馬海濤，牛長敏，郭佳倩，鄭英

(揚州大學醫(yī)學院，揚州　225001)

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精子發(fā)生減數(shù)分裂過程中相關基因的研究進展

馬海濤，牛長敏，郭佳倩，鄭英*

(揚州大學醫(yī)學院，揚州225001)

精子發(fā)生是一個復雜的細胞分化過程，其中減數(shù)分裂又是最為特殊和關鍵的一步。在這一過程中一些基因的存在與否、表達水平以及與其他因子間的相互作用，對形成具有生育能力的成熟精子有著至關重要的作用。本文依據(jù)減數(shù)分裂過程中減數(shù)分裂啟動、同源染色體聯(lián)會、基因重組、同源染色體解聯(lián)、染色體分離的順序，對Stra8、Sycp3、Dmc1、Hspa1b、Rec8等相關基因的研究進展進行綜述。

精子發(fā)生；減數(shù)分裂；基因

(JReprodMed2016，25(9)：865-869)

哺乳動物中，攜帶父代基因的精子與攜帶母代基因的卵母細胞成功結合形成受精卵，標志著一個新生命的開始。這一事件發(fā)生的前提是含有成對染色體的生殖細胞能夠進行減數(shù)分裂，分化產生成熟單倍體配子。目前，減數(shù)分裂的過程已明確，針對生殖細胞的研究也已處于分子水平，生殖細胞減數(shù)分裂的具體分子機制也有諸多研究。

雄性哺乳動物的生殖細胞自胚胎期開始增殖，但至青春期才啟動減數(shù)分裂。精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂階段是一個連貫過程，一經(jīng)開始便會持續(xù)進行，直至形成成熟精子。精子發(fā)生中的減數(shù)分裂階段包含多個遞進步驟，每個步驟都有多個基因參與其中。弄清楚這些相關基因出現(xiàn)或缺失的時間、表達的增加或減少以及相互間的作用，有助于進一步研究雄性生殖細胞減數(shù)分裂的誘因和機制。本文對一些已經(jīng)明確及可能參與雄性生殖細胞減數(shù)分裂過程的基因作一綜述。

一、精子發(fā)生減數(shù)分裂過程

哺乳動物精子發(fā)生包含3個階段：(1)精原細胞增殖分化產生初級精母細胞；(2)初級精母細胞通過減數(shù)分裂產生精子細胞；(3)精子細胞變態(tài)后形成成熟精子。其中減數(shù)分裂在整個精子發(fā)生過程中占有重要地位。精子發(fā)生過程中包含兩次連續(xù)的減數(shù)分裂，即初級精母細胞第一次減數(shù)分裂和次級精母細胞第二次減數(shù)分裂。

第一次減數(shù)分裂包括間期和分裂期。間期含有G1、S、G2期3個時相：G1期RNA和蛋白質進行合成，中心粒彼此分離并復制；S期DNA分子復制合成，DNA復制完成標志細胞正式成為初級精母細胞；G2期DNA終止合成，中心粒、微管蛋白完成復制合成。分裂期含前、中、后、末4個時相：其中前期又根據(jù)染色體形態(tài)變化分為細線期、偶線期(配對期)、粗線期、雙線期和終變期(濃縮期)，至此染色體緊密凝集并靠近核的周圍，核膜、核仁消失；中期，細胞質中紡錘體形成，成對的同源染色體移向細胞中央赤道板，著絲粒成對排列在赤道板兩側；后期，在紡錘絲的牽引下，各成對同源染色體分離，并移向細胞兩極；末期，染色體到達兩極后重新聚集，核膜、核仁重現(xiàn)，細胞分裂為兩個子細胞。這兩個子細胞即次級精母細胞，次級精母細胞緊接著發(fā)生第二次分裂。

第二次減數(shù)分裂分為間期、前期、中期、后期和末期，因第二次減數(shù)分裂無DNA復制和同源染色體交換重組等過程，間期和前期存在時間短暫，也可將兩者直接歸入第一次減數(shù)分裂末期；中期，染色體著絲粒排列在細胞中央赤道板；后期，姐妹染色單體分離，成為兩條染色體并移向細胞兩極；末期，染色體到達兩極，核膜、核仁重新出現(xiàn)，細胞分裂為兩個子細胞。這兩個子細胞即精子細胞。至此，整個減數(shù)分裂過程結束。

二、精子發(fā)生減數(shù)分裂相關基因

1. 視黃酸應答基因8(Stra8)：Stra8是視黃酸(Retinoic acid，RA)應答基因中的一種，其被普遍認為是減數(shù)分裂啟動的關鍵基因。雄性小鼠體內Stra8基因僅在睪丸中表達，小鼠出生后5 dStra8開始表達，青春期性成熟后Stra8高表達[1-2]。Stra8基因編碼一個富含谷氨酸的蛋白質，該蛋白有9種磷酸化形式。Stra8蛋白可以在細胞核和細胞質之間來回穿梭，同時其又可以和DNA結合促進轉錄過程[3]。因此推測Stra8在啟動減數(shù)分裂過程中起到轉錄因子或者磷酸化信號蛋白的作用。

Stra8基因敲除的雄性小鼠不育，基因敲除的幼齡小鼠生精細胞未出現(xiàn)第一次減數(shù)分裂前期的典型形態(tài)學特征，精子發(fā)生過程阻滯在間期[4-5]，推測Stra8與減數(shù)分裂的啟動密切相關。Stra8的表達受RA調節(jié)，睪丸內的RA又可被支持細胞分泌的細胞色素P450家族26亞族B成員1(Cyp26b1)降解，而Cyp26b1的分泌又具有時相性(胚胎期多，青春期少)，因此雄性小鼠減數(shù)分裂在青春期才開始，胚胎期僅進行原始生殖細胞的增殖。最近研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期支持細胞不僅抑制Stra8的表達，阻止原始生殖細胞進入減數(shù)分裂，還在某一特定時期表達某種或某些分子，確保原始生殖細胞朝雄性而非雌性生殖細胞方向分化[6]。推測正是由于這兩種作用使得原始精原細胞在青春期前能夠順利分化形成，并在青春期才開始受Stra8的調節(jié)，最終形成成熟的雄性單倍體配子。Saba等[7]研究指出，胚胎期抑制RA可以促進雄性生殖細胞分化形成，并且Cyp26b1直接抑制RA調節(jié)的兩種通路：依賴Stra8的減數(shù)分裂途徑和非依賴Stra8的有絲分裂途徑。此外，Stra8的表達時機十分重要，其過早表達雄性生殖細胞會提前進入減數(shù)分裂，睪丸癌的發(fā)生幾率大大提升[8]。

Stra8在減數(shù)分裂啟動中有著重要作用，本文簡略提及其表達時機、被調控機制以及在減數(shù)分裂啟動中的可能作用，但其啟動減數(shù)分裂的具體分子機制及與之作用的下游基因等還有待進一步研究。

2. 聯(lián)會復合體蛋白3(Sycp3)：Sycp3基因屬于Cor1基因家族，其編碼的蛋白為DNA結合蛋白，主要表達在初級精母細胞中，參與第一次減數(shù)分裂偶線期同源染色體配對過程中聯(lián)會體復合物的形成。Sycp3蛋白自身會形成一個高度延伸的螺旋四聚體結構，其氨基端桿狀結構與DNA雙鏈結合，自姐妹染色單體遠端將兩個同源染色單體結合在一起；同時，Sycp3會自組裝出一個規(guī)律的網(wǎng)狀結構，猜測是通過這兩個結構Sycp3蛋白將兩個同源染色體穩(wěn)固地聯(lián)會在一起[9]。

Sycp3基因敲除的純合子雄性小鼠不育，其睪丸體積明顯變小并伴有大量生精細胞凋亡[10]。在常染色體上Sycp3蛋白作為一個組件參與同源染色體聯(lián)會復合物的形成，其定位隨著染色體形態(tài)不同而改變。染色體聯(lián)會起始于兩側端粒，逐漸向著絲粒合攏，Sycp3可特異性地與著絲粒區(qū)域相關聯(lián)，卻不參與同源染色體著絲粒的聯(lián)會[11]。X、Y染色體聯(lián)會由Sycp3產生一個復雜的網(wǎng)絡狀結構包裹Y染色體和X染色體長臂末端，使二者以尾端接尾端的形式聯(lián)會在一起。推測Sycp3敲除小鼠不育是因為不能正確地形成聯(lián)會體復合物，繼而不能正確完成減數(shù)分裂，最終導致無法形成正常精子。多種癌組織中Sycp3表達也會升高，Cho等[12]研究證實，Sycp3可激活絲/蘇氨酸激酶(AKT)路徑的癌癥通路，其表達量與宮頸癌的發(fā)生率、嚴重度，以及預后有很大關聯(lián)。Sycp3作用并不單一，其表達量增加可產生負面影響，但Sycp3表達增加是否引起睪丸癌的發(fā)生繼而影響雄性生育，還需更多研究去證實。

Sycp3是同源染色體聯(lián)會成功的重要因素，其缺失后減數(shù)分裂停滯，即使少數(shù)細胞未停滯，最終也只能形成異倍體配子。Sycp3蛋白對減數(shù)分裂而言是必須的，但其詳細的分子機制還需繼續(xù)研究，其表達量變化的影響也值得進一步研究探討。

3. DNA減數(shù)分裂重組酶1(Dmc1)：Dmc1蛋白最早發(fā)現(xiàn)于酵母中，是一個僅在減數(shù)分裂過程中表達、與同源染色體基因重組相關的蛋白。Dmc1缺陷的純合型雄性小鼠不育，其精子發(fā)生停滯于第一次減數(shù)分裂前期，免疫熒光未見粗線期的精母細胞，而Dmc1敲除的雜合型小鼠和野生型小鼠生殖細胞內染色體同源重組發(fā)生概率無統(tǒng)計學差異[13]。由此表明Dmc1為減數(shù)分裂染色體同源重組必不可少的。Dmc1蛋白擁有大腸桿菌RecA蛋白家族中保守的第二結構域部分，包括兩個三磷酸腺苷(ATP)結合位點和DNA結合區(qū)。

Dmc1缺陷的生精細胞會積累大量的重組中間體：雙鏈斷裂的DNA分子。Dmc1受DNA結合轉錄因子Swi5及依賴Swi5的重組修復蛋白1(Swi5-Sfr1)復合物介導，與單鏈DNA(ssDNA)結合參與DNA雙鏈的重組，Swi5-Sfr1復合物為Dmc1的激動劑；而DNA重組修復酶22(Rad22)則會競爭性地結合ssDNA，作為Dmc1的抑制劑拮抗Dcm1重組基因的功能[14]。Dmc1和Rad51共同參與染色體同源重組過程，Da Ines等[15]發(fā)現(xiàn)在擬南芥體內Rad51僅發(fā)揮協(xié)助Dmc1進行重組的作用。而Lao等[16]在研究出芽酵母時發(fā)現(xiàn)Rad51是可以獨立發(fā)揮重組作用的，解除其抑制因子Hed1作用后，Dmc1敲除的酵母體內出現(xiàn)大量基因重組現(xiàn)象，但重組的發(fā)生有些混亂，不是典型的基因重組，出現(xiàn)姐妹染色單體間的重組。此外，Dmc1作為基因重組的主要作用因子，其通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)激酶1(Mek1)路徑抑制Rad51的重組功能，保證基因重組只在同源染色體之間正確發(fā)生。同時，Dmc1促進Mek1伴侶蛋白Red1的合成，并介導其參與聯(lián)會體復合物的形成。這些功能很可能與確保正確的同源染色體基因重組有關。Liu等[17]研究證實在減數(shù)分裂過程中，Rad51偏向于在姐妹染色單體之間修復斷裂的DNA雙鏈，而Dmc1則偏向于在同源染色體之間修復斷裂的雙鏈。且在減數(shù)分裂重組時，Rad51活性降低避免與Dmc1競爭修復斷裂的雙鏈DNA，從而保證基因重組能夠正確地在同源染色體之間進行，產生的配子有正確、多樣的基因組成。

Dmc1作為減數(shù)分裂過程中的特異性基因，其存在、調節(jié)及作用機制，對減數(shù)分裂都具有重要意義。但其更明確的分子機制及在哺乳動物身上的機制研究還需進一步加強。

4. 熱休克蛋白家族A成員1B(Hspa1b)：熱休克蛋白是一種大小為70 KD的分子伴侶蛋白，參與其它蛋白的折疊、轉運及復合物形成等過程。大多數(shù)熱休克蛋白持續(xù)表達可能是在受到熱休克等刺激時才發(fā)生，而Hspa1b(亦稱HSP70-2)是在小鼠睪丸中特定表達的受發(fā)育調節(jié)的特殊熱休克蛋白。大鼠體內Hspa1b同源物Hst70起始密碼子上游約360 bp處有一弱啟動子，推測正是由于這一弱啟動子的存在使得其特定表達在睪丸中。

基因打靶沉默后的Hspa1b-/-雄性小鼠無生育能力，其睪丸中未檢測出Hspa1b蛋白，HE染色沒有看到減數(shù)分裂后的精子細胞或成熟精子，且沉默后減數(shù)分裂停滯，大量的精母細胞發(fā)生凋亡[18]。對比出生后12～28 d進行第一次減數(shù)分裂的青春期小鼠睪丸后，發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生進行到第15天粗線期精母細胞時出現(xiàn)異常情況，第15天開始精母細胞發(fā)生凋亡，之后的細胞分化異常，聯(lián)會體復合物無法結束聯(lián)會，正常的雙線期精母細胞和之后的生精細胞均未觀察到[19]，推測Hspa1b與減數(shù)分裂中聯(lián)會體復合物的解聯(lián)密切相關。

高溫和氧化應激是精索靜脈曲張引起睪丸損傷的兩個重要病因。Khosravanian等[20]的研究發(fā)現(xiàn)Hspa1b表達增加可能會抑制精索靜脈曲張引起的睪丸損傷。Ji等[21]的研究表明miR-15a結合到Hspa1b的3’端非編碼區(qū)后會抑制其表達，精索靜脈曲張患者體內miR-15a的表達量很少。推測Hspa1b參與睪丸損傷的防御機制，在精索靜脈曲張患者體內，其防御性表達增加。

Hspa1b參與生精細胞減數(shù)分裂過程，其很可能是聯(lián)會體復合物解除聯(lián)會結構所必需的分子伴侶，同時又是某些抗凋亡因子的伴侶，且其作為一個應激蛋白在維持睪丸正常生理功能、拮抗睪丸損傷的過程中也可能具有一定作用。但其功能的多樣性及每種多樣性的分子機制仍需繼續(xù)深入研究。

5. 減數(shù)分裂重組蛋白Rec8(Rec8)：Rec8最初在酵母中被發(fā)現(xiàn)，其在哺乳動物體內的同源物為Rec8p。Rec8與Stra8一樣受RA的調節(jié)[22]。雄性小鼠體內Rec8僅在睪丸組織中表達，減數(shù)分裂開始前已廣泛分布在染色體上。隨著同源染色體分離的進行，染色體臂上逐漸檢測不到Rec8，只能在著絲粒上檢測到，這一狀態(tài)一直維持至第二次減數(shù)分裂后期，姐妹染色單體分離后整個染色質區(qū)域不再出現(xiàn)Rec8信號[23]。同時，Rec8蛋白的降解受分離酶介導，在誘導Rce8基因突變使其蛋白對分離酶敏感性下降后，同源染色體和姐妹染色單體的分離發(fā)生異常。提示Rec8在減數(shù)分裂過程中與同源染色體及姐妹染色單體的正確分離存在關聯(lián)。

Rec8蛋白為黏連蛋白復合物組件之一。第一次減數(shù)分裂后期同源染色體分離時，Sgo1蛋白保護位于著絲粒的Rec8蛋白免于被分離酶水解，確保同源染色體分離的同時姐妹染色單體不隨之分離，而第二次減數(shù)分裂時姐妹染色單體順利分離。Wassmann[24]認為在這一階段，Rec8蛋白受Cyclin A2等因子影響發(fā)生了磷酸化作用，被分離酶水解，失去原有的功能結構，使得姐妹染色單體不被黏連蛋白連接，繼而能夠分離。

Rec8蛋白的存在使精子發(fā)生減數(shù)分裂過程中同源染色體的分離正確進行，避免了姐妹染色單體的過早分離，為成熟單倍體精子的形成提供了保障。目前針對Rec8的研究主要集中在其保護染色單體不過早分離，而其表達的調節(jié)以及著絲粒保護與去保護作用的詳盡機制等還需要進一步探究。

6. 其他基因：除上述基因外，可能參與精子減數(shù)分裂過程的基因還有很多。Boule基因是一個進化上高度保守的基因，主要表達在雄性生殖細胞中，Boule缺陷的果蠅會因G2/M期轉換障礙導致精子發(fā)生受阻[25]。Boule基因敲除的純合子小鼠相比雜合子小鼠其第一次減數(shù)分裂完成的時間延長約2倍，且精子細胞的缺失更多[26]。睪丸是一個進行高轉錄活動的場所，特別是精母細胞，很多MicroRNA在減數(shù)分裂過程中也發(fā)揮著重要作用。miR-34c已被證實存在于精原干細胞中，且其在之后的精母細胞中表達上調，并已證實其與初級精母細胞的調亡存在關聯(lián)[27]。Dicer1是一個miRNA合成相關的酶，Dicer1缺失的雄性沒有生育能力，且生殖細胞由間期進入第一次減數(shù)分裂前期的時間延長，同時初級精母細胞的凋亡增加[28]。

三、結語

雄性哺乳動物精子發(fā)生減數(shù)分裂過程是一個特殊的細胞分化過程，多種基因參與其中。Stra8參與啟動，Sycp3與聯(lián)會相關，Dmc1重組斷裂的同源染色體DNA，而Hspa1b和Rec8分別與染色體解聯(lián)、分離存在聯(lián)系。此外還有一些基因以及小分子RNA在這一過程中發(fā)揮作用。明確這些影響因子及其相互間的作用機制，有助于更好地了解不育的病因并為其治療提供新思路，還為使用干細胞重組或體細胞分化手段生成具有生育能力的精子提供了新的可能。

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[編輯：肖曉輝]

Progress in the genes regulating meiosis during spermatogenesis

MA Hai-tao，NIU Chang-min，GUO Jia-qian，ZHENG Ying*

YangzhouUniversityMedicalAcademy，Yangzhou225001

Meiosis is the most special and important event in spermatogenesis which is a very complex process of germ cell differentiation. During the meiosis process，the expression of many genes and the interaction with other factors play a vital role in the formation of mature spermatozoa. In this paper，some involved genes such as Stra8，Sycp3，Dmc1，Hspa1b，Rec8 are reviewed in the following order：meiosis resumption，synapsis，homologous recombination，desynapsis，chromosome segregation.

Spermatogenesis；Meiosis；Gene

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.021

2015-11-09；

2016-01-05

國家自然科學基金(31371174)；江蘇省自然科學基金(BK20131230)；揚州市社會發(fā)展科技攻關計劃(2012127)；2014年度揚州大學新世紀人才工程

馬海濤，男，安徽天長人，碩士研究生，生殖醫(yī)學專業(yè).(*

，Email：13616296069@163.com)