任勃儒，謝飛，王庭欣，*（.河北大學質(zhì)量技術監(jiān)督學院，河北保定07000；2.邢臺市橋西區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，河北邢臺054000）

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免疫層析技術在食品違禁成分檢測中的應用

任勃儒1，2，謝飛1，王庭欣1，*
（1.河北大學質(zhì)量技術監(jiān)督學院，河北保定071000；2.邢臺市橋西區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，河北邢臺054000）

摘要：膠體金技術是一種新型的免疫標記技術，在食品安全檢測領域得到廣泛應用和快速發(fā)展。簡述膠體金免疫層析技術在瘦肉精、蛋白精、非食用色素、抗生素等食品違禁成分領域的研究和應用，并對該技術的發(fā)展前景作了展望。

關鍵詞：膠體金；免疫層析技術；食品違禁成分

食品中的違禁成分也稱非食品添加成分，是指國家明令禁止在食品生產(chǎn)中添加的物質(zhì)。2008年至今我國衛(wèi)生部先后公布了《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》共6批。其中包括非食用物質(zhì)比如蘇丹紅、三聚氰胺、氯霉素等48種（64個），易濫用的食品添加劑比如漂白劑（硫磺）、膨松劑（硫酸鋁鉀、硫酸鋁銨）等22種。相繼出臺了部分違禁成分的國家標準檢測方法。但大多數(shù)非食品添加成分的檢測方法的研究正在進行中。

大量的文獻報道顯示，目前食品中違禁成分的檢測方法都集中在高效液相色譜法[1]、氣相色譜法[2]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3]、酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）[4]等。這些方法適用范圍廣，準確程度高，但檢測時間長，檢測步驟繁瑣或成本較高，樣品檢測純度要求高，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。膠體金免疫層析技術由于具有反應時間短、靈敏度高、特異性強、結(jié)果直觀、成本低、不需要特殊的儀器設備、應用范圍廣、可適用多種檢測條件等特點，已開始應用于食品中違禁成分的檢測領域。

免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。它是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，借助毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體（如抗體或抗原）發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域（檢測帶），通過酶促顯色反應或直接使用可目測著色標記物短時間（5 min～10 min）便可得到直觀的試驗結(jié)果。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結(jié)合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。

1　膠體金免疫層析技術在瘦肉精檢測中的應用

“瘦肉精”是一類違禁藥物的總稱，主要有鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等。傳統(tǒng)的瘦肉精是克倫特羅，張慧嫦等采用免疫競爭法，將抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體-膠體金復合物包被在膠體金結(jié)合墊上，并將人工合成的鹽酸克倫特羅抗原包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線，其與待測樣品中的鹽酸克倫特羅競爭結(jié)合膠體金標記的鹽酸克倫特羅單克隆抗體，并以顏色直觀顯示檢測結(jié)果。試驗結(jié)果表明檢測豬肉等組織試樣時，靈敏度最低值可達到0.5 ng/mL，只需3 min～5 min，與沙丁胺醇、萊克多巴胺的交叉反應率為0.86 %[5]。2003年國家出臺了動物性食品中克倫特羅殘留量的測定方法GB/T 5009.192-2003《動物性食品中克倫特羅殘留量的測定》。肉品中鹽酸克倫特羅的添加得到了有關部門的大力監(jiān)管，由此鹽酸克倫特羅的新型替代品相繼出現(xiàn)。

萊克多巴胺正被作為一種新型瘦肉精被一些養(yǎng)豬場使用。由于萊克多巴胺在豬等動物體內(nèi)具有殘留并可通過生物鏈方式進入人體，當累積超過一定量時便表現(xiàn)出毒副反應，出現(xiàn)心率失常、肌肉疼痛等癥狀。趙彥嶺等采用膠體金試紙卡法和LC-MS/MS法分別對豬肉、豬肝樣品進行檢測，結(jié)果表明兩種方法的檢測結(jié)果一致，膠體金試紙卡法特異性較高，樣品前處理簡單，檢測快速，成本低[6]。同樣沙丁胺醇也可改善脂肪型動物的肉和脂肪的比例，被用作鹽酸克倫特羅的替代品。沙丁胺醇會殘留在動物體內(nèi)，人食用含沙丁胺醇較高的動物組織后會出現(xiàn)肌肉顫動、肌痛、頭痛，甚至惡心、嘔吐等中毒癥狀。吳巧麗等采用膠體金免疫競爭法將兔抗沙丁胺醇多克隆抗體-膠體金標記物包被在膠體金聚酯結(jié)合墊上，并將沙丁胺醇-BSA抗原包被在硝酸纖維素膜上作為檢測線，與待檢測樣中的沙丁胺醇競爭結(jié)合膠體金標記的兔抗沙丁胺醇多克隆抗體，可檢測出豬肉等組織和飼料試樣中沙丁胺醇的低限濃度為2 ng/mL，與鹽酸克倫特羅的交叉反應率為2.67 %，且試驗在3 min內(nèi)完成，肉眼可判斷結(jié)果[7]。

2　膠體金免疫層析技術在蛋白精檢測中的應用

“蛋白精”是以三聚氰胺廢料、羥甲基羧基氮等為原料制成的一類假蛋白飼料。主要成分為含氮雜環(huán)化合物，屬于非蛋白質(zhì)含氮化合物。三聚氰胺由于其含氮量較高，有時被非法添加到牛奶產(chǎn)品和動物飼料，它的毒性輕微，但若長期攝入，尤其是嬰幼兒，會造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進一步誘發(fā)膀胱癌。李潔等為了研究和驗證免疫膠體金法快速檢測乳制品中的三聚氰胺的效果，通過協(xié)同試驗的方法，研究該方法的靈敏度、重復性、基質(zhì)影響、特異性。利用隨機于市場抽樣乳品120件，分別用免疫膠體金法和國標法進行檢測，驗證該方法的假陰性、假陽性率。結(jié)果表明，用免疫膠體金法測定乳品中的三聚氰胺，檢測限為0.5 mg/kg，方法的穩(wěn)定性較好。樣品中的亞硝酸鹽、三聚氰酸、L-脯氨酸對測定結(jié)果無干擾，但尿素對測定結(jié)果有干擾。免疫膠體金法測定乳品中三聚氰胺的假陰性為0 %，假陽性率為0 %。可見，免疫膠體金法快速檢測乳品中三聚氰胺，方法簡便、快速、準確、穩(wěn)定，可作為乳品中三聚氰胺現(xiàn)場快速檢測的一種有效手段[8]。

3　膠體金免疫層析技術在非食用色素檢測中的應用

天然食品在加工保存過程中容易褪色或變色，為了改善食品的色澤，人們常常在加工食品的過程中添加食用色素以改善感官性質(zhì)，但是有些不法商販只為牟取暴利向食品中添加一些非食用色素。國家衛(wèi)生部發(fā)布的食品中可能違法添加非食用色素有7種，分別是蘇丹紅、堿性橙II、酸性橙II、堿性嫩黃、玫瑰紅B、美術綠和孔雀石綠。

蘇丹染料屬于人工合成偶氮類染料，其中蘇丹紅I由于低廉的價格和好的著色效果，常被添加于一些食品中來提高食品（如含辣椒、咖喱、棕櫚油的食品，冷凍肉，混合香辛料）的著色效果，吸引消費者。然而，蘇丹紅I在代謝過程中降解產(chǎn)生的中等毒性致癌物苯胺可以引起中毒性肝病，長期攝入苯胺也可造成人體神經(jīng)系統(tǒng)損害。付云潔等通過設計合成蘇丹紅I衍生物，將其與明膠用混合酸酐法合成蘇丹紅-明膠免疫抗原，免疫新西蘭白兔制備抗蘇丹紅I多克隆抗體，采用檸檬酸三鈉還原法制備顆粒大小為24.5 nm的膠體金，并制備蘇丹紅I-BSA抗原-膠體金復合物，組裝檢測試紙。試驗結(jié)果表明，試紙條法的蘇丹紅I檢測線為15 μg/kg，抗蘇丹紅I抗體與蘇丹紅II、III、IV均無交叉反應性，與高效液相測定差異不顯著。檢測時間5 min，適用于食品中蘇丹紅I殘留的快速檢測[9]。

堿性橙II是一種偶氮類堿性工業(yè)染料，由于堿性橙II比其他水溶性染料如檸檬黃、日落黃等相比更易于在豆制品中染色，因此一些不法商販常用堿性橙II對豆腐皮和黃魚進行染色，嚴重危害消費者的身體健康。貢東軍等建立堿性橙II的酶聯(lián)免疫分析方法。采用戊二醛偶聯(lián)法將半抗原堿性橙II與載體牛血清白蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）制備免疫抗原堿性橙II-BSA和包被抗原堿性橙II-OVA。經(jīng)紫外可見吸收光譜鑒定和大白兔免疫實驗證實人工抗原成功合成，并制備抗堿性橙II的多克隆抗體。經(jīng)動物實驗證明了人工抗原的免疫原性，其抗血清抗體效價為1∶12 000，測定的最低檢測限為0.01 ng/mL，該檢測方法具有高靈敏度和特異性，可應用于食品中堿性橙II檢測試劑盒的研制[10]。

孔雀石綠是有毒的三苯甲烷類化學物，既是染料，也是殺真菌、殺寄生蟲的藥物，長期超量使用可致癌，無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖領域國家明令禁止添加。王權(quán)等采用無色孔雀石綠（LMG）單克隆抗體建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的間接競爭ELISA檢測方法。結(jié)果表明LMG-McAb最佳稀釋倍數(shù)為1∶80 000，包被抗原最佳質(zhì)量濃度為0.80 μg/mL；競爭反應時的LMG理想稀釋液為40 %乙腈水溶液；標準曲線呈線性相關，相關系數(shù)R2=0.982 3，最適檢測范圍1 ng/mL～256 ng/mL，最低檢測限為1.29 ng/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為4.307 %和4.566 %，鰻魚肉樣的平均添加回收率為90 %～110 %；該檢測方法與隱性結(jié)晶紫、孔雀石綠、結(jié)晶紫的交叉反應分別為40.67 %、13.50 %和5.89 %，與其他抗生素無交叉反應[11]。

4　膠體金免疫層析技術在抗生素檢測中的應用

氯霉素是一種廣譜抗生素，具有良好的抗菌藥理特性，被非法用于各類家禽、家畜、水生動物（魚、蝦等）及蜜蜂中各種傳染病的防治。它在動物肉、奶、蛋等食品中的殘留嚴重威脅人體健康，能引起再生障礙性貧血和粒狀白細胞缺乏癥等疾病。王玉金等將抗氯霉素單克隆抗體-膠體金復合物包被在膠體金結(jié)合墊上，并將人工合成的氯霉素抗原包被在硝酸-醋酸纖維素薄膜表面作為檢測線，其與待測樣品中氯霉素競爭結(jié)合膠體金標記的氯霉素單克隆抗體，并能以顏色直觀顯示檢測的結(jié)果。用GICA與ELISA試劑盒對比檢測了60份牛奶標本，兩法符合率為100 %。GICA檢測樣品中氯霉素殘留含量異性強，靈敏度高，簡便快速，無需特殊儀器設備[12]。

四環(huán)素類藥物為廣譜抑菌劑，高濃度時具有殺菌作用，但四環(huán)素類藥的濫用還引起該類藥物在動物的肌肉、奶、肝臟等中殘留，嚴重危害人類的健康。檀尊社等采用免疫競爭法，將抗四環(huán)素單克隆抗體一膠體金復合物包被在膠體金結(jié)合墊上，制成膠體金試紙條。檢測水產(chǎn)品試樣時，試劑靈敏度最低值可達100 ng/mL，僅需5 min～10 min，與金霉素、土霉素、強力霉素等四環(huán)素族抗生素有很強的交叉反應，故可同時檢測四環(huán)素族中幾種主要抗生素，而與沙丁胺醇、萊克多巴胺等其他獸藥無交叉反應。試驗證明檢測試劑具有較高的靈敏度及特異性，操作便捷，穩(wěn)定可靠，可作為四環(huán)素殘留現(xiàn)場監(jiān)控的有效篩檢手段[13]。

慶大霉素由于其抗菌譜廣、療效佳，且價格低廉而被廣泛用于畜禽飼料中。食品中的過量殘留會對食品安全造成嚴重威脅，主要表現(xiàn)為損害人體器官前庭和耳蝸神經(jīng)，導致眩暈和聽力減退，還可能引起耳毒性和腎毒性。楊俊等采用免疫競爭法檸檬酸三鈉還原制備膠體金顆粒，標記抗慶大霉素單克隆抗體并噴與玻璃纖維上，慶大霉素偶聯(lián)抗原和羊抗兔二抗分別包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線和控制線。慶大霉素快速檢測試紙條的靈敏度為0.7 μg/mL，檢測時間為10 min，與其他同類物質(zhì)無交叉反應，其檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測結(jié)果呈現(xiàn)了很好的一致性。該方法快速簡便。靈敏度高、特異性強、準確性和穩(wěn)定性好，非常適合現(xiàn)場快速檢測慶大霉素[14]。

鏈毒素是一種氨基糖甙類抗生素，對雞、羊、牛、豬的各類炎癥有很好的療效，因此經(jīng)常用作獸醫(yī)臨床治療及飼料藥物添加劑使用，近年來也常用于防治蜜蜂幼蟲病，但它容易損害聽覺神經(jīng)，嚴重時會導致耳聾，對腎臟也有毒性，毒副作用較嚴重。倪同浩等采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，膠體金標記抗體經(jīng)純化后吸附在玻璃纖維膜上，將檢測線和羊抗鼠質(zhì)控線分別包被在硝酸纖維素膜上，分別經(jīng)過處理干燥后與樣品墊、吸水紙組裝成試紙條。使用試紙條對SM標準液檢測，檢測限為100 ng/mL，該試紙條對新霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、恩諾沙星、氨芐青霉素、磺胺喹噁啉無交叉反應[15]。

5　結(jié)語

免疫膠體金技術具有簡便快速，特異性強、敏感性高，肉眼判斷，試驗結(jié)果易保存，無需特殊儀器設備和試劑等優(yōu)點，這些特點是其他檢測方法和免疫學方法所無法比擬的。由于其自身的優(yōu)勢，使得免疫膠體金技術成為繼熒光素、放射性同位素和酶標記技術后發(fā)展起來的第四大標記技術，非常適合于廣大基層檢驗人員以及大批量檢測和大面積初篩等，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應用前景。隨著該技術應用范圍的擴展和研究的深入，提高膠體金的制備質(zhì)量，進一步提高檢測靈敏度、拓展檢測范圍，實現(xiàn)半定量或定量檢測實現(xiàn)多元化檢測是膠體金技術未來的發(fā)展方向。

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Colloidal Gold Immune Chromatography Technology in the Application of Food Banned Substances

REN Bo-ru1，2，XIE fei1，WANG Ting-xin1，*
（1. College of Quality and Technical Supervision，Hebei University，Baoding 071000，Hebei，China；2. Xingtai Qiaoxi Food and Drug Administration，Xingtai 054000，Hebei，China）

Abstract：Colloidal gold technique is a new kind of immune markers.It has widely used for the field of food safety testing and rapid development.This paper briefly described the colloidal gold immune chromatography technology in lean meat powder，protein powder，edible pigment，antibiotics and other banned substances in the field of research and application of food，and pointed out its application prospect.

Key words：colloidal gold；immune chromatography technology；food banned substances

收稿日期：2015-02-10

*通信作者：王庭欣（1965—），女（漢），教授，碩士研究生導師，研究方向：食品安全質(zhì)量控制。

作者簡介：任勃儒（1992—），女（漢），在職碩士研究生，研究方向：食品檢驗與標準化。

基金項目：河北省自然科學基金資助項目（C2013201278）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.046