譚春梅， 陸靜嫻， 王征南

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州310004）

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HPLC法測(cè)定豬膽粉中的牛磺豬去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸

譚春梅， 陸靜嫻， 王征南

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州310004）

摘要：目的 建立HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定豬膽粉中?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸的含有量。方法 豬膽粉甲醇提取液采用Kromasi1C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析；流動(dòng)相乙腈-0.03 mo1/L磷酸二氫鈉，梯度洗脫；體積流量1.0 m L/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。結(jié)果 ?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸分別在0.087 7～4.384 9 μg（r=1.000 0）、0.257 8～8.594 6 μg（r=1.000 0）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率在95.0％～105.0％之間，RSD均小于3.0％。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單、可靠，適用于豬膽粉的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：豬膽粉；牛磺豬去氧膽酸；甘氨豬去氧膽酸；HPLC

豬膽粉為豬科動(dòng)物豬Susscrofa domestica Brisson膽汁的干燥品，具有清熱潤(rùn)燥、止咳平喘、解毒的作用，用于頓咳、哮喘、熱病燥渴、目赤、喉痹、黃疸、泄瀉、痢疾、便秘、癰瘡腫毒［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，豬膽粉具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤作用［2-3］，其主要成分為膽汁酸，包括結(jié)合型和游離型膽酸，以前者為主。目前，相關(guān)研究基本集中在后者［4-8］，而且在測(cè)定其含有量時(shí)基本采用水解后測(cè)定或柱前衍生化法，專(zhuān)屬性不強(qiáng)，但對(duì)占比較高、活性較強(qiáng)的結(jié)合型膽酸的研究較少［9-10］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV法測(cè)定豬膽粉中含有量較高的結(jié)合型膽酸?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸，用以更好的控制其質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ag1ient 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agi1ent公司）；賽多利斯CP225D電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 試藥 牛磺豬去氧膽酸（111943-201301）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甘氨豬去氧膽酸對(duì)照品（G641390）（加拿大多倫多研究化學(xué)品公司，純度98％）。乙腈、甲醇為色譜純；水為重蒸水。豬膽粉10批，批號(hào)分別為120401、120502、120603、120906、121002、121004、121005、121105、121205、130105（福建省仙游縣南豐生化有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasi1-C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.03 mo1/L磷酸二氫鈉（B，磷酸調(diào)pH=4.4），梯度洗脫（0～40 min，28％→36％ A，72％→64％ B）；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品及供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

1.牛磺豬去氧膽酸 2.甘氨豬去氧膽酸1.taurohyodeoxycho1ic acid 2.g1ycy1hyodeoxycho1ic acid圖1　混合對(duì)照品和樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms ofm ixed reference substances and sam ples

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含0.1和0.3 mg相應(yīng)成分的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取本品（批號(hào)120502）粉末約0.1 g，置于50 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲（500 W、40 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣分析，即得。

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系 分別配制系列濃度?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸的對(duì)照品溶液（n =6），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到兩者的回歸方程分別為y=458.95x+ 5.235（r=1.000 0）、y=568.84x+1.390 4（r= 1.000 0）。結(jié)果表明，?；秦i去氧膽酸在0.087 7～4.384 9 μg，甘氨豬去氧膽酸在0.257 8～8.594 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好

3.2 精密度試驗(yàn) 取一定濃度的混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸峰面積。結(jié)果，兩者的峰面積RSD分別為0.8％和1.0％，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取豬膽粉供試品（批號(hào)120502）適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、17、25 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果，牛磺豬去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸的峰面積RSD分別為1.7％和0.8％，表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取豬膽粉供試品（批號(hào)120502）適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，?；秦i去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸的峰面積RSD分別為2.3％和1.1％，表明該方法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率 稱(chēng)取含有量已知的供試品（批號(hào)120502）約20 mg，共6份，置于25 mL量瓶中，分別加入0.069 06 mg/mL牛磺豬去氧膽酸10.0 mL和0.923 9 mg/mL甘氨豬去氧膽酸4.0 mL，適量甲醇溶解，超聲（500 W、40 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

3.6 樣品測(cè)定 取10批供試品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并測(cè)定牛磺豬去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸的含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸含有量Tab.2 Contents of taurohyodeoxycholic acid and glycohyodeoxycholic acid

4 討論

結(jié)合型膽酸屬于末端吸收，本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器，記錄200～400 nm范圍內(nèi)的光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在200 nm波長(zhǎng)處色譜峰響應(yīng)均較大，基線噪音較小，因此選擇200 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。另外，甲醇在205 nm處有末端吸收，故采用乙腈-磷酸鹽流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，能獲得較好的分離效果，而且噪音波動(dòng)較小。

選擇色譜柱時(shí)，考察了Kromasi1-C18、Shimaduzu-C18、Diamonsi1-C18（4.6 mm×25 mm，5 μm），結(jié)果發(fā)現(xiàn)除色譜峰保留時(shí)間略有變化外，對(duì)色譜峰的分離度及峰形均無(wú)明顯影響。

選擇柱溫時(shí)，考察同一根C18色譜柱對(duì)同一份供試品溶液（批號(hào)120502）分別在柱溫20、25、30℃進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)樣品分離度無(wú)明顯的區(qū)別，但在25℃下分離最為理想，故規(guī)定柱溫為25℃。

很多文獻(xiàn)以測(cè)定豬膽粉中水解產(chǎn)物為主，但水解后成分不專(zhuān)屬，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV法測(cè)定豬膽粉中結(jié)合型膽酸類(lèi)成分甘氨豬去氧膽酸和?；秦i去氧膽酸，具有較高的專(zhuān)屬性，而且方法較簡(jiǎn)便，能夠快速的測(cè)定豬膽粉中該兩類(lèi)成分的含有量。

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［飲片炮制］

Determ ination of taurohyodeoxycholic acid and glycohyodeoxycholic acid in Pulvis Fellis Suis by HPLC

TAN Chun-mei， LU Jing-xian， WANG Zheng-nan
（Zhejiang Provincial Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 31OOO4，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLCmethod for determining taurohyodeoxycho1ic acid and g1ycohyodeoxycho1ic acid in Pulvis Fellis Suis.METHODS The ana1ysis of Pulvis Fellis Suismethano1ic extractwas performed on Kromasi1C18co1umn（4.6 mm×250 mm，5 μm），mobi1e phase was acetonitri1e-0.03 mo1/L sodium dihydrogen phosphate with gradiente1ution，f1ow ratewas1.0 mL/min，co1umn temperaturewasmaintained at25℃，and detection wave1ength was set at200 nm.RESULTS Taurohyodeoxycho1ic acid and g1ycohyodeoxycho1ic acid hadbook=123,ebook=129good 1inear re1ationships in the ranges of 0.087 7 -4.384 9 μg（r=1.000 0）and 0.257 8 -8.594 6 μg（r= 1.000 0），respective1y.The average recoverieswere 95.0％ -105.0％.The RSDswere 1ess than 3.0％.CONCLUSION Thismethod is simp1e and re1iab1e，which is suitab1e for the qua1ity contro1of Pulvis Fellis Suis.

KEY WORDS：Pulvis Fellis Suis；taurohyodeoxycho1ic acid；g1ycohyodeoxycho1ic acid；HPLC

作者簡(jiǎn)介：譚春梅（1983—），女，碩士，主管中藥師，從事藥品標(biāo)準(zhǔn)制定和質(zhì)量檢驗(yàn)工作。Te1：（0571）86459425，E-mai1：tanchunmei83@163.com

收稿日期：2015-03-20

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.027

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）01-0122-04