楊麗娟，余少文（深圳大學生命科學學院，廣東深圳518060）

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黑曲霉高產(chǎn)糖化酶的分子水平研究方法概論

楊麗娟，余少文*
（深圳大學生命科學學院，廣東深圳518060）

摘要：黑曲霉是一株產(chǎn)糖化酶的特殊菌株，而糖化酶在制造葡萄糖、氨基酸、抗生素等發(fā)酵工業(yè)上有著廣泛的應用。以黑曲霉出發(fā)菌株為研究材料，基因改造作為研究背景，通過綜述誘變育種、基因敲除、RNA干擾、基因重組表達等分子改造技術(shù)，將改造后的菌株與出發(fā)菌株生產(chǎn)糖化酶的產(chǎn)量及活性分別進行測定評估。以此探討高產(chǎn)糖化酶的黑曲霉分子改造的優(yōu)良手段，為以后設(shè)計新的效率更好的高產(chǎn)糖化酶的黑曲霉分子改造研究提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；糖化酶；基因工程；分子改造技術(shù)

The Research Methods on Molecular of Aspergillus niger for High-yield Glucoamylase

YANG Li-juan，YU Shao-wen*
（Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060，Guangdong，China）

Abstract：Glucoamylase，is produced by a special strain of Aspergillus niger，has been widely used in fermentation industry of glucose，amino acids，antibiotic，etc. This paper aims to evaluate the yield and activity of glucoamylase which produced by modified strain and starting strain respectively by means of molecular modification technology，such as mutation breeding，gene knockout，RNA interference and gene recombinant expression，etc. With Aspergillus niger starting strain as the research material and gene modification as the research background，in order to explore the excellent means of molecular modification on Aspergillus niger for highyield glucoamylase，this paper provides technical support for later research on the modification of Aspergillus niger with new efficiency and better yield.

Key words：Aspergillus niger；glucoamylase；genetic engineering；molecular modification

糖化酶是目前最重要的工業(yè)酶制劑之一，全名葡萄糖淀粉酶（glucoamylase，EC 3. 2. 1.3）[1]。糖化酶是水解淀粉產(chǎn)生葡萄糖的主要酶類，是一種外切型糖苷酶，從淀粉的非還原性末端依次水解α-1，4糖苷鍵，水解成一個個的葡萄糖單元，工業(yè)上用于將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，因此被廣泛地應用于食品、醫(yī)藥、制酒、氨基酸、抗生素、有機酸等發(fā)酵工業(yè)[2-3]。有研究表示，麥芽糖酶糖化酶在調(diào)節(jié)糖異生和異麥芽糖酶消化淀粉合成糖類中占主導地位[4]。黑曲霉（Aspergillus niger）是市面上生產(chǎn)糖化酶的特殊菌株之一。黑曲霉的α-淀粉酶活性低，糖化酶活力強，多數(shù)黑曲霉的糖化酶能水解80 %以上的淀粉，與其他菌株相比較利用黑曲霉生產(chǎn)糖化酶具備產(chǎn)量高，活性好，安全性高的特點[5]。Metwally M等[6]研究者研究了有限碳源對黑曲霉產(chǎn)糖化酶的生物能力。溫度和添加劑對黑曲霉糖化酶熱穩(wěn)定性也有一定的影響[7]。Lubertozzi D等[8]研究者開發(fā)黑曲霉作為異源表達宿主，Tamayo-Ramo等[9]研究者運用黑曲霉產(chǎn)糖化酶的表達體系來表達多銅氧化酶漆酶，Kra觢evec N等[10]利用黑曲霉絲狀真菌系統(tǒng)表達未正確折疊的分泌蛋白G-CSF，都驗證了黑曲霉具有穩(wěn)定的特異的高表達蛋白酶系統(tǒng)。Huifang Hu等[11]研究了真菌中生產(chǎn)的耐熱糖化酶，通過糖化酶的耐熱性質(zhì)從而提高發(fā)酵的產(chǎn)量。本文以黑曲霉的基因分子水平為研究背景，主要綜述了改造黑曲霉基因組的分子結(jié)構(gòu)使得此菌株高產(chǎn)糖化酶的優(yōu)良方法。

1　誘變育種

誘變育種（mutation breeding）在外界誘導的條件下，利用物理、化學等因素，誘發(fā)生物體產(chǎn)生突變，使得黑曲霉的基因發(fā)生突變或分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而培育出黑曲霉的新品種。誘變方法主要有紫外、化學以及紫外化學復合誘變法和藍光誘變等。在此基礎(chǔ)上，篩選出符合研究需求的菌株，進行遺傳穩(wěn)定性試驗。

康東亮[12]利用紫外線照射和光復活交替處理黑曲霉生產(chǎn)菌株，得到一株性能優(yōu)異的變異株ZW02。搖瓶酶活力比原菌株提高26.8 %。通過正交試驗，優(yōu)化了分批發(fā)酵的最適工藝條件。鐘浩等以產(chǎn)馬鈴薯淀粉糖化酶活為4 700 U/mL的黑曲霉菌株G作為誘變的出發(fā)菌株，對其進行紫外和化學誘變及2種方法復合誘變。結(jié)果顯示：經(jīng)紫外線誘變處理后，得到的變異株G-1產(chǎn)糖化酶活比出發(fā)菌株提高了6.4 %；經(jīng)DES誘變處理后，得到的變異株G-2產(chǎn)糖化酶活比出發(fā)菌株提高了17.06 %；而經(jīng)紫外線和DES復合誘變后，產(chǎn)生的變異株G-3產(chǎn)糖化酶活比出發(fā)菌株提高了38.2 %，達到6 500 U/mL。將菌株G-3進行連續(xù)8次傳代培養(yǎng)后，產(chǎn)酶活力基本穩(wěn)定[13]，證明到復合誘變的菌株產(chǎn)酶活力較單因素誘變強。ZHU JC等[14]也研究了藍光促進黑曲霉產(chǎn)糖化酶的能力。

目前，光誘變和化學誘變是比較傳統(tǒng)的改造黑曲霉產(chǎn)糖化酶能力的方法。但傳統(tǒng)的誘變育種的有益突變頻率較低，變異的方向和性質(zhì)尚難控制。因此提高誘變效率，迅速鑒定和篩選突變體以及探索定向誘變的途徑，是當前研究的重要課題。

2　基因敲除技術(shù)

2.1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法

糖化酶的活力和產(chǎn)量及酶制劑的高純度在近年來取得了很大的進展。但仍存在糖化酶中葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶活性普遍較高的問題[15]。α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC3.2.1.20)又名α-D-葡萄糖苷水解酶，舊稱麥芽糖酶[16]。它作用于低聚糖類底物非還原末端的α-1，4糖苷鍵，能將α-1，4糖苷鍵切開，釋放出葡萄糖或?qū)⒂坞x的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一糖類底物形成α-1，6糖苷鍵，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖或糖脂、糖肽等[17-20]。在糖化酶工業(yè)生產(chǎn)中伴隨著α-葡萄糖苷酶產(chǎn)物的生成，影響了糖化酶的活性及產(chǎn)量。因此，需要運用基因敲除的方法去除糖化酶產(chǎn)物中的α-葡萄糖苷酶。

利用基因工程的方法敲除或破壞黑曲霉絲狀真菌中的基因，用于特定的應用或研究基因功能，外源基因可通過同源重組的方式整合到黑曲霉宿主基因組中。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法是絲狀真菌遺傳操作方法中比較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化率較高的外源基因?qū)虢z狀真菌的方法[21-22]。MICHIELSE CB等[23]利用根癌農(nóng)桿菌介導外源基因，成功轉(zhuǎn)化黑曲霉絲狀真菌。王露等[24]利用農(nóng)桿菌侵染方法，基于載體DNA與受體DNA之間雙交換原理，成功將黑曲霉中α-葡萄糖苷酶基因敲除掉，得到高產(chǎn)檸檬酸的α-葡萄糖苷酶基因缺陷的黑曲霉株?；谕粗亟M的方法，構(gòu)建敲除表達株，通過這種方案篩選高產(chǎn)糖化酶，不產(chǎn)或少產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，給工業(yè)上純化糖化酶的工序降低了成本，并提高了效率。

2.2RNA干擾技術(shù)的應用

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。1998年，Andrew Z. Fire等[25]研究者揭示了RNA干擾的實質(zhì)是使轉(zhuǎn)錄的基因沉默。因此RNA干擾又被形象地稱為基因沉默，和基因敲除具有異曲同工之妙。最初這種技術(shù)被應用于研究植物基因組，2004年，Baulcombe D闡述了植物中RNA干擾的原理及機制[26]。Meister G等[27]研究了double-stranded RNA沉默基因的機制。隨后各種細菌、真菌等多種微生物，果蠅、小鼠等動物的RNA干擾技術(shù)也應運而生。Gerrit C. S等研究者發(fā)現(xiàn)病毒類木瓜蛋白酶P29抑制天然真菌宿主的RNA沉默[28]。接著T. M. Hammond等[29]研究者又發(fā)現(xiàn)曲霉屬真菌病毒是RNA沉默的抑制子。Oliveira JM研究者[30]構(gòu)建共轉(zhuǎn)化的基因沉默表達載體pXLNRir成功將黑曲霉中的纖維素降解基因XlnR敲除掉。2009年，S Maiyuran和H Brody[31]研究了RNA干擾在工業(yè)真菌菌株中的應用，通過RNA介導成功將里氏木霉和黑曲霉中高表達的基因沉默了。近幾年來RNAi研究取得了突破性進展。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，所以該技術(shù)也被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域[32-33]。而在真菌基因功能的研究領(lǐng)域，有研究者利用RNAi技術(shù)將里氏木霉內(nèi)源性高表達基因沉默使得外源脂肪酶生產(chǎn)量提高[34]。銀超[35]等驗證了RNAi技術(shù)可以有效降低黑曲霉宿主內(nèi)源蛋白的表達背景，有利于提高外源基因在黑曲霉細胞工廠中的表達水平和穩(wěn)定性。

以基因工程法構(gòu)建α-葡萄糖苷酶基因的siRNA敲除載體，將載體導入黑曲霉中表達，干擾α-葡萄糖苷酶基因合成糖苷酶，去除影響同一菌株糖化酶表達的活性和產(chǎn)量，使得糖化酶可以高效表達，理論上具有可行性。若黑曲霉的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較低（低于70 %），則采用腺病毒或慢病毒載體，利用病毒載體的高感染率、高表達特性，更好地開展RNA干擾主體實驗[36]。從而成功沉默黑曲霉中α-葡萄糖苷酶基因，得到的糖化酶產(chǎn)物更純，活性更高。

2.3Split-Marker分割標記法

在基因敲除的過程中，往往涉及到敲除載體的構(gòu)建，耗時較長。Split-Marker分割標記刪除方法，通過融合PCR[37]可直接將含有選擇性標記的基因分別與要敲除的基因的5’端和3’端（約1 000 bp）組成兩個片段。將重組好的含同源序列的兩個片段共轉(zhuǎn)化絲狀真菌，重疊區(qū)域的選擇標記基因與基因組對應的基因序列通過側(cè)翼的兩端同源序列發(fā)生重組，使靶基因缺失，從而表現(xiàn)出選擇性標記的活性。

2005年，J. Fu等[38]利用Split-Marker分割標記法提高了新型隱球菌的同源重組效率，發(fā)展了傳統(tǒng)的分子生物技術(shù)改造方法。YU Na na等[39]通過Split-Marker分割標記法，對煙曲霉（Aspergillus fumigatus）泛素末端水解酶（creB）基因進行敲除，結(jié)果顯示煙曲霉CreB蛋白具有泛素特異蛋白酶（ubiquitin-processing protease）UBP亞家族6個結(jié)構(gòu)域，最后驗證了Split-Marker重組技術(shù)是對煙曲霉creB基因進行敲除的快速有效的方法。2011年，Rubella S. Goswami[40]詮釋到，目標基因替換是真菌基因功能鑒定的主要策略，基因組序列信息可用性的增加使得基于此基因周圍區(qū)域的序列能夠被廣泛的用于科學試驗。因此Split-Marker在絲狀真菌中得到普及，這種方法只涉及兩輪PCR，不需要任何的亞克隆。它基于一個標記基因（例如：潮霉素或遺傳霉素）的基因序列，以及靶基因兩側(cè)約1 kb的區(qū)域。該技術(shù)包括標記基因和靶基因兩端1kb的3個序列的PCR擴增，以及兩側(cè)片段分別與標記基因融合的PCR分子表達盒，都含有標記基因的一部分融合到一個側(cè)翼區(qū)。這些分子的表達盒同時用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。進行三同源重組，融合的一個側(cè)翼區(qū)為標記基因，置換功能性基因的片段。轉(zhuǎn)化時可用置換的選擇性標記基因來篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

3　糖化酶基因的克隆與表達

自DNA重組技術(shù)發(fā)展以來，有研究者試著將糖化酶基因克隆到埃希大腸桿菌和酵母菌中，構(gòu)建了高產(chǎn)糖化酶的工程菌。研究者們根據(jù)真菌基因表達的需求構(gòu)建獨立的代謝表達系統(tǒng)[41]。近幾年來，吳曉萍等[42]將切除了5'端非編碼區(qū)50堿基對片段的黑曲霉糖化酶GA I cDNA與大麥α-淀粉酶基因重組進埃希大腸桿菌-酵母穿梭載體中，構(gòu)建重組表達質(zhì)pMAG11，轉(zhuǎn)化釀酒酵母GRF18，獲得含α-淀粉酶和糖化酶雙基因的酵母工程菌GRF18（pMAGII），在酵母PGK基因啟動子和終止信號的調(diào)控下，α-淀粉酶和糖化酶基因獲得高效表達，99 %的表達產(chǎn)物分泌至胞外。曹慕琛等[43]選用pFLDα和畢赤酵母X-33作為黑曲霉糖化酶表達載體和表達菌株，通過RT-PCR的方法擴增得到黑曲霉糖化酶的編碼基因，亞克隆構(gòu)建表達載體pFLDα -glaAm，獲得重組畢赤酵母X-33 /pFLDα-glaAm，SDS-PAGE和活性電泳Starch-PAGE顯示，發(fā)酵液中有目標蛋白表達，酶活達到30 U/mL，表明用畢赤酵母X-33和表達載體pFLDα能很好地表達糖化酶。此外，Min Jin Kwon等[44]研究者研究了黑曲霉的糖化酶基因在脅迫環(huán)境下表達的轉(zhuǎn)錄圖譜，驗證了糖化酶蛋白胞外高水平分泌的機制，為糖化酶基因在其他宿主細胞中的重組表達及胞外分泌提供參考。

黑曲霉糖化酶的基因能在其它宿主菌中得到穩(wěn)定的克隆表達。由于黑曲霉自身是一種生產(chǎn)糖化酶的高效菌株，以它作為出發(fā)菌株，從分子水平上改造與糖化酶表達相關(guān)的特殊基因，如給糖化酶基因加上一個強啟動子[45]，這樣既能高效驅(qū)動糖化酶基因的表達，又不用改變宿主菌種。

4　展望

對高產(chǎn)糖化酶的黑曲霉菌株的分子改造方法，仍然屬誘變育種改造后的糖化酶酶活及產(chǎn)量最高，其次是黑曲霉中α-葡萄糖苷酶的敲除，而糖化酶基因的異源表達技術(shù)雖成熟，但得到的酶活和產(chǎn)量并不理想。但是黑曲霉誘變育種的有益突變率低，變異的方向和性質(zhì)難以掌控，因此提高突變率和解決不定向誘變的問題是未來研究的熱潮。Split-Marker分割標記法周期短，DNA轉(zhuǎn)化效率高，將成為未來研究領(lǐng)域的主導方法。

雖然各種研究手段對黑曲霉高產(chǎn)糖化酶的研究都取得了一些顯著的成果，但試驗結(jié)果揭示出的技術(shù)問題也層出不窮。特別對于新型的RNA干擾技術(shù)，試驗過程中的每個細節(jié)還都需要進一步完善。未來有望將基因敲除和基因重組兩種技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上，探究黑曲霉高產(chǎn)糖化酶的研究方法。

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收稿日期：2015-05-18

*通信作者：余少文（1959—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：應用微生物學。

作者簡介：楊麗娟（1990—），女（漢），在讀研究生，研究方向：應用微生物學。

基金項目：深圳市基礎(chǔ)研究計劃項目（JCYJ20140418091413587）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.048