蒲霞，郭慶喜，周鵬飛，曹靈，楊成萬，孫興旺

（1四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州646000；2眉山市第三人民醫(yī)院腫瘤科；3四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科）

JAK/STAT1信號途徑在低氧誘導(dǎo)腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用*

蒲霞1，郭慶喜1，周鵬飛2，曹靈3，楊成萬1，孫興旺1

（1四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州646000；2眉山市第三人民醫(yī)院腫瘤科；3四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科）

目的：采用低氧培養(yǎng)HKC細胞株，檢測HKC STAT 1、α-SMA以及HIF-1α的動態(tài)表達，探討JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在低氧誘導(dǎo)的腎小管上皮上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。方法：將對數(shù)生長期HKC隨機分為常規(guī)培養(yǎng)組（A組），常規(guī)+Flu培養(yǎng)組（B組），低氧培養(yǎng)組（C組），低氧+Flu培養(yǎng)組（D組）4組。C組和D組采用三氣培養(yǎng)箱低氧培養(yǎng)。分別在實驗第1、3、6 d觀察細胞形態(tài)改變情況，免疫細胞化學(xué)檢測HIF-1α、α-SMA以及STAT1表達。結(jié)果：與A、B組比較，C、D組細胞生長緩慢，隨著低氧培養(yǎng)時間的延長，細胞形態(tài)變細長，呈梭形。HIF-1α在A、B組表達極低，C、D組表達顯著增強（P＜0.05），各時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從第3 d開始C組STAT1、α-SMA表達顯著高于A組（P＜0.05）。與C組相比，D組各時間點STAT1表達顯著降低（P＜0.05），α-SMA從第3 d開始表達明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：低氧可能通過JAK/STAT1信號通路誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從而促進腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

腎小管上皮細胞；EMT；STAT1；低氧；α-SMA

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是各種慢性腎病進展到終末期的共同歸路，它是衡量慢性腎臟疾病進展的重要病理指標[1]。RIF形成涉及到細胞、細胞因子和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)等多種因素，最終結(jié)局是腎間質(zhì)肌成纖維細胞(myofibroblast,MFB)大量增生和ECM的過度積聚，腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化（Epithelial-Myofiberoblast transition，EMT）是MFB主要來源之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)慢性腎病存在組織內(nèi)缺血、缺氧，其中缺氧可能為慢性腎病進行性發(fā)展的重要原因[3]。本實驗在低氧條件下培養(yǎng)人近端腎小管上皮細胞，觀察腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化并探討可能的機制。

1 材料及方法

1.1 細胞及試劑

人近端腎小管上皮細胞株(HKC)由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)院何黎黎博士惠贈。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液購于Gibco公司，HEPES和胰蛋白酶購于Sigma公司；注射用磷酸氟達拉濱（Fludarabin, Flu）（國藥準字H20059418）購于重慶萊美藥業(yè)股份有限公司；鼠抗人α-SMA單克隆抗體購于北京中杉金橋生物公司，兔抗人HIF-1α多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗人STAT1多克隆抗體購于美國Bioword公司，SP免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

采用組織貼壁法培養(yǎng)HKC細胞，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于常規(guī)培養(yǎng)箱（21% O2，5%CO2，37℃）中，每隔2 d更換培養(yǎng)液，當細胞培養(yǎng)至80%～90%融合時，用0.25%的胰酶消化傳代。實驗用第4代細胞。

1.3 低氧培養(yǎng)

采用三氣培養(yǎng)箱進行低氧培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HKC，以4×105/mL接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔體積1 mL，置于低氧條件（1%O2，5%CO2，37℃）下、低氧培養(yǎng)基（2 mmol/L HEPES，pH 7.5，5%胎牛血清的DMEM）中培養(yǎng)[4]，構(gòu)建HKC缺氧模型。

1.4 實驗分組

實驗分為常規(guī)培養(yǎng)組（A組），常規(guī)+Flu培養(yǎng)組（B組），低氧培養(yǎng)組（C組），低氧+Flu培養(yǎng)組（D組）四組，其中A組和B組為常規(guī)氧濃度培養(yǎng)組，置于普通培養(yǎng)箱（21%O2，5%CO2，37℃）培養(yǎng)；C組和D組為低氧培養(yǎng)組，置于低氧條件（1%O2，5% CO2，37℃）下培養(yǎng)。B組和D組培養(yǎng)基內(nèi)含10 nmol/L的Flu。分別于實驗開始后第1、3、6 d觀察各組細胞形態(tài)學(xué)改變情況。

1.5 細胞爬片制備

取對數(shù)生長期的HKC，調(diào)整細胞懸液濃度為4 ×105/mL按ABCD四組分別接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，各設(shè)5個復(fù)孔（內(nèi)置預(yù)先經(jīng)過多聚賴氨酸處理的蓋玻片），進行培養(yǎng)。分別于實驗開始第1、3、6 d后，取出貼附細胞的蓋玻片，PBS沖洗處理后用4%多聚甲醛固定30 min，甩干后進行免疫細胞化學(xué)染色。

1.6 免疫細胞化學(xué)檢測及結(jié)果判定

取1.5制備的細胞爬片，按照免疫組化SP試劑盒說明行STAT1、α-SMA和HIF-1α免疫細胞化學(xué)染色。同時以PBS代替一抗作陰性對照。隨機觀察選取10幀圖像，采用Image-Pro Plus 4.5（MEDIA CYBERNETICS專業(yè)圖像分析系統(tǒng)開發(fā)公司）軟件，分析每幀圖像免疫細胞化學(xué)染色表達陽性細胞的平均光密度（mean optical density，MOD）值，求得各組各時間點相應(yīng)指標表達陽性細胞的MOD值的均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧培養(yǎng)的HKC形態(tài)學(xué)改變

實驗開始后的第1天，各組細胞形態(tài)沒有明顯差異。與A組比較，C組的HKC生長緩慢。隨著培養(yǎng)時間的延長，與A組HKC典型的鋪路石狀的生長相比，B組HKC生長沒有明顯的改變；C組的HKC生長排列較為紊亂，部分細胞顯現(xiàn)出梭形生長趨勢；D組細胞形態(tài)梭形性變化趨勢降低，細胞生長排列較之C組整齊（圖1）。

2.2 HIF-1α免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果

HIF-1α陽性為HKC細胞胞核呈棕黃色。常規(guī)條件培養(yǎng)的HKC幾乎不表達HIF-1α，自低氧培養(yǎng)的第1 d起HKC HIF-1α表達明顯增高（P＜0.05）；隨著低氧培養(yǎng)時間延長，HIF-1α表達略有增高（表1、圖1）。

圖1 HKC細胞形態(tài)及免疫表型

表1 各組各時間點HIF-1α表達陽性MOD值結(jié)果（±s）

表1 各組各時間點HIF-1α表達陽性MOD值結(jié)果（±s）

注：與A組同一時間點比較，a.P＜0.05

組別A組B組C組D組第1 d 7.31±1.61 7.18±1.47 74.79±16.76a73.45±17.49a第3 d 7.79±2.01 7.26±1.02 80.46±18.80a73.30±17.39a第6 d 7.16±1.20 7.82±1.39 89.45±9.64a88.04±17.08a

2.3 α-SMA免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果

α-SMA陽性表達為胞質(zhì)中的棕黃色顆粒。A、B組細胞α-SMA表達低。C組細胞從第3 d開始α-SMA表達較A組明顯增高（P＜0.05），且隨缺氧時間延長表達增高（P＜0.05）。與C組相比，D組第1 d α-SMA表達略有降低，第3 d和第6 d α-SMA表達顯著降低（P＜0.05，見表2、圖1）。

表2 各組各時間點α-SMA表達陽性MOD值結(jié)果（±s）

表2 各組各時間點α-SMA表達陽性MOD值結(jié)果（±s）

注：與A組同一時間點比較，a.P＜0.05；與C組同一時間點比較，b.P＜0.05；與C組第1 d比較，c.P＜0.05；與C組第3 d比較，d.P＜0.05

組別A組B組C組D組第1 d 15.94±5.75 15.81±3.13 17.71±4.68 16.89±4.30第3 d 16.66±6.09 14.61±4.13 34.84±9.10ac28.41±7.33b第6 d 15.62±3.72 14.91±2.50 98.48±11.63ad62.00±8.57b

2.4 STAT1免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果

STAT1陽性表達為胞質(zhì)中的棕黃色顆粒。與A組相比，從第3 d開始B組表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第3 d起C組STAT1表達較A組明顯增高（P＜0.05），且隨缺氧時間延長呈增高趨勢；D組各時間點較C組STAT1表達明顯降低（P＜0.05）（表3、圖1）。

表3 各組各時間點STAT1表達陽性MOD值結(jié)果（±s）

表3 各組各時間點STAT1表達陽性MOD值結(jié)果（±s）

注：與A組同一時間點比較，a.P＜0.05；與C組同一時間點比較，b.P＜0.05

組別A組B組C組D組第1 d 11.83±2.28 10.28±1.56 13.31±1.75 10.71±1.77b第3 d 11.75±1.82 9.85±2.11a36.91±2.12a30.01±5.77b第6 d 12.45±1.98 9.59±1.12a45.74±4.49a37.92±4.74b

3 討論

HIF（hypoxic inducible factor，HIF）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的惟一在低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性轉(zhuǎn)錄因子。體外研究顯示，HIF-1α在供氧正常的細胞中不表達，而在低氧培養(yǎng)的細胞胞核內(nèi)的表達顯著上調(diào)[4]。本研究擬采用三氣培養(yǎng)箱構(gòu)建HKC缺氧模型，通過細胞形態(tài)觀察，免疫細胞化學(xué)檢測HIF-1α的表達情況，作為評判細胞是否處于低氧狀態(tài)的指標。本實驗在常規(guī)氧濃度培養(yǎng)HKC HIF-1α表達極低，而低氧培養(yǎng)時表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。實驗開始后的第1 d，各組細胞形態(tài)沒有明顯差異。隨著培養(yǎng)時間延長，低氧培養(yǎng)的HKC在第3天開始出現(xiàn)不規(guī)則生長的趨勢，部分細胞呈梭形，具有向MFB轉(zhuǎn)化的特征。同時，α-SMA作為HKC向MFB轉(zhuǎn)化的重要標志，在本實驗常規(guī)培養(yǎng)的HKC中表達低，而低氧培養(yǎng)的HKC第3 d起表達明顯增加（P＜0.01），且隨著缺氧時間延長，α-SMA表達逐漸增加，與Manotham等[4]的研究結(jié)果一致，表明本實驗采用三氣培養(yǎng)箱成功構(gòu)建HKC低氧轉(zhuǎn)分化模型。

JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條生長因子和細胞因子共用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，廣泛參與細胞的活化、增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過程[5-6]。JAKs蛋白家族屬于非受體型酪氨酸蛋白激酶，目前知道的有四個成員：JAK 1、JAK 2、JAK 3和TYK2。STATs是JAKs的下游底物[7]，廣泛分布于多種類型的組織和細胞，目前發(fā)現(xiàn)該家族包括STAT1～STAT4、STAT 5a、STAT 5b、STAT 6七個成員。研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT途徑在多種組織和器官（腎臟、肝臟、肺、胰腺、心臟及骨髓等）纖維化進程中都發(fā)揮重要作用[8-10]。STAT1（signal transducer and activator of transcription 1）是STAT家族發(fā)現(xiàn)的第一個成員。JAK激酶活化后催化細胞因子受體磷酸化，形成與STAT1結(jié)合的“停泊位點”（docking site）[11]。STAT1通過其SH2結(jié)構(gòu)域與活化的受體結(jié)合而發(fā)生磷酸化，磷酸化的STAT1形成同/異二聚體并進入細胞核，與相應(yīng)的靶基因啟動子區(qū)域結(jié)合而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，參與細胞生長、分化及免疫調(diào)節(jié)等生理反應(yīng)，并參與多種器官纖維化過程，研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT1通路參與博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[12]。Ma等[13]也在研究中發(fā)現(xiàn)肺纖維化組織中存在著JAK、STAT1和STAT3的過度表達。謝慶祥等[14]研究發(fā)現(xiàn)STAT1活性增強與梗阻性腎病的病理生理過程有關(guān)，特別在腎纖維化過程中發(fā)揮重要作用。氟達拉濱是一種嘌呤堿類似物，在體內(nèi)可脫去磷酸代謝為F-ara-A，并主動轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，通過抑制核酸還原酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等機制抑制DNA的合成。近年來有研究發(fā)現(xiàn)它對STAT1的表達有特異性抑制作用[15]。在本研究中，低氧濃度培養(yǎng)第3天起HKC STAT1的表達高于常規(guī)氧濃度組（P＜0.01），同時α-SMA表達水平也明顯增加。加入氟達拉濱干預(yù)后，STAT1表達水平降低，在同一時間點α-SMA表達水平也降低，這種變化可以被STAT1特異性抑制劑氟達拉濱持續(xù)抑制，推測STAT1在體外低氧誘導(dǎo)的HKC轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮了重要作用，提示JAK/STAT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與了體外低氧誘導(dǎo)的HKC轉(zhuǎn)分化過程，為缺氧在慢性腎病及腎間質(zhì)纖維化過程中的作用機制提供一定的理論依據(jù)。

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（2015-10-27收稿）

Role of JAK/STAT1 signaling pathway in hypoxia-induced tubular epithelial-mesenchymal transition

Pu Xia1,Guo Qingxi1,Zhou Pengfei2,Cao Ling3，Yang Chengwan1,Sun Xingwang1
1Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,Luzhou 646000,Sichuan Province,China;2Department of Oncology,the Meishang Third People，s Hospital；3Department of Nephrology,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University

Objective：To observe the expression of HIF-1α、α-SMA,and STAT1 in the human kidney proximal epithelial cell(HKC)under the condition of hypoxia and to investigate the effect of JAK/STAT signaling pathway on EMT induced by hypoxia.Methods：Use a tri-gas incubator to build the model of EMT induced by hypoxia.The cells in exponential phase were divided into four groups randomly.They are routine culture(group A),routine culture+Flu(group B),hypoxia culture(group C),and hypoxia culture+Flu(group D).The morphology of cells weas observed under microscope and the expression of α-SMA,STAT1 and HIF-1α was evaluated by immunohistochemistry on day 1,3,and 6.Results：Cells grow slower in groups C and D compared to groups A and B under hypoxia.As time goes by,cells under hypoxia become heterogeneous in morphology,showing spindle-shaped.The expression of HIF-1α is increased in group C and group D compared to cells cultured in routine incubator in groups A and B,which hardly express HIF-1 α.Compared with the group A,cells in group C express much more STAT1 and α-SMA(P＜0.05)on day 3 and 6.Compared with the group C,cells in group D express lower levels of STAT1(P＜0.05)and α-SMA(P＜0.05)at each time point on day 3 and 6.Conclusion：The JAK/STAT1 signaling pathway may participate in the process of EMT of HKC induced by hypoxia and thus play an important role in the process of renal interstitial fibrosis.

HKC;EMT;STAT1;Hypoxia;α-SMA

R692.6；R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.005

四川省科技廳重點項目(2010JY0080)]

蒲霞（1979-），女，講師，碩士

孫興旺（1965-），男，教授。E-mail:lzsunxw@163.com