肖瀘燕謝佳利陳 冬謝嘉賓李 淳

（1.四川藝術(shù)職業(yè)學(xué)院，四川成都 611131；

2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都 610041）

四川省家畜布魯氏菌病常見(jiàn)診斷方法研究

肖瀘燕1謝佳利1陳 冬2謝嘉賓2李 淳2

（1.四川藝術(shù)職業(yè)學(xué)院，四川成都 611131；

2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都 610041）

家畜布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。該病以羊、牛和豬最易感，犬及60多種家畜、家禽、野生動(dòng)物有不同程度的易感性，其特征主要是侵害生殖系統(tǒng)，引起流產(chǎn)、不孕、睪丸炎等。感染動(dòng)物可長(zhǎng)期帶菌，成為對(duì)其他動(dòng)物和人類(lèi)最危險(xiǎn)的傳染源。該病曾在上世紀(jì)末得到有效控制，但近年來(lái)，家畜布魯氏菌病陽(yáng)性率逐步升高，疫情有反彈趨勢(shì)，已成為我省重點(diǎn)防控的人畜共患病種。

布魯氏菌??；流行；診斷；病原學(xué)檢測(cè)

1 流行現(xiàn)狀

我省畜間布病存在歷史久遠(yuǎn)，分布廣泛。該病在川西北高原牧區(qū)及半農(nóng)半牧區(qū)主要以羊種及牛種交替流行為主，犬種在農(nóng)區(qū)散發(fā)存在，局部地區(qū)尚有零星的豬布病感染。菌株主要為羊種菌第1、2、3生物型，牛種菌第1、3、4、6、7、9生物型，其中川西北以流產(chǎn)布魯氏菌（牛種）第9種生物型為主，以牛（犏牛最易感，次為牦牛和黃牛）的感染率和出菌率最高，危害最嚴(yán)重，羊次之。流調(diào)結(jié)果顯示，目前全省牛羊布病陽(yáng)性率在0.5%～2.0%左右。

2 診斷方法

2.1 血清學(xué)診斷

2.1.1 凝集試驗(yàn)（RBPT、SAT） 主要為虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）和試管凝集試驗(yàn)（SAT）兩種方法。RBPT在使用時(shí)操作方便、快捷，適用于大規(guī)模的篩選檢疫，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性。SAT特異性高，檢測(cè)比較準(zhǔn)確，但操作麻煩，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適用于大規(guī)模的篩選檢測(cè)，不能區(qū)分人工免疫和自然感染。通常，我省先用RBPT篩選，陽(yáng)性樣品再用SAT復(fù)核以做出比較準(zhǔn)確的判斷。

2.1.2 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT） 該試驗(yàn)是利用綿羊紅細(xì)胞和溶血素可以形成結(jié)合物，在補(bǔ)體的作用下，發(fā)生溶血。在反應(yīng)體系中，他們作為指示系統(tǒng)，與布氏菌的特異性抗原、抗體復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合補(bǔ)體。如果發(fā)生溶血，說(shuō)明血清中沒(méi)有特異性抗體，判為陰性。該試驗(yàn)雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)，但該試驗(yàn)影響因素復(fù)雜，操作步驟繁鎖。我省尚未推廣采用此法。

2.1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 我省用于檢測(cè)布病的主要有iELISA；cELISA兩種。iELISA的特異性和高度敏感使它成為用于檢測(cè)家畜布病最常見(jiàn)的方法，但是它不能區(qū)分免疫抗體與感染抗體。因此，更多把iELISA 作為普測(cè)方法。cELISA這種方法能有選擇地抑制結(jié)合疫苗所產(chǎn)生的抗體而不是野毒株所產(chǎn)生的抗體，因?yàn)閏ELISA可以消除因接種疫苗而產(chǎn)生的殘余抗體所引起的大部分反應(yīng)，cELISA 對(duì)牛布氏桿菌OPS 表位特異性單克隆抗體有很高的特異性，所以單克隆抗體的選擇及其獨(dú)有的特異性和親和力對(duì)cELISA 法的診斷有明顯的影響。

2.1.4 乳環(huán)試驗(yàn)取 新鮮乳樣1ml加于滅菌凝集試驗(yàn)管內(nèi)，加入全乳環(huán)狀抗原1滴（約50μl）充分充分混勻，置37～38℃水浴中60min后取出試管勿使震蕩，立即進(jìn)行判定結(jié)果。若乳脂層的環(huán)帶呈紅色或乳柱不顯著，略帶顏色，即可判定為布病血清學(xué)陽(yáng)性或弱陽(yáng)性；若乳柱上層無(wú)任何變化，乳柱顏色均勻，則判定布病血清學(xué)為陰性。該實(shí)驗(yàn)需注意，受檢乳樣須為新鮮全乳。若為夏季采集乳樣，應(yīng)于當(dāng)日內(nèi)檢查或保存于2℃時(shí)，一周內(nèi)仍可適用。此方法簡(jiǎn)單易行，我省常用于初篩奶牛布病。

2.1.5 膠體金標(biāo)記檢測(cè)技術(shù) 吸取稀釋過(guò)后的血清3-4滴，加于診斷盒圓孔中，于2～15min內(nèi)觀察結(jié)果。若診斷盒試劑條C處出現(xiàn)1條紅色沉淀線，則為布病血清學(xué)陰性；若診斷盒試劑條C、T處均出現(xiàn)紅色沉淀線，則判定為布病血清學(xué)陽(yáng)性。該實(shí)驗(yàn)是一種快速、敏感且特異性高的一種布病快速診斷方法，非專(zhuān)業(yè)人員也可操作，因此較適合大規(guī)模、突發(fā)或邊境地區(qū)檢測(cè)布病用。該方法將在我省得到逐步推廣。

2.2 病原學(xué)檢測(cè)

2.2.1 分離鑒定 將樣品接種于增菌液培養(yǎng)基，37度恒溫培養(yǎng)3～7d，劃線轉(zhuǎn)接于胰蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)3～5d后觀察菌落，并對(duì)可疑菌落進(jìn)行涂片染色鏡檢，再做純菌培養(yǎng)。培養(yǎng)基須放置在5～10%二氧化碳（蠟燭燃燒法）環(huán)境中，而且標(biāo)本中必須存在大量活菌才能分離到該菌，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，所以在我省已被淘汰。

2.2.2 分子生物學(xué)診斷 常用的AMOS-PCR檢測(cè)方法現(xiàn)國(guó)內(nèi)已有人用于區(qū)分牛羊、豬及綿羊附睪種，我省尚未開(kāi)展。該方法需注意兩點(diǎn)：一是提取DNA后，須保存于-25℃的環(huán)境下，防止標(biāo)本質(zhì)量受到影響；二是引物設(shè)計(jì)時(shí)要注意與基因序列一一對(duì)應(yīng)。

3 比較

由于血清學(xué)診斷的實(shí)用性，因此，目前我省主要利用血清學(xué)試驗(yàn)來(lái)診斷家畜布病。國(guó)內(nèi)著名家畜布病專(zhuān)家毛開(kāi)榮教授對(duì)以上常見(jiàn)血清學(xué)診斷方法作過(guò)科學(xué)的對(duì)比，結(jié)果顯示，以上幾種方法的敏感性和特異性均達(dá)到85%以上，其中以CFT和iELISA效果最佳，敏感性和特異性均達(dá)到95%以上。特異性比較：CFT＞ cELISA＞ i-ELISA、RBT ＞ SAT；敏感性比較：i-ELISA 、RBT ＞ SAT ＞CFT ＞ cELISA。

4 思考與展望

畜間布病的流行對(duì)我省現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重的阻礙。我省長(zhǎng)期以來(lái)形成的傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式根深蒂固，尤其是川西北牧區(qū)及半牧區(qū)，一旦暴發(fā)布病，會(huì)嚴(yán)重危害群眾身體健康及公共衛(wèi)生安全。為了穩(wěn)定控制該病，我省近幾年來(lái)開(kāi)展了大量的檢測(cè)診斷工作，檢測(cè)方法的優(yōu)劣，直接決定了我省布病陽(yáng)性家畜的撲殺數(shù)量。因此，選擇一種更加簡(jiǎn)易、高效的檢測(cè)方法成了我省各級(jí)動(dòng)物疫控機(jī)構(gòu)的集體呼聲，對(duì)比以上幾種常見(jiàn)的檢測(cè)方法，補(bǔ)充推廣運(yùn)用膠體金標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)初篩、ELISA方法確診將是趨勢(shì)。

［1］ 毛開(kāi)榮.動(dòng)物布魯菌病防治研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物保健，2006，3（9）：37-40.

［2］ 張莉等.影響布魯氏菌病抗體檢測(cè)的因素分析［J］，醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2015，（12）：1416-1417.