劉富兵，馬歡歡，徐珊，張超，朱昭瓊

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2貴州省麻醉與器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

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新生期重復(fù)吸入七氟烷的成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ、Tau蛋白表達(dá)變化

劉富兵1，馬歡歡2，徐珊1，張超2，朱昭瓊2

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2貴州省麻醉與器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的觀察新生期重復(fù)吸入七氟烷對成年大鼠海馬組織CA3區(qū)β淀粉樣蛋白(Aβ)和異常磷酸化微管相關(guān)蛋白(Tau蛋白)的影響。方法取24只新生大鼠，隨機(jī)分為A、B、C組，每組各8只。分別于出生7、14、21 d時(shí)將各組大鼠置于自制麻醉劑箱中，連接麻醉機(jī)，A、B、C組分別吸入2.6%七氟烷、1.5%七氟烷、(1 L O2+l L空氣)/min，每次1 h，1次/d。待大鼠完全蘇醒后放回原籠，常規(guī)飼養(yǎng)至出生95 d(成年期)備用。出生 95 d檢測各組成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ和Tau蛋白。結(jié)果出生95 d時(shí)A、B、C組海馬組織CA3區(qū)Aβ蛋白的相對表達(dá)量分別為0.431±0.092、0.417±0.097、0.334±0.100，磷酸化Tau蛋白的相對表達(dá)量分別為0.434±0.055、0.456±0.059、0.410±0.060。A、B兩組海馬組織CA3區(qū)Aβ蛋白的相對表達(dá)量與C組相比，P均<0.05；B組海馬組織CA3區(qū)磷酸化Tau蛋白的相對表達(dá)量與C組相比，P<0.05。結(jié)論新生期重復(fù)吸入七氟烷可導(dǎo)致成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ和Tau蛋白表達(dá)升高。

七氟醚；成年，大鼠；海馬；CA3區(qū)；β淀粉樣蛋白；微管相關(guān)蛋白

目前，出生缺陷發(fā)病率逐年升高，外科手術(shù)是常用的治療方法。間斷、重復(fù)接受全身麻醉是否影響患兒成年后的學(xué)習(xí)記憶能力目前臨床尚無定論。β淀粉樣蛋白(Aβ)是大腦皮質(zhì)老年斑的主要成分，微管相關(guān)蛋白(Tau蛋白)是Tau家族的主要成員,研究發(fā)現(xiàn)，Aβ和Tau蛋白是引起學(xué)習(xí)記憶能力下降的重要物質(zhì)[1,2]。七氟烷是目前臨床常用的吸入麻醉藥，已廣泛用于嬰幼兒外科手術(shù)麻醉[3,4]。目前嬰幼兒期重復(fù)吸入七氟烷是否影響患者成年后記憶能力的報(bào)道較少。2013年7月～2015年1月，我們觀察了新生期重復(fù)吸入七氟烷的成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ和磷酸化Tau蛋白的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動物、藥物、試劑與儀器SPF級SD孕鼠30只由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號：SCXK(渝)2007-0005),體質(zhì)量300～400 g。待孕鼠自然分娩后選取7日齡大鼠24只，母乳喂養(yǎng)28 d。(動物飼養(yǎng)環(huán)境：相對溫度：50%～65%，環(huán)境溫度21℃±2℃，自然晝夜循環(huán)光照。七氟烷購自魯南貝特制藥有限公司，Aβ抗體、磷酸化Tau蛋白抗體購自英國Abcam公司，GTVIsionⅢ鼠/兔通用二抗檢測系統(tǒng)、氣體監(jiān)測儀購自德國Dragra公司，循環(huán)密閉吸入麻醉劑箱(78 cm×48 cm×15 cm)為本實(shí)驗(yàn)室自制，箱底鋪約2 cm鈉石灰后覆蓋薄層紗布，顯微鏡熒光圖像分析系統(tǒng)購自德國Leica公司。

1.2大鼠分組及其新生期七氟烷吸入、飼養(yǎng)方法取24只新生大鼠，隨機(jī)分為A、B、C組，每組各8只。分別于出生7、14、21 d時(shí)將各組大鼠置于自制麻醉劑箱中，連接麻醉機(jī)，A、B、C組分別吸入2.6%七氟烷、1.5%七氟烷、(1 L O2+l L空氣)/min，每次1 h，1次/d。待大鼠完全蘇醒后放回原籠，常規(guī)飼養(yǎng)至出生95 d(成年期)備用。

1.3各組成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ、異常磷酸化Tau蛋白檢測采用免疫組織化學(xué)法。分別于出生 95 d時(shí)取各組大鼠，1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛經(jīng)主動脈行腦灌注，斷頭處死大鼠后取出海馬組織，石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、酒精梯度復(fù)水、微波抗原修復(fù)、BsA封閉30 min后加入Aβ(1∶400)、磷酸化Tau蛋白抗體(1∶400)。4 ℃孵育過夜、復(fù)溫、生物素標(biāo)記二抗、DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗作陰性對照。海馬組織染色后細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，Tau蛋白、Aβ蛋白表達(dá)于海馬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。每區(qū)隨機(jī)取4個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus分析系統(tǒng)分析各組海馬CA3區(qū)Aβ、異常磷酸化Tau蛋白的光密度(MOD)值，以MOD值代表蛋白的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2　結(jié)果

出生95 d時(shí)A、B、C組海馬組織CA3區(qū)Aβ蛋白的相對表達(dá)量分別為0.431±0.092、0.417±0.097、0.334±0.100，磷酸化Tau蛋白的相對表達(dá)量分別為0.434±0.055、0.456±0.059、0.410±0.060。A、B兩組海馬組織CA3區(qū)Aβ蛋白的相對表達(dá)量與C組相比，P均<0.05；B組海馬組織CA3區(qū)磷酸化Tau蛋白的相對表達(dá)量與C組相比，P<0.05。

3　討論

七氟烷是新型吸入全麻藥，麻醉誘導(dǎo)快，且患者呼吸暫停發(fā)生率低、血流動力學(xué)也更為穩(wěn)定[5]。七氟烷可增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA受體的效能，從而抑制維持覺醒的關(guān)鍵大腦核團(tuán)的活性，最終導(dǎo)致意識消失[6,7]。

海馬是參與學(xué)習(xí)記憶和條件反射形成過程的重要部位。海馬沿錐體細(xì)胞系統(tǒng)分為四個(gè)區(qū)：CA1、CA2、CA3和CA4。CA1區(qū)和下托相連，含有小錐體神經(jīng)元；CA3區(qū)是海馬水平部的背外側(cè)部分和垂直部的前內(nèi)側(cè)部，含有苔蘚纖維和軸突[8]。海馬與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的兩個(gè)回路即Papez回路與三突觸回路[9]。三突觸回路中海馬CA1區(qū)與CA3區(qū)被認(rèn)為與空間辨別性學(xué)習(xí)記憶活動的關(guān)系甚為密切[10]。有研究者選擇性的破壞小鼠海馬苔蘚纖維突觸與CA3區(qū)的錐體神經(jīng)元的聯(lián)結(jié)區(qū)，破壞其信息位勢的分布格局，使保存在海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的記憶信息很快消失，從而證實(shí)，海馬神經(jīng)元的突觸與CA3區(qū)聯(lián)結(jié)是否正常，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[12]。CA3區(qū)錐體細(xì)胞與門區(qū)神經(jīng)元一樣，也是海馬致癲的易損細(xì)胞，錐體細(xì)胞死之后，苔蘚纖維的正常投射靶區(qū)消失，以致苔蘚纖維側(cè)支發(fā)芽至齒狀回內(nèi)分子層。接著，CA3區(qū)錐體細(xì)胞將信息通過Schaffer側(cè)支突觸傳給CA1區(qū)，CA1區(qū)被認(rèn)為是海馬的主要輸出區(qū)域。

MOD是通過比較光密度來反映陽性細(xì)胞所表達(dá)的蛋白的強(qiáng)度，其原理是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)不同化學(xué)成分的染色反應(yīng)具有不同的吸收波長，并且化學(xué)反應(yīng)在吸收值和細(xì)胞化學(xué)含量間存在一定的化學(xué)劑量關(guān)系的特點(diǎn)，衡量組織或細(xì)胞中某種成分的含量。TPA是以陽性反應(yīng)的光密度值為設(shè)定條件，測定陽性染色面積為參數(shù)，通過比較陽性細(xì)胞所表達(dá)的面積比來實(shí)現(xiàn)的，分析陽性細(xì)胞蛋白表達(dá)的量的差異。這樣將陽性反應(yīng)的強(qiáng)度與量結(jié)合，避免了平均光密度主觀性強(qiáng)，更客觀的分析測定。

研究表明，吸入麻醉藥可引起大腦內(nèi)海馬皮層Tau蛋白過度磷酸化和β淀粉樣蛋白聚集，其病理改變在海馬形成老年斑(SP)和大量的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)，并伴隨大量神經(jīng)喪失，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙[12]。β淀粉樣蛋白存在于正常大腦中，是一個(gè)產(chǎn)生、降解和清除的平衡過程。正常生理?xiàng)l件下，淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)非Aβ生成途徑代謝。新生期SD大鼠，在間斷、重復(fù)吸入臨床麻醉濃度與亞麻醉濃度七氟烷后，在病理狀態(tài)下，APP的非Aβ源加工途徑受抑制，Aβ途徑被激活，導(dǎo)致Aβ的生成過多及Aβ的降解和清除受抑制，最終導(dǎo)致Aβ的積聚，形成SP[13,14]。故吸入臨床麻醉濃度與亞麻醉濃度的七氟烷在CA3區(qū)的β淀粉樣蛋白聚積。由于APP基因具有突變或多態(tài)性，突變對細(xì)胞凋亡的發(fā)生起著重要作用，其中聚集性Aβ對神經(jīng)細(xì)胞的毒性更大，并且可通過Aβ對神經(jīng)元的直接作用而引起細(xì)胞的損傷。因此，Aβ具有很強(qiáng)的聚集性,易形成極難溶解的沉淀。所以推測在吸入臨床麻醉(2.6%)濃度的七氟烷在CA3區(qū)的β淀粉樣蛋白聚積，進(jìn)而影響其學(xué)習(xí)記憶能力。Tau蛋白是含磷酸基的微管相關(guān)蛋白，正常情況Tau蛋白以磷酸化和去磷酸化兩種形式存在，處于一個(gè)平衡狀態(tài)，正常成熟腦中含2～3個(gè)磷酸基，在微管組裝中起著重要的作用，有利于正常成熟神經(jīng)元軸突的完整性和穩(wěn)定性；過度異?；腡au蛋白含5～9個(gè)磷酸基，其引起主要病理改變?yōu)椋篢au蛋白變得異常磷酸化，采用非正常構(gòu)象，在神經(jīng)元中重新分布組合成不溶性、不能與微管結(jié)合的雙螺旋細(xì)絲(PHFs)，進(jìn)而聚集成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)。由于神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成,破壞了神經(jīng)元的正常物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能,進(jìn)而阻斷神經(jīng)元之間的突觸傳遞,最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷及死亡。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[15]，小鼠海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞NR1 亞基基因敲除后削弱了聯(lián)想回憶的能力,推測CA3區(qū)與聯(lián)想記憶有關(guān)(自聯(lián)想與異聯(lián)想)。本實(shí)驗(yàn)吸入臨床麻醉濃度七氟烷后，CA3區(qū)Tau蛋白與對照組無異常，推測吸入臨床麻醉濃度的七氟烷并不影響自聯(lián)想與異聯(lián)想記憶。

綜上所述，新生期重復(fù)吸入七氟烷可導(dǎo)致成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ和Tau蛋白表達(dá)升高。提示在臨床上應(yīng)避免對存在存在出生缺陷需重復(fù)進(jìn)行外科手術(shù)的患兒重復(fù)采用七氟醚麻醉。

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360180)；貴州省科技廳聯(lián)合資金(黔科合J字LKZ〔2012〕04)；遵義市15851人才項(xiàng)目(FZL 1201412273)。

朱昭瓊(E-mail: 1625836721@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.009

R741

A

1002-266X(2016)27-0030-03

2015-12-16)