張澤蕙，張佩，章躍陵

（汕頭大學理學院生物學系，廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣東汕頭515063）

血藍蛋白免疫學功能、分子基礎(chǔ)與應(yīng)用新進展

張澤蕙，張佩，章躍陵

（汕頭大學理學院生物學系，廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣東汕頭515063）

一般認為，血藍蛋白是節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴中的一種含銅呼吸蛋白.但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)血藍蛋白還是對蝦等無脊椎動物中的一種多功能免疫因子.本文對近年來國內(nèi)外學者在血藍蛋白免疫學活性、功能多樣性分子基礎(chǔ)及其應(yīng)用前景等方面的研究新進展進行概述，為揭示血藍蛋白在無脊椎動物免疫防御中的作用和地位奠定基礎(chǔ).

血藍蛋白；免疫學活性；功能多樣性分子基礎(chǔ)；應(yīng)用前景

0　引言

血藍蛋白是位于節(jié)肢動物（螯肢類、甲殼類、多足類和蜘蛛類）和軟體動物（腹足類和頭足類）血淋巴中的含銅呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧狀態(tài)為藍色[1-2].節(jié)肢動物門血藍蛋白一般由2-8個不同的單體組成，每個單體（由一條多肽鏈構(gòu)成）含有630-660個氨基酸殘基，分子質(zhì)量約為70-80 kDa，6個單體在四級結(jié)構(gòu)上聯(lián)合組成3-3六聚體，或以六聚體為單位再組成復(fù)合六聚體（更復(fù)雜的球形）[3].而軟體動物血藍蛋白由7-8個在大小上約為50 kDa的相似的功能單位組成，分子量為350-450 kDa，其四級結(jié)構(gòu)為中凹的圓柱體的十聚體、二十聚體或多聚體[4].一般認為，血藍蛋白的主要生物學功能與機體內(nèi)的輸氧有關(guān)，但近年來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其不僅具有輸氧功能，而且還與能量的貯存、滲透壓的維持、蛻皮過程的調(diào)節(jié)以及表皮的固化有關(guān)[5-6].更為重要的是，血藍蛋白還可通過多種方式參與機體免疫防御，被認為是蝦蟹等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中的一種重要的多功能免疫因子，引起國內(nèi)外學者的高度關(guān)注[7-8].因此，積極研究其免疫學活性、功能多樣性分子基礎(chǔ)及其應(yīng)用前景，對闡明對蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫防御機制，尋找其新的病害防控和良種選育策略等具有重要參考價值.

1　血藍蛋白免疫學功能

1.1酚氧化酶活性

自德國學者Decker等[9]1998年首次報道狼蛛（Eurypelma californicum）血藍蛋白具有酚氧化酶活性以來，血藍蛋白酚氧化酶活性的研究受到國內(nèi)外免疫學工作者的高度關(guān)注，近年各國學者相繼發(fā)現(xiàn)多種血藍蛋白在不同激活劑作用下同樣具有酚氧化酶活性.Guo等[10]發(fā)現(xiàn)軟體動物羅曼蝸牛（Helix pomatia）、烏賊（Sepia officinalis）和釘螺（Schistosoma japonicum）血藍蛋白經(jīng)α-糜蛋白酶的作用后可表現(xiàn)出O-雙酚氧化酶活性.Perdomo等[11-12]報道，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和SDS可誘導(dǎo)眼斑龍蝦（Panulirus argus）血藍蛋白表現(xiàn)出酚氧化酶活性.Kim等[13]研究表明，北海道毛蟹（Erimacrus isenbeckii）體內(nèi)血藍蛋白在低溫的條件下（2.4-3.4℃），經(jīng)SDS、脂多糖、磷壁酸等誘導(dǎo)下也可發(fā)揮酚氧化酶活性.在此基礎(chǔ)之上，Baird等[14]進一步證實，SDS誘導(dǎo)血藍蛋白發(fā)揮酚氧化酶活性的機制可能為：SDS通過其膠束形式誘導(dǎo)血藍蛋白改變其最佳構(gòu)象，從而為酚氧化酶底物打開一條通往催化中心的通道.有趣的是，Coates等[15]發(fā)現(xiàn)美洲鱟（Limulus polyphemus）體內(nèi)的磷脂酰絲氨酸與SDS體外誘導(dǎo)血藍蛋白發(fā)揮酚氧化酶活性的機制類似，其在體內(nèi)同樣可激活血藍蛋白表現(xiàn)為酚氧化酶活性.

此外，學者們還發(fā)現(xiàn)血藍蛋白亞基在一定條件下也可表現(xiàn)出酚氧化酶活性.Fujieda等[16]發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血藍蛋白5個單體均具有微弱的單酚氧化酶活性，且加入3M尿素后，其催化活性還可顯著提高.Dolashki等[17]發(fā)現(xiàn)軟體動物脈紅螺（Rapanavenosa）血藍蛋白功能亞基RvH1-a經(jīng)SDS、胰蛋白酶以及尿素等處理后，可發(fā)揮一定的雙酚氧化酶活性.

1.2抗病毒活性

Zhang等[18]率先報道節(jié)肢動物斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）血藍蛋白對石斑魚虹彩病毒（Singapore Grouper Iridovirus，SGIV）、蛙病毒3（Frog Virus 3，F(xiàn)V3）、淋巴囊腫病病毒（Lymphocyctis Virus，LDV）等6種病毒具有抗病毒活性.隨后，Lei等[19]發(fā)現(xiàn)日本對蝦（Penaeus japonicus）血藍蛋白對白斑綜合癥病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）同樣具有抗病毒活性，尤其是發(fā)現(xiàn)其2個亞基PjHcL和PjHcY在抵抗WSSV方面存在明顯差異，當對蝦受到WSSV感染時，PjHcL亞基mRNA表達水平顯著上升，而PjHcY亞基變化較小.進一步研究顯示，該兩個亞基抗病毒功能上的差異可能與其第3功能區(qū)上的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)差異有關(guān).

隨后，人們發(fā)現(xiàn)不僅節(jié)肢動物血藍蛋白具有抗病毒活性，軟體動物血藍蛋白同樣具有抗病毒活性.Nesterova等[20]和Zagorodnya等[21]分別報道軟體動物脈紅螺、亮大蝸牛（Helix Lucorum）血藍蛋白具有抗皰疹病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）活性.Dolashka等[22-23]發(fā)現(xiàn)脈紅螺血藍蛋白糖基化亞基RvH-c具有抗呼吸道合胞體病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）活性，而非糖基化亞基RvH-b不具備此活性.在此基礎(chǔ)之上，進一步發(fā)現(xiàn)其另一個亞基RvH2-e的寡糖序列Hex0-9HexNAc2-4Hex0-3Pent0-3Fuc0-3與血藍蛋白抗皰疹病毒活性密切相關(guān)，并推測其作用機制可能為血藍蛋白通過范德華力或特定氨基酸殘基與皰疹病毒糖蛋白特定區(qū)域相互作用所致.由此說明，軟體動物血藍蛋白亞基抗病毒活性大小可能與其糖基化程度密切相關(guān).

有意思的是，學者們近年來研究還發(fā)現(xiàn)，血藍蛋白降解片段也可能參與對蝦抗病毒免疫.Chongsatja等[24]采用比較蛋白質(zhì)組學策略，發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦（Litopenaeusvanname）感染桃拉綜合癥病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）24 h后，其血細胞中存在7個血藍蛋白降解片段表達量的顯著變化，其中3/4的血藍蛋白C-末端片段表達上調(diào)，而2/3的血藍蛋白N-末端片段表達下調(diào).由此提示，血藍蛋白降解片段可能同樣與對蝦抗病毒免疫息息相關(guān)，至于其是否具有抗病毒活性及其抗病毒的作用機理還有待于進一步研究和證實.

1.3凝集活性

本課題組從2006年開始對凡納濱對蝦、鋸緣青蟹（Scylla serrate）血藍蛋白凝集活性進行了積極的探索，發(fā)現(xiàn)其對副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻酸弧菌（Vibrio alginolyticus）、河弧菌（Vibrio fluvialis）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、嗜水氣單胞菌（Aeromona hydrophila）、金黃色葡萄球菌（Stphylococcus aureus）和大腸桿菌K12（Escherichia coli K12）等7種細菌具有凝集活性，凝集活性大小為0.27-1.08 mg/L（對蝦）、7.5-30 mg/ml（青蟹），其凝集活性可分別被N-乙酰神經(jīng)氨酸和α-D-葡萄糖（對蝦）以及N-乙酰神經(jīng)氨酸、α-D-葡萄糖、D-半乳糖和D-木糖（青蟹）所抑制.隨后，課題組進一步證實，對蝦血藍蛋白發(fā)揮凝集活性的構(gòu)象主要為血藍蛋白12聚體，與大腸桿菌的凝集作用靶標可能為細菌外膜蛋白OmpX；青蟹血藍蛋白發(fā)揮凝集作用的功能單位為76 kDa亞基，與大腸桿菌的凝集作用靶標可能為兩種外膜蛋白：OmpA和OmpC[25-28].由此說明，血藍蛋白確實具有凝集活性，至于其凝集作用的分子機制還有待于進一步研究和探索.

1.4抑菌活性

Jiang等[29]2007年在《Nature Immunology》首次報道圓尾鱟（Carcinoscorpius rotundicauda）血藍蛋白對綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）具有抑菌活性，抑菌率為（66.0±5.0）%，其作用機制可能為：血藍蛋白在外源性微生物蛋白酶的激活下轉(zhuǎn)化為酚氧化酶（其轉(zhuǎn)化率可以被病原相關(guān)分子模式——脂多糖和磷壁酸得以加強），然后通過產(chǎn)生活性氧而發(fā)揮抑菌活性.

本課題組最近發(fā)現(xiàn)，用2種不同抗體親和純化所得的2種凡納濱對蝦血藍蛋白：LHt（抗體為兔抗血藍蛋白全蛋白）和LH73（抗體為兔抗血藍蛋白73 kDa亞基）對病原菌的抑菌活性存在顯著性差異，其中LH73對副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、鰻弧菌（V. anguillarum）具有明顯的抑菌活性，并與LHt相比，具有極顯著性差異.進一步探究顯示，前者糖含量約為后者的2倍，由此推測，對蝦血藍蛋白糖基化的不同可能是導(dǎo)致血藍蛋白發(fā)揮抑菌活性的另一種分子機制，至于其具體情況還有待于通過對血藍蛋白糖基的鑒定以及糖基與病原菌的相互作用等進一步研究和證實[30].

同時，本課題組還發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍蛋白對溶藻酸弧菌、大腸桿菌K12等細菌均具有抑菌活性，其中對大腸桿菌K12的抑菌作用靶標可能為外膜蛋白OmpX、OmpC、OmpT、Tsx、FadL和OmpW[31].

1.5凝血、溶血活性

本課題組最近發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍蛋白對魚、雞、鼠和人等4種紅細胞具有顯著的凝血活性，其凝血反應(yīng)可被α-半乳糖、α-D-葡萄糖、甘露醇和N-乙酰神經(jīng)氨酸所抑制.在此基礎(chǔ)之上，我們進一步證實凡納濱對蝦、鋸緣青蟹血藍蛋白還具有溶血活性，其中對蝦血藍蛋白對羊、鼠、雞、魚等紅細胞溶血活性大小為（34.7-99.9）%，青蟹血藍蛋白對人、鼠、兔、雞等紅細胞溶血活性大小為（67.3-99.9）%，作用機制可能為膠體滲漏機制[32-33].

值得一提的是，我們采用親和蛋白質(zhì)組學技術(shù)，進一步發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍蛋白可與人紅細胞膜上一種分子量為27 kDa的硫氧還蛋白過氧化物酶（thioredoxin peroxidase）特異性結(jié)合，且兩者在三維結(jié)構(gòu)水平可發(fā)生特異性的對接，結(jié)合位點呈現(xiàn)典型的“鎖-鑰模型”.由此推測，硫氧還蛋白過氧化物酶可能為對蝦血藍蛋白與人紅細胞結(jié)合的靶位之一，所獲研究結(jié)果為進一步揭示血藍蛋白的凝血、溶血作用機制等奠定了良好的基礎(chǔ)[34].

1.6抗腫瘤活性

研究發(fā)現(xiàn)，血藍蛋白除了可以全方位的參與機體的抗病毒、細菌及異種動物紅細胞免疫防御之外，近年來學者們還證實其具有抗腫瘤活性.

Moltedo等[35]報道鮑魚（Concholepas）血藍蛋白對膀胱癌細胞MBT-2具有抗腫瘤活性. Becker等[36]進一步發(fā)現(xiàn)鮑魚血藍蛋白不同亞基的抗腫瘤活性存在差異，其中分子量為405 kDa的亞基CCHA對MTB-2的抗腫瘤活性明顯優(yōu)于分子量為350 kDa亞基CCHB，并推測CCHA亞基之所以具有較好的抗腫瘤活性是由于其具有更好的親水性和更高的糖含量等所致.Boyanova等[37]證實脈紅螺、亮大蝸牛血藍蛋白對人膀胱癌細胞具有抗腫瘤活性，且它們可以作為一種替代藥物用于人淺表膀胱癌的治療.Antonova等[38]發(fā)現(xiàn)螺旋蝸牛（Helix aspersa）血藍蛋白對膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等多種癌癥具有抗腫瘤活性.Sarker等[39]證明鑰孔血藍蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）可以通過增強自然殺傷細胞（Natural Killer，NK）的活力和促進細胞因子的產(chǎn)生來抑制病毒肉瘤細胞（Meth A sarcoma cells）的增殖.我們發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍蛋白對人宮頸癌細胞（Hela）同樣具有明顯的抗腫瘤活性，推測其作用機制可能為：對蝦血藍蛋白通過產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)腫瘤細胞以細胞程序性凋亡機制抑制腫瘤細胞生長[40].

2　血藍蛋白功能多樣性的分子基礎(chǔ)

通過以上敘述可知，血藍蛋白是近年來在無脊椎動物中新發(fā)現(xiàn)的一種具有多種免疫學活性的非特異性免疫因子.但血藍蛋白分子為何可以同時識別、抵抗包括病毒、細菌、真菌、異種動物紅細胞和腫瘤細胞等在內(nèi)的多種不同病原體這個問題尚不是很清楚.可喜的是，最近人們對其進行了積極的探索.

Cong等[41]證實帝王蝎（Pandinus imperator）血藍蛋白發(fā)揮酚氧化酶活性是由于血藍蛋白空間構(gòu)象改變而使酶活性中心暴露所致.Jiang等[29]認為鱟血藍蛋白發(fā)揮抑菌活性是其酚氧化酶活性產(chǎn)生活性氧的結(jié)果.我們在既往研究中發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍蛋白之所以可以發(fā)揮免疫學活性是由于其在結(jié)構(gòu)上存在1個長約250 bp左右的Ig-like區(qū)所致，該功能區(qū)在序列上與人Ig及其它免疫分子存在多個同源區(qū)域，在功能上可與抗人Ig和病原菌、異種動物紅細胞發(fā)生特異性的結(jié)合，推測血藍蛋白是一種新型的IgSF分子[42-43]，并進一步發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍蛋白發(fā)揮凝集、溶血活性主要與其聚集體的大小有關(guān)[32-33].最近包括我們課題組在內(nèi)的學者們在上述研究基礎(chǔ)之上，進一步發(fā)現(xiàn)血藍蛋白之所以可以同時識別、抵抗多種病原微生物，可能與其在核酸、蛋白質(zhì)和糖基化修飾等不同水平具有分子多態(tài)性有關(guān).

本課題組Zhao等[44]、Guo等[45]分別發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍蛋白大、小亞基C-末端存在13、11個SNPs位點，且與對蝦免疫防御及對病原微生物的抗性提高密切相關(guān).隨后，本課題組郭玲玲[46]和Zhao等[47]在凡納濱對蝦體內(nèi)進一步發(fā)現(xiàn)了多個N段變化豐富的血藍蛋白大亞基變體和1個小亞基內(nèi)含子滯留選擇性剪切體的存在，在功能上這些血藍蛋白變體或剪切體與對蝦抵御不同病原微生物的入侵有關(guān).

本課題組喬杰[48]采用親和蛋白質(zhì)組學策略發(fā)現(xiàn)與副溶血弧菌等6種病原菌相結(jié)合的血藍蛋白，不僅在2-DE/2-D Western-blotting圖譜上存在明顯差異，而且其抑菌、凝集和溶血等免疫學功能差異顯著，提示血藍蛋白在蛋白質(zhì)水平同樣存在多態(tài)性，并與血藍蛋白識別不同病原微生物、發(fā)揮不同免疫學活性以及對蝦抵抗不同病原微生物的感染密切相關(guān).

Dolashka等[22]報道脈紅螺血藍蛋白抗病毒活性的發(fā)揮與其糖基化修飾有關(guān).Olianas等[49]通過分析鈣離子、pH值、乳酸鹽等對粒背饅頭蟹（Calappa granulata）血藍蛋白結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)，血藍蛋白具有多種功能可能是由于血藍蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有多種翻譯后修飾的結(jié)果.我們采用親和層析技術(shù)獲得5種糖含量不同的凡納濱對蝦血藍蛋白組分，其凝集、溶血活性存在顯著差異[50].

從以上分析可知，雖然迄今為止血藍蛋白功能多樣性的分子基礎(chǔ)及其作用機制尚不十分明確，但隨著血藍蛋白分子多態(tài)性、基因表達調(diào)控以及信號傳導(dǎo)途徑等研究的深入，相信血藍蛋白功能多樣性的分子機制必將徹底闡明.

3　血藍蛋白在免疫防御中的應(yīng)用

1974年Olsson等[51]率先發(fā)現(xiàn)匙孔血藍蛋（KLH）可用于淺表性膀胱癌患者的治療.隨后，Lamm等[52-53]發(fā)現(xiàn)KLH還可通過腫瘤轉(zhuǎn)移之前的免疫作用或腫瘤轉(zhuǎn)移之后的病灶內(nèi)治療，達到免疫治療膀胱移行細胞癌的目的，并進一步通過臨床實驗證實，KLH是一種安全高效的膀胱癌免疫治療物.Campo等[54]還發(fā)現(xiàn)KLH可以作為一種非特異性免疫刺激物，激活哺乳動物的免疫防御反應(yīng)，并有望作為一種抗原用于抗癌疫苗的研發(fā).Guo等[55]研究證實湖北釘螺（Oncomelania hupensis）血藍蛋白與日本血吸蟲（Schistosoma Japonicum）具有相同的抗原表位，提示其可以作為一種潛在的疫苗進行血吸蟲病的診斷與治療.Gesheva等[56]報道海產(chǎn)腹足類動物紅螺血藍蛋白（Rapana thomasiana hemocyanin，RtH）是一種良好的免疫生物佐劑候選物.

通過上述資料分析可知，血藍蛋白在抗腫瘤治療、疫苗研發(fā)等方面具有重要的潛在的應(yīng)用價值.基于血藍蛋白的功能多樣性，我們有理由認為，隨著對血藍蛋白免疫學功能及其作用機制研究的深入，血藍蛋白在生物醫(yī)學、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面將具有更廣闊的應(yīng)用前景.

4　研究前景與展望

綜上所述，血藍蛋白作為節(jié)肢動物、軟體動物血淋巴中的主要蛋白，在無脊椎動物的免疫防御中發(fā)揮了重要的作用.雖然學者們對血藍蛋白的免疫學活性、功能多樣性的分子基礎(chǔ)及其應(yīng)用等有了較深入的了解，但血藍蛋白發(fā)揮免疫學功能的相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑、功能多樣性的分子機理，及其基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控的分子機制等尚不清楚.為此，筆者認為進一步對血藍蛋白的這些科學問題進行積極的研究，對于揭示蝦、蟹、貝類等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫防御機制，選育抗逆優(yōu)良水產(chǎn)養(yǎng)殖動物品種，建立水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害的生態(tài)學防治方法等具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值.

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Advancement on the Immune Function, Molecular Basis Underlying Multifunctionality and Application of Hemocyanin

ZHANG Zehui,ZHANG Pei,ZHANG Yueling
（Department of Biologyand GuangdongProvincial KeyLaboratoryof Marine Biotechnology, College of Science,Shantou University,Shantou 515063,Guangdong,China）

Hemocyanin is a large,copper-containing protein in the hemolymph of both mollusk and arthropod.The traditional role of hemocyanin is the transport and storage of molecular oxygen.Lately,it is demonstrated that hemocyanin is a novel multifunctional protein,especially participating in multiple roles of immune defense.In the present review,its new progress in the immune function,molecular basis underlying multifunctionality and application prospect in the recent years are dcscussed.The results will assist in the investigation of the role and function of hemocyanin in the invertebrate immunity.

hemocyanin;immune functions;molecular basis underlying multifunctionality; application prospect.

Q71

A

1001-4217（2016）01-0046-09

2015-04-22

張澤蕙（1990—），女，碩士生，主要從事水產(chǎn)動物免疫生物學研究.E-mail:13zhzhang1@stu.edu.cn

章躍陵（1971—），教授，博士生導(dǎo)師.E-mail：zhangyl@stu.edu.cn

國家自然科學基金項目（31372558）；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目（NCET-11-0922）；廣東省自然科學基金項目（S2013010015190）；廣東省高等學?？萍紕?chuàng)新重點項目（2012CXZD0025）.