒）靜止2min。

1.5.912000 rmp離心2min，管底即純化后的DNA。

1.6 測序

將純化好的DNA送到廣州華大基因公司，在ABI-3T30儀器進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

惠陽胡須雞的A-FABP基因擴增結(jié)果，片段長度為268bp，結(jié)果見圖1。

圖1 A-FABP的PCR結(jié)果

惠陽胡須雞H-FABP基因擴增結(jié)果，兩對不同引物擴增片段分別為265bp、188bp，見圖2、3。

圖2 H-FABP引物1的PCR結(jié)果

圖3 H-FABP引物2的PCR的結(jié)果

2.2 A-FABP和H-FABP基因測序結(jié)果分析

將測序結(jié)果與原始序列比對可知，A-FABP基因在第1685上發(fā)生C突變?yōu)門，但不在編碼區(qū)上，不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生改變，但該基因第1830堿基處缺失了G（圖4），導(dǎo)致其翻譯后的蛋白缺少了天冬酰胺。而HFABP基因的在第746堿基處，由A突變?yōu)镚（圖5），導(dǎo)致翻譯后，賴氨酸變成了谷氨酸。

圖4 A-FABP上1830發(fā)生G的缺失

圖5 H-FABP上746發(fā)生A突變?yōu)镚

2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

2.3.1 A-FABP翻譯的蛋白質(zhì)：利用蛋白質(zhì)預(yù)測結(jié)構(gòu)網(wǎng)站http：//swissmodel.expasy.org/可以預(yù)測出AFABP無突變序列所翻譯蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（如圖6左）和突變后序列翻譯的蛋白質(zhì)（如圖6右）。突變型其中一條多肽由無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變都為β-折疊，另一條多肽由β-折疊變?yōu)槎荚谕粋€平面。另外，在無突變的蛋白質(zhì)存在β-轉(zhuǎn)角，但在突變后的翻譯的蛋白質(zhì)沒有了這個結(jié)構(gòu)。

圖6 A-FABP無突變（左）與突變型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（右）

2.3.2 H-FABP翻譯的蛋白質(zhì)：利用蛋白質(zhì)預(yù)測結(jié)構(gòu)網(wǎng)站http：//swissmodel.expasy.org/可以預(yù)測出HFABP有原始序列所翻譯蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（如圖7左）和突變后序列翻譯的蛋白質(zhì)的可見結(jié)果（如圖7右）。對比突變前后兩幅圖，可以看到在突變后一條多肽了一個β-轉(zhuǎn)角，而在另外一條多了一個α-螺旋。由此可知，第746堿基A/G的改變使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，可能影響H-FABP蛋白的功能。

圖7 H-FABP無突變（左）與突變型的蛋白質(zhì)（右）

3 討論

肌內(nèi)脂肪作為評價肉質(zhì)的一共重要指標(biāo)越來越受到重視，逐漸成為地方品種選育的關(guān)鍵性狀。然而，肌內(nèi)脂肪是一個綜合性狀，受遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境等諸多因素的影響[13，14，15]，常規(guī)選育方法的進度緩慢。所以利用分子輔助選擇手段，加快早期選育已經(jīng)越來越受到重視。在前人大量研究中，發(fā)現(xiàn)A-FABP和H-FABP可以作為脂肪沉積的候選基因。在陳繼蘭[16]的研究表明，對各品種IMF含量分析結(jié)果表明，雞腿肌IMF含量高于胸肌，AA（艾拔益加肉雞簡稱AA肉雞）肉雞和白萊航蛋雞肌內(nèi)脂肪含量顯著低于優(yōu)質(zhì)地方品種-北京油雞、矮腳雞，實驗結(jié)論與研究報道一致。在李文娟的研究中[17]H-FABP基因表達水平和IMF、屠體重存在顯著的負相關(guān)，也就是說H-FABP基因表達量減少可引起北京油雞、白萊航雞和AA肉雞的雞肌內(nèi)脂肪含量增加，這一結(jié)果與Gerbens[18]進行不同H-FABP基因型表達水平的研究結(jié)論相符。IMF含量和體重的影響密切相關(guān)，A-FABP基因表達對雞屠體重、凈膛率存在顯著的正相關(guān)。

本實驗是用惠陽胡須雞作為實驗材料，惠陽胡須雞肉質(zhì)鮮美，口感好，但是生長速度慢，影響其經(jīng)濟價值。所以本實驗旨在找出A-FABP和H-FABP的優(yōu)勢基因，為早期選種提供理論依據(jù)。在A-FABP的研究上，我們選用常國斌[5]的引物，在常國斌的研究中，發(fā)現(xiàn)了A-FABP基因外顯子3中1763位點變異，即在1763位點上G突變?yōu)锳，引起了絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?，與肌內(nèi)脂肪性狀密切相關(guān)，可作為肌內(nèi)脂肪性狀有效的候選標(biāo)記進行研究。本次研究A-FABP中，從測序結(jié)果表明，在惠陽胡須雞沒用這個突變，即在1763上還是G，我們發(fā)現(xiàn)的突變是在在1830上發(fā)生堿基G的缺失，導(dǎo)致天冬氨酸的缺失，進而影響了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。從已知的研究表明，A-FABP基因是保守的，保守的基因一般不會發(fā)生突變。所以，本次實驗發(fā)現(xiàn)的突變所引起的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這會不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變，進而影響性狀，這需要下一步實驗研究證明。在H-FABP的研究上，我們選用王彥[12]的引物，在王彥的研究中，發(fā)現(xiàn)在引物1260位點上，IMF含量AA基因型最高，AB基因型最低；在引物2675位點上，IMF含量BB基因型最高，AB基因型最低。在我們的研究中這兩個位點都沒有發(fā)生改變，在韓光的實驗[19]中推斷出，H-FABP基因可能對雞肉質(zhì)性狀具有很大的影響或與控制屠宰性能和肉質(zhì)性狀的主基因連鎖，H-FABP基因中的B等位基因可能對于肉質(zhì)性狀具有較大的影響，特別是肉質(zhì)風(fēng)味，它能夠作為分子標(biāo)記應(yīng)用在育種工作中[20]。而我們在746堿基A/G發(fā)生的突變，使得編碼的氨基酸由賴氨酸變成谷氨酸，也是沒有被發(fā)現(xiàn)過。所以本次實驗結(jié)果會對惠陽胡須雞的性狀有什么影響，需要進一步研究加以證實。

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【責(zé)任編輯：吳躍新】

Study on SNP of A-FABP and H-FABP Genes in Huiyang Bearded Chicken

LI Hong-wei，CHEN Yuan，F(xiàn)AN Hong-ying
（Department of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong China）

This study aims to analyze single nucleotide polymorphisms（SNP）of A-FABP and H-FABP genes which are associated with fat traits in order to find out the advantageous genotypes that maintain good-quality meat but also fast-growth for genotype selection in future.In this experiment，Huiyang bearded chickens were used as experimental material.DNA was extracted from the chickens’blood，followed by PCR amplification and sequencing，then single nucleotide polymorphisms of A-FABP and H-FABP genes were analyzed. Results show that:1）two base mutations were found in A-FABP gene:one in 1685 from C to T does not change the amino acid because it is not located in the coding region，but another in 1830 missing G，alter encoded amino acid that results in deleting D（asparagine），which leads to the change of spatial structure of A-FABP；2）two base mutations were found in H-FABP gene:one of them is not in the coding region，so there is no corresponding amino acid changes，and another in 746 from A to G results in lysine into glutamic，which changes the spatial structure of H-FABP.These results indicate that in Huiyang chickens，there exist single nucleotide polymorphisms of A-FABP and H-FABP genes，which will lay the theoretical foundation for genotype selection in the future.

Huiyang bearded chicken；A-FABP；H-FABP；SNP

S831.2

A

1671-5934（2016）03-0022-05

2016-04-20

廣東省普通高校特色創(chuàng)新項目（2014KTSCX178）；惠州學(xué)院博士啟動基金（156020021）

李紅偉（1972-），男，云南祿豐縣人，講師，博士，研究方向為動物遺傳育種。