張 慧, 房驗(yàn)茹, 齊 悅

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院, 黑龍江 牡丹江 157000)

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超聲波輔助雙酶法提取假酸漿總黃酮及抑菌性檢測(cè)

張 慧, 房驗(yàn)茹, 齊 悅

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院, 黑龍江 牡丹江 157000)

采用超聲波-雙酶法提取假酸漿中總黃酮,考察纖維素酶和果膠酶共同作用時(shí)酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值以及酶用量對(duì)假酸漿中總黃酮提取的影響,考察假酸漿黃酮對(duì)幾種病菌的抑制作用。結(jié)果表明:超聲波輔助雙酶法提取假酸漿黃酮的最佳工藝條件是:pH值4.6、酶解溫度55 ℃、加酶比(果膠酶:纖維素酶)3∶1、酶解時(shí)間70 min,此條件下假酸漿中總黃酮的提取率是5.63% 。假酸漿中總黃酮對(duì)大腸桿菌、青霉菌、沙門(mén)氏菌、和枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用,最低抑菌濃度分別為:1.25、2.5、2.5、5 mg/mL。

假酸漿; 黃酮; 超聲波-雙酶法; 抑菌活性

假酸漿是一種一年生草本植物,原產(chǎn)于秘魯,現(xiàn)大面積栽培于我國(guó)云南、廣西等地,具有種植成活率高,收益高等優(yōu)點(diǎn)。假酸漿可作藥用植物使用,具有鎮(zhèn)靜、止咳、消炎,解毒等功效。假酸漿中黃酮類(lèi)化合物是一種重要的生物活性物質(zhì),具有抑菌性、抗氧化性和抗癌等功效,并且具有降血壓和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞效應(yīng)等多種保健功能,因此研究假酸漿總黃酮具有重要現(xiàn)實(shí)意義[1-3]。

植物黃酮的提取方法有水浸法、雙水相法、滲透法、超聲波提取法和酶法等,超聲波能在提取液中產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)和空化作用,可以破壞植物細(xì)胞壁,有助于細(xì)胞內(nèi)黃酮類(lèi)化合物溶出和擴(kuò)散,超聲波法具有提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),但提取率不高[4-5]。酶解法的作用機(jī)理是使用生物酶促使提取液中物質(zhì)發(fā)生酶解反應(yīng),破壞植物組織細(xì)胞,提高提取效率。采用單一酶法提取的反應(yīng)條件溫和,不需要高溫、高壓等特殊條件,操作方便,但提取效率不高,提取物中含有雜質(zhì)。而采用復(fù)合酶法則能同時(shí)除去原料中的蛋白質(zhì)、淀粉等多種干擾成分,提高提取效率[6-8]。本文以假酸漿總黃酮提取率為指標(biāo),采用超聲波輔助雙酶法提取假酸漿中總黃酮,確定最佳提取條件,并測(cè)定其抑菌活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為假酸漿黃酮化合物及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

假酸漿(景東銀生農(nóng)副產(chǎn)品有限公司);蘆丁(上?；瘜W(xué)試劑公司); 纖維素酶 果膠酶纖(杰諾生物酶制劑公司);硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純。大腸桿菌、青霉菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);SHB-Ⅱ循環(huán)水真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);SHA-C水浴恒溫震蕩器(上海醫(yī)療器械五廠);MP-200A型電光分析天平(上海第二天平儀器廠);DGH-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);SWQ-IA智能數(shù)字恒溫控制器(南京桑力電子設(shè)備廠);超聲波清洗器(KQ2200DB)。

1.3 方 法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]

準(zhǔn)確稱取蘆丁對(duì)照品5.0 mg,用70 %乙醇溶解,定容于50 mL容量瓶,搖勻備用。分別移取上述對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL于8只10 mL的容量瓶中,分別加入1 mL 1 % AlCl3溶液,再加70%乙醇定容至刻度,搖勻,靜置10 min,用紫外分光光度計(jì),在420 nm處測(cè)吸光度。

1.3.2 超聲波輔助雙酶法提取假酸漿總黃酮單因素實(shí)驗(yàn)

以假酸漿總黃酮提取率為考察指標(biāo),準(zhǔn)確稱取粉碎后的假酸漿樣品4.0 g,按料液比1∶25加入50%乙醇,使用超聲波清洗器超聲作用超聲功率120 W、超聲時(shí)間25 min,停止超聲。按照1∶1加入果膠酶、纖維素酶,酶解時(shí)間40 min,分別考察pH值(3.8、4.2、4.6、5.0、5.4)、酶解溫度(40、45、50、55、60)、加酶比m(果膠酶)∶m(纖維素酶)(1∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1)、酶解時(shí)間(30、40、50、60、70 min)、4個(gè)單因素對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.3.3 超聲波輔助雙酶法提取假酸漿總黃酮的最佳條件

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 假酸漿中總黃酮的抑菌性測(cè)定

1.3.4.1菌種的活化和菌懸液的制備

分別將大腸桿菌、青霉菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h活化稀釋,用滅菌移液管吸取0.1 mL滅菌生理鹽水,分別將四種菌液稀釋為0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷岫鹊膽覞嵋簜溆肹10]。將黃酮粗提液分別配制成質(zhì)量濃度0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL的溶液,另取一組不加黃酮溶液為對(duì)照,過(guò)濾除菌,備用。

1.3.4.2 抑菌圈直徑的測(cè)定

在超凈工作臺(tái)上,將0.5 mL菌懸液分別均勻涂布在固體瓊脂平板上,再用無(wú)菌鑷子夾取經(jīng)過(guò)假酸漿黃酮提取液浸泡30 min的濾紙片,將其按一定距離平鋪在在每個(gè)平皿中,重復(fù)3次。至于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察假酸漿黃酮的抑菌效果,并用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑,取平均值。

1.3.4.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

將質(zhì)量濃度0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL假酸漿黃酮類(lèi)化合物供試液,分別加入到已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中混勻,配制成含黃酮質(zhì)量濃度的分別為0.312、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL系列培養(yǎng)基。用移液槍分別點(diǎn)種供試菌液10 uL,菌液干后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低藥物質(zhì)量濃度為該黃酮液對(duì)檢測(cè)菌的MIC。每組三個(gè)平行樣,以不含黃酮的培養(yǎng)基作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

按1.3.1節(jié)方法測(cè)定其吸光度Y=18.862x-0.003 4(r=0.999) 。式中Y為吸光度值,x為被測(cè)樣品中黃酮含量,相關(guān)系數(shù)(r=0.999)。

式中:提取率以1g假酸漿提取總黃酮的毫克數(shù)表示,單位為mg/g;C為質(zhì)量濃度/(mg/mL);V為濾液定容體積 /mL;m為使用假酸漿的質(zhì)量/g。

2.2 超聲波輔助雙酶法提取假酸漿總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 pH值對(duì)假酸漿總黃酮提取率的影響

圖1表明,隨著pH值的增大總黃酮的提取率增大,當(dāng)pH4.6時(shí)提取率達(dá)到最大,其原因是復(fù)合酶發(fā)揮最大活性,破壞細(xì)胞壁,降低傳質(zhì)阻力,使得總黃酮的溶出效率達(dá)到最大值[11-13]。但是pH值達(dá)到4.6以后提取率逐漸降低,這是由于纖維素酶在趨于堿性環(huán)境中酶活性會(huì)逐漸降低并失活,因此酶解最適pH值為4.6。

2.2.2 酶解溫度對(duì)假酸漿總黃酮提取率的影響

圖2表明,酶解溫度在40～60 ℃之間時(shí),起初假酸漿總黃酮的提取率隨著溫度升高不斷增加,當(dāng)酶解溫度達(dá)到55 ℃時(shí)提取率最高,之后隨著酶解溫度升高提取率呈下降趨勢(shì)。其原因是酶解溫度較低時(shí),復(fù)合酶活力較低,提取率較低;當(dāng)酶解溫度超過(guò)55 ℃時(shí),復(fù)合酶生物活性破壞,酶活力減弱提取率降低。

圖2 酶解溫度對(duì)假酸漿總黃酮提取率的影響

2.2.3 加酶比對(duì)假酸漿總黃酮提取率的影響

圖3表明,隨著加酶比(果膠酶:纖維素酶)的增加,假酸漿總黃酮提取率逐漸增加,加酶比為2.5∶1時(shí),總黃酮的提取率達(dá)到最高,其原因是假酸漿細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與果膠酶、纖維素酶2種酶共同作用時(shí)呈適應(yīng)性。后隨著加酶比增大提取率反而降低,這是由于酶解產(chǎn)物的生成對(duì)酶解反應(yīng)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[14-15]。因此最佳酶解比(果膠酶:纖維素酶)為2.5∶1。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)假酸漿總黃酮提取率的影響

圖4表明,假酸漿總黃酮在纖維素酶和果膠酶共同作用時(shí),提取率隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)總黃酮提取率迅速增加,其原因是隨著時(shí)間的延長(zhǎng),酶活性得到充分利用,酶解反應(yīng)進(jìn)行得較完全,但提取時(shí)間超過(guò)50 min后提取率增加緩慢,其原因可能是產(chǎn)物的積累抑制了酶的活性[16-17]。因此本實(shí)驗(yàn)選用時(shí)間為50 min。

圖3 加酶比對(duì)假酸漿總黃酮提取率的影響

圖4 不同酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2.5 超聲波輔助雙酶法提取假酸漿總黃酮的正交試驗(yàn)及結(jié)果

由表正交試驗(yàn)極差結(jié)果表明:各因素對(duì)假酸漿總黃酮提取率的影響的主次順序依次為,pH>酶解比>酶解溫度>酶解時(shí)間,得到的最佳提取條件為A2B2C3D3即pH值為4.6、酶解溫度55 ℃ 、酶解比3∶1、酶解時(shí)間70 min。在此條件下,進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),得到假酸漿總黃酮提取率為5.63%。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 假酸漿總黃酮的抑菌性結(jié)果

2.3.1 假酸漿總黃酮化合物抑菌圈直徑的測(cè)定

按1.3.4.2方法測(cè)定抑菌圈大小,假酸漿總黃酮對(duì)大腸桿菌、青霉菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑見(jiàn)表3,由表3可以看出假酸漿總黃酮表現(xiàn)出良好的抑菌活性。

表3 假酸漿總黃酮抑菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注:表中數(shù)據(jù)為3次平行試驗(yàn)的平均值:“—”表示無(wú)抑菌效果。

2.3.2 假酸漿中總黃酮化合物最低抑菌濃度(MIC)

按照1.3.4.3方法,測(cè)定假酸漿總黃酮化合物的最小抑菌濃度(MIC)其結(jié)果見(jiàn)表4所示。由表4可知對(duì)大腸桿菌、青霉菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為1.25、2.5、2.5、5 mg/mL。相同條件下,假酸漿總黃酮對(duì)同一菌種的抑制程度與黃酮的濃度呈正相關(guān)。

表4 假酸漿總黃酮對(duì)供試菌MIC值測(cè)定

注:-表示無(wú)菌生長(zhǎng):+表示細(xì)菌生長(zhǎng):++表示大量細(xì)菌生長(zhǎng)。

3 結(jié) 論

結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),對(duì)假酸漿總黃酮提取率進(jìn)行分析得到最佳提取條件為:酶解溫度55 ℃、pH值4.6、酶解時(shí)間70 min、 加酶比(果膠酶:纖維素酶 )3∶1,在此條件下總黃酮提取率為5.63%。

假酸漿總黃酮對(duì)供試菌的抑制作用存在一定差異,對(duì)大腸桿菌、青霉菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為13.16、10.62、10.52、14.6 mm,抑制效果分別為沙門(mén)氏菌<青霉菌<大腸桿菌<枯草芽孢桿菌。

假酸漿總黃酮對(duì)大腸桿菌、青霉菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為1.25、2.5、2.5、5 mg/mL。 因此從假酸漿中提取總黃酮,可應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等方面,具有良好的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

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Total flavonoids of nicandra physaloides extraction by ultrasonic-assistant double-enzymatic method and bacteriostatic test

ZHANGHui,FANGYanru,QIYue

(College of Public Health, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157000, China)

To extract total flavonoids by ultrasonic-double-enzumatic method, using nicandra physaloides as raw material, we investigated the effect of enzymolysis time, enzymolysis temperature, pH value and enzyme dosage on total flavonoids of nicandra physaloides extraction, together with combined effect of cellulase and pectinase. Also, the inhibition of some germs by flavonoids of nicandra physaloides was investigated in details. The results show that, the optimum technological conditions for flavonoids of nicandra physaloides extraction by ultrasonic-double-enzumatic method are as follows :enzymolysis temperature 55 ℃, pH value4.6, enzymolysis time70 min, enzyme ratio (pectinase: cellulase) 3∶1, and the extraction ratio of the total flavonoids of nicandra physaloides under the conditions is 5.63%. The total flavonoids of nicandra physaloides have obvious inhibition on escherichia coli, penicillium, salmonella and bacillus subtilis In additon, the minimal inhibitory concentrations are 1.25,2.5,2.5,5 mg/mL respectively.

nicandra physaloides; flavonoids; ultrasonic-double-enzumatic method; bacteriostatic activity

2015-06-30。

黑龍江省科技廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(B2009-4)。

張 慧(1989-),女,黑龍江牡丹江人,牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)師,碩士。

1673-5862(2016)01-0078-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.01.018