陳前修，萬運強，王曉斌

（四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，四川瀘州646000）

慢性不可預(yù)見應(yīng)激大鼠模型的改進*

陳前修，萬運強，王曉斌

（四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，四川瀘州646000）

目的：對慢性不可預(yù)見應(yīng)激大鼠模型建立方法進行改進，觀察能否獲得成功率更高、行為學(xué)變化更明顯的抑郁動物模型。方法：54只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組（NC）、慢性不可預(yù)見應(yīng)激組（CUS）、改良慢性不可預(yù)見應(yīng)激組（ICUS），每組18只。NC組正常飼養(yǎng)不給予任何應(yīng)激；CUS組每天從9種應(yīng)激中隨機選取1種應(yīng)激作用于大鼠，持續(xù)6周；ICUS組在實驗前3周每天從9種應(yīng)激中隨機選取1種應(yīng)激作用于大鼠，在實驗后3周每天從9種應(yīng)激中隨機選取2種應(yīng)激作用于大鼠。實驗第5和6周結(jié)束時，行糖水偏愛實驗(SPT)、礦場實驗(OFT)、強迫游泳實驗(FST)。NC組大鼠兩次測量值均未偏離基礎(chǔ)值10%以上納入分析，CUS和ICUS組2次測量值均偏離基礎(chǔ)值10%以上納入分析。結(jié)果：NC、CUS和ICUS組最后符合條件大鼠分別為15只（83.3%），9只（50.0%）和14只（77.8%）。糖水偏愛實驗發(fā)現(xiàn)：與NC組比較，CUS和ICUS組大鼠蔗糖消耗百分比明顯降低（P＜0.01）；與CUS組比較，ICUS組大鼠蔗糖消耗百分比進一步降低（P＜0.05）。強迫游泳實驗發(fā)現(xiàn)：與NC組比較，CUS和ICUS組大鼠兩次大鼠不動時間測量值均明顯延長（P＜0.01）；與CUS組比較，ICUS組大鼠兩次大鼠不動時間測量值進一步延長（P＜0.05）。礦場實驗發(fā)現(xiàn)：CUS和ICUS組大鼠活動測量值明顯低于NC組（P＜0.01),但CUS和ICUS組大鼠橫向及縱向運動穿格數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：改良的慢性不可預(yù)見應(yīng)激大鼠模型建立方法可獲得成功率更高和行為學(xué)變化更明顯的抑郁動物模型。

改良慢性不可預(yù)見應(yīng)激；行為學(xué)測試；SD大鼠

抑郁癥已成為人們喪失社會功能的主要原因[1]。目前抑郁癥發(fā)病機制尚未完全明確，所以建立一個穩(wěn)定可靠的動物模型將對抑郁癥的研究起到重要作用。應(yīng)激是抑郁癥的主要危險因素[2]，高達80%抑郁癥患者在發(fā)病之前經(jīng)歷了應(yīng)激性生活事件[3]，故應(yīng)激動物模型常用于抑郁癥研究。現(xiàn)應(yīng)激抑郁動物模型有行為絕望模型、獲得性無助模型、慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUS）模型等，其中最常用的是慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUS）模型[4]，但目前CUS模型刺激因素存在多少不一（5～20種不等）、刺激持續(xù)時間長短不一（4～8周不等）、評定建模成功標(biāo)準(zhǔn)不一。本實驗對常規(guī)慢性不可預(yù)見應(yīng)激大鼠抑郁模型建立方法進行了改良，以期獲得成功率更高和行為學(xué)變化更明顯抑郁動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級、健康雄性SD大鼠60只，50日齡，體質(zhì)量150～200 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院動物中心提供。在室溫（24±2）℃，自然晝夜光照環(huán)境，自由飲水進食條件下飼養(yǎng)，預(yù)適應(yīng)1周后開始實驗。所有動物實驗操作均經(jīng)過瀘州醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

SD大鼠正常飼養(yǎng)l周后，測試并記錄大鼠的體重、每日進食量、糖水偏愛百分比、5 min內(nèi)的自發(fā)活動距離和不動時間等基線數(shù)據(jù)，排除基線數(shù)據(jù)明顯差異的6只大鼠，剩余的54只大鼠隨機分為3組，每組18只。正常對照（NC）組：每籠3只，不給予任何應(yīng)激，正常飼養(yǎng)；慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUS）組：每籠3只，給予慢性不可預(yù)見性應(yīng)激；改良慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（ICUS）組：每籠3只，給予改良的慢性不可預(yù)見性應(yīng)激。

1.2.2 造模方法

1.2.2.1 慢性不可預(yù)見應(yīng)激方法[5]

實驗時間為每天上午8：00～12:00，選擇簡單且易行的9種應(yīng)激方式，具體為：夾尾l min、禁水24 h、禁食24 h、41℃熱水游泳5 min、籠子傾斜45°，24 h、水平振蕩60 min(160 Hz)、4℃冰水游泳5 min、潮濕墊料（120 mL自來水）以及群養(yǎng)（9只/籠）。每天隨機選取1種刺激作用于大鼠，共刺激6周。

1.2.2.2 改良慢性不可預(yù)見應(yīng)激方法

在實驗前3周采用與慢性不可預(yù)見應(yīng)激相同的方法，從第4周開始從夾尾l min、禁水24 h、禁食24 h、41℃熱水游泳5 min、籠子傾斜45°24 h、水平振蕩60 min(160 Hz)、4℃冰水游泳5 min、潮濕墊料（120 mL自來水）、群養(yǎng)（9只/籠）這9種刺激方式中隨機選取2種刺激，被選取的2種應(yīng)激隨機分別于上午8:00～12:00及下午8:00～12:00作用于大鼠，共刺激至6周。

各組大鼠在實驗前，實驗第5和6周結(jié)束時，測定各組大鼠體重，糖水偏愛百分比，活動評分以及強迫游泳不動時間。與各組大鼠實驗前糖水偏愛百分比，活動評分以及強迫游泳不動時間的基礎(chǔ)值比較，對照組大鼠后面時間點測量值單次偏離基礎(chǔ)值10%的大鼠不納入統(tǒng)計分析，實驗組大鼠后面時間點兩次測量值均偏離基礎(chǔ)值10%以上的大鼠納入統(tǒng)計分析。

1.2.3 行為學(xué)測試

1.2.3.1 糖水消耗實驗

測定大鼠糖水偏愛百分比實驗第1 d，給予大鼠兩瓶1%的蔗糖水，讓其自由飲用；實驗第2 d，將其中1瓶糖水換成自來水；實驗第3 d，大鼠禁飲禁食24 h，然后將1%蔗糖水和自來水各一瓶（100 mL）緊靠著放置在籠子的中央讓大鼠自由飲用3 h，3 h后測量大鼠攝入蔗糖水和自來水的量，計算出攝入蔗糖水的百分比=蔗糖水量/（蔗糖水量+自來水量)× 100%。

1.2.3.2 曠場實驗

礦場實驗敞箱的長寬為100 cm、高為50 cm，底面由25個面積相等方格（20 cm×20 cm）組成。在光線稍暗，安靜環(huán)境中進行試驗。試驗前，每只動物均在敞箱內(nèi)適應(yīng)5 min。實驗后清理糞便并用酒精擦拭箱底及內(nèi)壁，排除余留氣味對下1只動物成績的影響。統(tǒng)計動物運動橫向及縱向格數(shù)。每只動物僅進行1次測定，每次5 min。

1.2.3.3 強迫游泳實驗

強制游泳實驗在水深為20 cm的玻璃圓筒(高50 cm，直徑20 cm)中進行，水溫23℃～25℃。每只動物實驗前均在玻璃圓筒內(nèi)適應(yīng)5 min，然后用毛巾吸干大鼠，再將大鼠放入圓筒中，記錄5 min內(nèi)大鼠強追游泳的累計不動時間，以秒為單位。以大鼠在水中不掙扎并將頭部保持在水面以上，或接觸筒底大于1 s作為不動標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GrphPad Prism 5.0以及SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠納入統(tǒng)計分析情況

如圖1所示，在實驗第5和6周結(jié)束時，NC組兩次測定值均小于基礎(chǔ)10%的大鼠有15只（83.3%）；CUS和ICUS兩次測定值均偏離基礎(chǔ)值10%以上的大鼠分別是9只（50.0%）和14只（77.8%）。ICUS組建模成功率明顯高于CUS組（P＜0.01）。

圖1 3組大鼠納入情況比較

2.2 各組大鼠體重變化情況

如圖2所示，ICUS、CUS組大鼠體重兩次測量均明顯低于NC組（P＜0.01)，但ICUS組與CUS組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)。

圖2 3組大鼠體重比較

2.3 各組大鼠糖水偏愛百分比

圖3 3組大鼠糖水偏愛百分比比較

如圖3所示，CUS、ICUS組大鼠蔗糖偏愛百分比兩次測量均明顯低于NC組(P＜0.01)，且ICUS組較CUS組更低(P＜0.05)。

2.4 各組大鼠強迫游泳實驗不動時間

如圖4所示，CUS、ICUS組兩次測量大鼠不動時間均明顯長于NC組(P＜0.01)，且ICUS組較CUS組不動時間更長(P＜0.05)。

圖4 3組大鼠強迫游泳不動時間比較

2.5 各組大鼠礦場實驗運動情況

如圖5和6所示，CUS、ICUS組大鼠5 min測定時間內(nèi)橫向及縱向運動穿格數(shù)明顯低于NC組（P＜0.01)，但ICUS與CUS組之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)。

圖5 3組大鼠礦場實驗橫向運動穿格數(shù)比較

圖6 3組大鼠礦場實驗縱向運動穿格數(shù)比較

3 討論

CUS方法建立抑郁動物模型是將一系列應(yīng)激以不可預(yù)見的方式作用于受試動物，持續(xù)一定時間，通過行為學(xué)檢測，判定動物是否處于抑郁狀態(tài)。其特點在于這些應(yīng)激能夠?qū)е聦嶒瀯游镄袨?、神?jīng)化學(xué)、神經(jīng)免疫學(xué)等改變，這些改變與臨床抑郁癥患者類似[6]。因此，CUS方法是一種建立抑郁動物模型的可行方案。但這種方案中存在一定局限性[7]，表現(xiàn)為刺激因素存在多少不一（5～20種不等）、刺激持續(xù)時間長短不一（4～8周不等）、評定建模成功標(biāo)準(zhǔn)不一、刺激過程中動物行為學(xué)指標(biāo)不穩(wěn)定以及抑郁模型動物成功率有待提高。另外與臨床抑郁癥患者可能經(jīng)歷多種刺激或多種刺激共同作用致抑郁癥發(fā)生不一樣[8]。因此我們按原CUS方法建立抑郁動物模型的基礎(chǔ)上進行了改良，主要差別是在較多刺激因素中選擇了簡單且易行的9種應(yīng)激方式,另外在刺激3周后由1種刺激變?yōu)?種刺激同時進行，通過對大鼠行為學(xué)評定獲得了抑郁狀態(tài)更明顯，成功率更高的抑郁動物模型。

在應(yīng)激致抑郁動物模型建立中,體重變化，糖水偏愛度，強迫游泳不動時間，礦場實驗活動情況是反映動物抑郁行為以及軀體癥狀的重要指標(biāo)。體重變化可以看作是抑郁大鼠模型量化的軀體癥狀和體征,抑郁大鼠體重降低,這與抑郁癥患者的食欲降低、消瘦相類似。我們結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUS和ICUS組大鼠體重較對照組明顯降低，但ICUS組大鼠活動性與CUS組大鼠無統(tǒng)計學(xué)差異，說明慢性不可預(yù)見刺激易致大鼠抑郁樣癥狀和體征，而改良刺激方案對大鼠抑郁樣癥狀和體征沒有進一步影響。

“快感缺失”、“無助”、“好奇缺乏”是臨床抑郁癥患者的核心癥狀，但如何判斷大鼠在慢性不可預(yù)見應(yīng)激作用下出現(xiàn)了類似臨床抑郁癥患者的行為學(xué)改變，相關(guān)研究[9-11]表明可通過糖水消耗實驗了解大鼠“快感缺失”程度、強迫游泳實驗判斷大鼠“無助”狀態(tài)、礦場實驗分析大鼠“好奇缺乏”情況。糖水消耗實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUS和ICUS組大鼠蔗糖偏嗜百分比明顯低于NC組，表明慢性不可預(yù)見刺激可導(dǎo)致大鼠“快感缺失”，進一步分析還發(fā)現(xiàn)ICUS組大鼠糖水偏嗜百分比較CUS組更低，說明改良后的刺激方案致大鼠“快感缺失”更明顯；強迫游泳實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUS和ICUS組大鼠不動時間均較對照組明顯增加，表明慢性不可預(yù)見刺激可導(dǎo)致大鼠更易處于“無助”狀態(tài)，進一步分析還發(fā)現(xiàn)ICUS組大鼠不動時間較CUS組更長，說明改良后的刺激方案更易致大鼠處于“無助”狀態(tài)。礦場實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUS和ICUS組大鼠活動性均較對照組明顯下降，表明慢性不可預(yù)見刺激易致大鼠“好奇缺乏”，但ICUS組大鼠活動性與CUS組大鼠無統(tǒng)計學(xué)差異，說明改良的刺激方案對大鼠“好奇缺乏”沒有進一步影響。以上實驗結(jié)果表明改良后的刺激方案易致更加明顯的大鼠抑郁行為學(xué)狀態(tài)。

為使實驗大鼠抑郁狀態(tài)判定更加可靠準(zhǔn)確，實驗中我們在不同時間對實驗大鼠行兩次行為學(xué)判定，采取是否偏離基礎(chǔ)值10%為納入標(biāo)準(zhǔn)（10%來源于各行為學(xué)測量中最小百分值即多次測量均數(shù)差/基線均數(shù)）。實驗結(jié)果顯示NC、CUS和ICUS組最后符合條件大鼠分別為15只（83.3%），9只（50.0%）和14只（77.8%）。ICUS組納入大鼠明顯多于CUS組，ICUS建模成功率明顯高于CUS組。這也進一步說明在我們制定研究標(biāo)準(zhǔn)下，ICUS改良方案可建立成功率更高的抑郁癥動物模型?？赡茉蚴歉牧挤桨甘拐麄€實驗過程變得更加接近臨床抑郁癥，且更好地改變大鼠適應(yīng)性。

總之，相關(guān)研究表明應(yīng)激類型、持續(xù)時間、多樣性在抑郁癥動物模型建立中起至關(guān)重要作用[12]，我們實驗結(jié)果也進一步證實選擇簡單且易實施的9種刺激，刺激時間持續(xù)6周，在刺激后3周改為兩種刺激同時進行，獲得了成功率更高，行為學(xué)變化更明顯的抑郁癥動物模型。

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（2015-10-18收稿）

Improvement of rat model induced by chronic unpredicted stress

Chen Qianxiu,Wan Yunqiang,Wang Xiaobin
Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,Luzhou 646000, Sichuan Province,China

Objective：To investigate the possibility of improving the depressive rat model induced by chronic unpredicted stress in order to obtain higher successful rate and better behavoir phenotype.Methods：Fifty-four male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control(NC),chronic unpredicted stress(CUS)，and improved chronic unpredicted stress(ICUS)group,with 18 rats in each group.Rats in NC group were normally fed and did not receive any stimulus.The rats in CUS group were randomly received one of nine stressors per day for 6 weeks,and rats in ICUS group were randomly given one of nine stressors per day in the first three weeks and two of nine stressors per day in the last three weeks.In the fifth and sixth weeks,rats were given a series of behavior tests including sucrose preference test(SPT),open field test(OFT),and forced swim test(FST).The rats were included if the value of the both tests was either less or more than 10%of baseline values in the NC or CUM/ICUM group respectively.Results:There were 15(83.3%),9(50.0%),and 14（77.8%）rats meeting the including criteria in the NC,CUS,and ICUS group,respectively.SPT indicated that the percentage of sugar consumption in the CUS and ICUS-treated rats was markedly less than those in NC group(P＜0.01),ICUS-treated rats also exhibited a significant decrease in the percentage of sugar consumption compared with CUS-treated rats(P＜0.05).FST indicated that CUS and ICUS-treated rats had a more significant increase in immobility time than that in NC-treated rats（P＜0.01),ICUS-treated rats also exhibited a significant increase in immobility time compared with CUS-treated rats（P＜0.05).OFT indicated that CUS and ICUS-treated rats had a more significant reduction in locomotor activity than that in NC-treated rats（P＜0.01).However,there was no statistical difference between CUS-and ICUS-treated rats in the OFT.Conclusion：ICUS method can build higher success rate and better behavior phenotypes in the animal model induced by chronic unpredicted stress.

Improved chronic unpredicted stress；Behavior test；SD rat

R749；R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.003

*國家自然科學(xué)基金面上項目（81271478）

陳前修（1989-），男，碩士生

王曉斌（1967-），男，教授，碩士。E-mail:wangxiaobin67@163.com