董宏然， 程琪慶， 段麗穎*， 楊 健

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700；3.北京紅太陽(yáng)藥業(yè)有限公司，北京100020）

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丹七軟膠囊UPLC指紋圖譜研究及組分鑒別

董宏然1，2， 程琪慶3， 段麗穎3*， 楊 健2

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700；3.北京紅太陽(yáng)藥業(yè)有限公司，北京100020）

摘要：目的 應(yīng)用UPLC法建立丹七軟膠囊（丹參、三七）指紋圖譜，并結(jié)合UPLC/Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)其進(jìn)行多成分結(jié)構(gòu)鑒定。方法 丹七軟膠囊80％甲醇提取液的分析采用BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫；體積流量0.25 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm；柱溫30℃。質(zhì)譜定性采用四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF-MS），正、負(fù)兩種離子模式掃描。結(jié)果 以丹酚酸B為參照物峰，確定了丹七軟膠囊UPLC指紋圖譜，指定了32個(gè)共有峰，10批丹七軟膠囊UPLC指紋圖譜相似度大于0.980。結(jié)論 該指紋圖譜靈敏度高，穩(wěn)定性好，可以作為丹七軟膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：丹七軟膠囊；指紋圖譜；超高效液相色譜（UPLC）；飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF-MS）

丹七軟膠囊系在普通丹七其他劑型的基礎(chǔ)上，對(duì)其制備方法進(jìn)行了科學(xué)的試驗(yàn)及工藝改進(jìn)而來(lái)，并獲得了中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局頒發(fā)的丹七軟膠囊的制備方法發(fā)明專利證書（證書公開號(hào)CN17624A），其由丹參、三七兩味藥組成，具有活血化瘀，通脈止痛之功效，用于瘀血閉阻所致的胸痹、癥見胸部刺痛、痛處固定、眩暈頭痛、經(jīng)期腹痛等，在治療心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、骨傷科、婦科、眼科等相關(guān)疾病具有廣泛的應(yīng)用［1-4］。丹七軟膠囊的主要成分有酚酸類和三萜皂苷類等化合物，目前有關(guān)丹七軟膠囊質(zhì)量控制方面的研究較少，僅有梁軍等采用HPLC法檢測(cè)了丹七軟膠囊中丹參素的含有量［1］，為了能更好地控制該產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效，需建立全面評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量的方法。

中成藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣，作為一種多組分、化學(xué)成分復(fù)雜樣品的有效質(zhì)量控制方法，指紋圖譜技術(shù)可以綜合反映藥材中各主要成分及其相對(duì)含有量，而UPLC與HPLC相比，具有高分離度、高速度、高靈敏度等特點(diǎn)［5］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)丹七軟膠囊主要成分的特性，以丹酚酸B為參照物峰，建立了丹七軟膠囊UPLC指紋圖譜，然后采用Q-TOFMS技術(shù)初步指認(rèn)了32個(gè)共有峰，并測(cè)定了10批樣品，為全面提升丹七軟膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

1 儀器及材料

1.1 儀器 ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；micro TOF-Q四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，包括Apo11o II離子漏斗式ESI電噴霧離子源（德國(guó)Bruker公司）；SB-800DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BSA224S分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；5810R離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；15 mL離心管（美國(guó)NEST公司）；0.22 μm PTFE濾膜（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑與樣品 甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；屈臣氏蒸餾水。丹七軟膠囊由北京長(zhǎng)城制藥廠提供，共10批（批號(hào)分別為13110105、13110215、14080101、14080102、14090101、14090102、14100101、14100102、14110101、14110102）。丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111562-201313）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取丹七軟膠囊內(nèi)容物0.5 g，置于15 mL離心管中，加入80％甲醇10.0 mL，密封，超聲30 min。然后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，殘?jiān)?0％甲醇洗滌3次，將洗液與上清液合并，過(guò)濾，濃縮，定容至10 mL量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對(duì)照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，80％甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的丹酚酸B對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1％甲酸水溶液（A）-0.1％甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，5％ B；3～13 min，18％～23％ B；13～15 min，23％～40％ B；15～18 min，40％～70％B；18～23 min，70％～100％B）；體積流量0.25 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正、負(fù)兩種離子模式采集數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 500；干燥氣體為氮?dú)?，體積流量6 L/min；干燥氣溫度220℃；毛細(xì)管電壓在正模式下為4.0 kV，負(fù)模式下為5.5 kV；碰撞氣體為氬氣；碰撞能量10 eV。數(shù)據(jù)采用DataAna1ysis Compass軟件處理，三氟乙酸鈉外標(biāo)法校正。

2.5 測(cè)定方法 選取穩(wěn)定性好、響應(yīng)強(qiáng)、特征明顯、分離度高的丹酚酸B色譜峰作為參照峰，再分別取對(duì)照品及供試品溶液進(jìn)樣，以丹酚酸B的色譜峰為參照峰，其余共有峰的保留時(shí)間和峰面積與其比值分別作為相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)14100101），連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，在“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）對(duì)6次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果顯示，所有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.01％～0.39％之間，相對(duì)峰面積的RSD 在0.25％～1.62％之間，表明整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)14100101），分別于0、2、4、8、12、24 h在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）對(duì)6次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，考察6次測(cè)定的色譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果顯示，所有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.06％～0.65％之間，相對(duì)峰面積的RSD在0.42％～1.69％之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取丹七軟膠囊（批號(hào)14100101）共6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）對(duì)6次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，考察色譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果顯示，所有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.13％～0.86％之間，相對(duì)峰面積的RSD在0.43％～2.36％之間，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.9 指紋圖譜的建立 取10批丹七軟膠囊，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）對(duì)10批供試品的色譜圖進(jìn)行比較分析，選擇吸收信號(hào)較強(qiáng)、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、峰形明顯的32個(gè)色譜峰作為共有峰，其中21號(hào)峰來(lái)源于丹酚酸B（圖1）。然后，對(duì)選定的共有峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，得到丹七軟膠囊對(duì)照指紋圖譜，再將各批樣品的UPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較，并計(jì)算其相似度。結(jié)果表明，丹七軟膠囊樣品整體相似度大于0.990，不同批號(hào)之間的成分基本一致（表1），說(shuō)明10批丹七軟膠囊質(zhì)量穩(wěn)定。

S1.13110105 S2.13110215 S3.14080101 S4.14080102 S5.14010101 S6.14090102 S7.14100101 S8.14100102 S9.14110101 S10.14110102圖1　10批丹七軟膠囊樣品的UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram s of ten batches of Danqi Soft Capsules sam p les

表1　10批丹七軟膠囊樣品的相似度Tab.1 Sim ilarities of ten batches of Danqi Soft Capsules sam ples

2.10 丹七軟膠囊化學(xué)成分分析 利用UPLC/QTOF-MS/MS對(duì)丹七軟膠囊供試品溶液（批號(hào)14080105）進(jìn)行正、負(fù)離子掃描。結(jié)果，供試品中各化學(xué)組分在不同掃描模式下響應(yīng)強(qiáng)度不一，因此對(duì)正、負(fù)離子兩種模式分別進(jìn)行采集，使獲得的化合物信息互補(bǔ)。然后根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，建立丹七軟膠囊組方藥材的化學(xué)成分信息庫(kù)，利用TOF-MS獲得的準(zhǔn)分子離子峰精確相對(duì)分子質(zhì)量信息（誤差＜5 ppm）及MS/MS獲得的二級(jí)碎片信息，并結(jié)合保留時(shí)間、紫外吸收數(shù)據(jù)，與庫(kù)中化學(xué)成分進(jìn)行比對(duì)，鑒定丹七軟膠囊化學(xué)成分，同時(shí)對(duì)鑒定成分進(jìn)行藥材歸屬。結(jié)果，解析出丹七軟膠囊色譜圖中32個(gè)化學(xué)成分，見表2。Q-TOF/MS總離子流圖見圖2。

表2　丹七軟膠囊化學(xué)成分Tab.2 Chem ical constituents of Danqi Soft Capsules

3 討論

中藥指紋圖譜作為一種多指標(biāo)的質(zhì)控模式，可較全面反映復(fù)方中藥所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新思路和新方法，已日益成為國(guó)內(nèi)外廣泛接受的評(píng)價(jià)模式［17］。丹七軟膠囊具有科學(xué)的制備工藝、創(chuàng)新的劑型、確切的療效和安全性，但查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，其指紋圖譜研究卻仍未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-甲酸溶液對(duì)丹七軟膠囊供試品溶液進(jìn)行梯度洗脫，共檢出32個(gè)共有峰，并通過(guò)UPLC/Q-TOF-MS/MS對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析，初步闡明了該復(fù)方制劑的化學(xué)組成，為多指標(biāo)成分的同時(shí)定量測(cè)定分析提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步開展該藥的藥效物質(zhì)及藥代動(dòng)力學(xué)等研究奠定了基礎(chǔ)。另外，所采用的UPLC法靈敏度高，同樣的梯度洗脫系統(tǒng)，其用時(shí)僅為普通液相色譜的三分之一，而且該方法操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可以作為丹七軟膠囊的質(zhì)量控制手段。

在供試品制備方法考察中，本實(shí)驗(yàn)分別采用50％、80％和100％甲醇作為提取溶劑，考察出峰數(shù)目的多少，結(jié)果發(fā)現(xiàn)80％甲醇提取液出峰最多，信息量最大，故以其為提取溶劑。再分別采用超聲和加熱回流提取法進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在相同的提取時(shí)間下，超聲提取可將有效成分充分提取，而且超聲提取法簡(jiǎn)便、快速，故采用超聲法制備供試品。然后，比較超聲提取20、30、40 min，結(jié)果表明當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，主要色譜峰的數(shù)目和峰面積已沒有顯著變化，因此選擇80％甲醇，超聲提取30 min來(lái)制備供試品溶液。

對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，針對(duì)丹七軟膠囊中大量的酚酸和三萜皂苷類成分，選擇0.1％甲酸-水溶液和0.1％甲酸-乙腈溶液進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)指紋圖譜分離效果明顯優(yōu)于純水和純乙腈。再利用DAD檢測(cè)器對(duì)供試樣品進(jìn)行紫外掃描檢測(cè)，對(duì)208、210、 226、238、254、286、326 nm這7個(gè)波長(zhǎng)下檢測(cè)的色譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)供試品在208 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下檢出色譜峰的信息較全，峰面積最大，而且基線較為穩(wěn)定，故選擇208 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣、數(shù)目龐大，傳統(tǒng)經(jīng)典的植物化學(xué)鑒定方法依靠提取分離來(lái)獲得化合物單體，再通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、核磁共振等技術(shù)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，過(guò)程漫長(zhǎng)，耗時(shí)耗力，而飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF/MS）作為復(fù)雜樣品成分鑒定的有效方法，近年來(lái)已越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于復(fù)方中藥的成分分析與鑒定［18-19］。高分辨的分子離子峰是TOF/MS定性最重要的線索，結(jié)合同位素模式，可以推斷化合物的分子式，再結(jié)合MS/MS碎片信息、保留指數(shù)、紫外吸收、文獻(xiàn)檢索等方法對(duì)化合物進(jìn)行定性鑒定。但是對(duì)于結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體，如本文中Ginsenoside Rd與Ginsenoside Re等，不但其分子組成完全一樣，而且有著極其類似的質(zhì)譜裂解行為，僅依靠質(zhì)譜數(shù)據(jù)很難將它們進(jìn)行區(qū)分，故一般需要對(duì)照品的比對(duì)來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)中的同分異構(gòu)體未進(jìn)行對(duì)照品比對(duì)，其鑒定是根據(jù)其在文獻(xiàn)中的保留時(shí)間順序來(lái)確定。

圖2　丹七軟膠囊Q-TOF/MS總離子流圖Fig.2 Q-TOF/MS total ion current chromatograms of Danqi Soft Capsules

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UPLC fingerprint and identification of constituents of Danqi Soft Capsules

DONG Hong-ran1，2， CHENG Qi-qing3， DUAN Li-ying3*， YANG Jian2
（1.School of Traditional ChineseMateria Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 11OO16，China；2.Instituteof ChineseMateria Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 1OO7OO，China；3.Beijing Red Sun Pharmaceutical Co.，Ltd.，Beijing 1OOO2O，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish a fingerprintmethod for ana1yzing Danqi Soft Capsu1es（Salvia miltiorrhiza and Panax notoginseng）by UPLC and a combinative UPLC/Q-TOF-MS/MS method for the identification of theirmu1ticonstituents.METHODS The ana1ysis of Danqi Soft Capsu1es 80％ methano1ic extract was performed on BEH C18co1umn（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），mobi1e phase was0.1％ formic acid-0.1％ formic acid in acetonitri1e with gradient e1ution，f1ow rate was 0.25 mL/min，detection wave1ength was set at208 nm，and co1umn temperature wasmaintained at30℃.Then quadrupo1e-time of f1ight-mass spectrometry（Q-TOF-MS）was used for qua1itative ana1ysis under positive and negative ion modes.RESULTS The UPLC fingerprint of Danqi Soft Capsu1eswas estab1ished with sa1viano1ic acid B peak as reference peak.Thirty-two common peakswere obtained from the standard fingerprint chromatograms of ten batches with the simi1arity of no 1ower than 0.980.CONCLUSION This UPLC fingerprinthas high precision and good stabi1ity，which can be used for the qua1ity contro1of Danqi Soft Capsu1es.

KEY WORDS：Danqi Soft Capsu1es；fingerprint；UPLC；TOF-MS

*通信作者：段麗穎，女，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。Te1：15313557860，E-mai1：duan1y43@126.com

作者簡(jiǎn)介：董宏然（1989—），男，碩士生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。Te1：13716779785，E-mai1：dhyopp@126.com

收稿日期：2015-02-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.026

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）01-0117-06