王建設(shè)，叢靜，謝永剛

(1威海市文登中心醫(yī)院，山東威海264200；2煙臺毓璜頂醫(yī)院)

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脊髓損傷后慢性中樞性疼痛大鼠脊髓背角淺層組織NR-1表達及意義

王建設(shè)1，叢靜1，謝永剛2

(1威海市文登中心醫(yī)院，山東威海264200；2煙臺毓璜頂醫(yī)院)

目的觀察脊髓損傷(SCI)后慢性中樞性疼痛(CCP)大鼠脊髓背角淺層組織中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞單位NR-1的表達變化，并分析其意義。方法32只大鼠中隨機取16只采用改良重物墜擊脊髓法建立SCI模型，造模6 d時出現(xiàn)CCP 8 只(CCP組)、未出現(xiàn)CCP 8只(SCI組)；另取8只僅暴露脊髓不行打擊(假手術(shù)組)，8只不做任何處理者為對照組。造模14 d采用免疫組化法檢測各組大鼠脊髓背角淺層組織NR-1蛋白。結(jié)果CCP組、SCI組、假手術(shù)組、對照組脊髓背角淺層NR-1蛋白相對表達量分別為0.13±0.01、0.08±0.01、0.07±0.01、0.07±0.02，CCP組NR-1相對表達量明顯高于其余各組(P均<0.05)，SCI組、假手術(shù)組、對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論SCI后CCP大鼠脊髓背角淺層存在NR-1高表達，NR-1可能參與了SCI后CCP的發(fā)生、發(fā)展。

脊髓損傷；慢性中樞性疼痛；N-甲基-D-天冬氨酸；受體亞單位

脊髓損傷(SCI)是脊柱損傷最嚴重的并發(fā)癥，可引起脊柱功能性或器質(zhì)性損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)運動及感覺功能障礙。SCI后運動功能的恢復(fù)是臨床治療的重點，但其伴發(fā)的慢性中樞性疼痛(CCP)常被忽略，臨床缺少有效治療方法[1]。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞單位NR-1是傳導(dǎo)疼痛信號的主要受體，其在SCI后CCP發(fā)生發(fā)展中作用的相關(guān)報道較少。 2014年4月～2015年10月，我們觀察了SCI后CCP大鼠脊髓背角淺層組織NR-1蛋白的表達，并分析其意義，旨在為SCI后CCP的診治提供依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性2～4周齡SD大鼠32只，由煙臺毓璜頂醫(yī)院動物中心提供，體質(zhì)量220～250 g，室溫20～24 ℃、12 h明暗循環(huán)下飼養(yǎng)1周。NR-1一抗稀釋度1∶400，Zymed公司，美國)及生物素標記的羊抗兔二抗(稀釋度1∶200，Santa Cruz公司，美國)，7371型機械測痛儀購自美國IITC公司，37400型熱測痛儀購自香港萬浩科技有限公司。

1.2動物分組及干預(yù)32只大鼠中隨機取16只采用改良重物墜擊脊髓法[2]建立SCI模型：10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，切開背部皮膚分離肌肉，咬骨鉗咬除脊椎L1節(jié)段椎板，分離3～4 mm切口充分暴露脊髓。400 g/cm(下落高度20 cm、打擊重量20 g)打擊力度打擊脊髓1次，打擊完后縫合切口，注射青霉素(8萬單位/次，1次/d，連續(xù)3 d)預(yù)防切口感染。術(shù)后行手法排尿持續(xù)到大鼠能自主排尿,防止出現(xiàn)SCI術(shù)后尿潴留。大鼠脊髓受到打擊時出現(xiàn)肢體抽動即視為造模成功，16只大鼠均造模成功。造模6 d時根據(jù)文獻[2]判定出現(xiàn)CCP 8只(CCP組)、未出現(xiàn)CCP 8只(SCI組)，另取8只大鼠僅暴露脊髓不行打擊(假手術(shù)組)，8只不做任何處理者為對照組。

1.3脊髓背角淺層組織NR-1蛋白檢測采用免疫組化法。分別于造模14 d取各組大鼠，腹腔注射麻醉后處死。以L1棘突為中心分離暴露脊髓，并取L1節(jié)段鄰近脊髓組織各1 cm。將所取組織常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，組織切片后進行抗原修復(fù)。滴加1∶400 NR-1一抗室溫孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次；生物素標記的1∶200稀釋的兔抗小鼠二抗，室溫下孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。NR-1陽性表達為脊髓背角淺層呈淡黃色加深。采用HMIAS-2000型全自動彩色圖像分析系統(tǒng)測出切片底色灰度值，然后自動進行免疫反應(yīng)區(qū)域的彩色分割，測定光密度。所有切片均在同一光度下測定，測定3次，取平均值，以光密度作為NR-1蛋白相對表達量。

2　結(jié)果

CCP組、SCI組、假手術(shù)組、對照組脊髓背角淺層組織NR-1蛋白相對表達量分別為0.13±0.01、0.08±0.01、0.07±0.01、0.07±0.02，CCP組NR-1相對表達量明顯高于其余各組(P均<0.05)，SCI組、假手術(shù)組、對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3　討論

CCP是SCI后發(fā)生的一種頑固性疼痛，表現(xiàn)為損傷平面以下持續(xù)的自發(fā)痛和誘發(fā)痛。既往研究發(fā)現(xiàn)，中樞痛覺敏化是導(dǎo)致CCP的最初原因。多數(shù)學(xué)者認為，其發(fā)生發(fā)展與SCI后所引起的感覺通路失平衡及遞質(zhì)或受體失衡有關(guān)，然而其具體作用機制目前尚不明確。目前，臨床常使用外周電刺激及傳統(tǒng)的藥物止痛療法治療SCI后CCP，但效果較差。

脊髓背角淺層是整個脊髓背角中神經(jīng)活性受體含量豐富且種類繁多的部位，以往研究認為其為傳導(dǎo)痛覺的第一站[3]。脊髓背角神經(jīng)元可接受外周感覺神經(jīng)的傳入，將神經(jīng)信號換元處理后傳遞至海馬，最終將神經(jīng)沖動傳遞到大腦皮層感覺區(qū)。NMDA受體是一種典型的興奮性氨基酸受體，可調(diào)控神經(jīng)元樹突、軸突結(jié)構(gòu)的發(fā)育，參與突觸可塑性的形成，是學(xué)習(xí)和記憶過程中的重要受體。其包含很多受體亞單位，其中NR-1是傳導(dǎo)疼痛信號的主要受體亞單位[3,4]。NR-1含有一個結(jié)合甘氨酸的位點，是構(gòu)成離子通道的基本亞單位。以往研究發(fā)現(xiàn)，NMDA受體的激活能夠激活一系列與痛覺信號傳遞密切相關(guān)的信號通路，該受體功能被激活是引起神經(jīng)病理性疼痛中樞敏化的關(guān)鍵機制之一，NR-1是其重要組成部分[5～8]。脊髓背角淺層受損后，由NR-1亞單位激活所誘發(fā)的突觸長時程增強，導(dǎo)致異常痛覺過敏的發(fā)生[9,10]。脊髓損傷后，由炎癥反應(yīng)所介導(dǎo)的過氧化反應(yīng)可以導(dǎo)致痛覺過敏的發(fā)生。該過程主要是通過誘導(dǎo)脊髓背角淺層NMDA受體亞單位NR-1的磷酸化而產(chǎn)生,而NR-1受體的激活與其磷酸化密切相關(guān)[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓內(nèi)注射NMDA受體激動劑可升高大鼠興奮性氨基酸的分泌、上調(diào)NMDA受體NR-1的表達水平，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)理毛、自噬等過度修飾行為及機械痛和熱痛覺過敏現(xiàn)象[13～15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCP組NR-1相對表達量明顯高于其余各組，SCI組、假手術(shù)組、對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明SCI后CCP的發(fā)生與脊髓背角淺層NR-1蛋白的激活密切相關(guān)，推測其可能作用機制為：①SCI可導(dǎo)致脊髓背角淺層受體失平衡，導(dǎo)致興奮性受體NR-1大量產(chǎn)生；②SCI后的炎性反應(yīng)導(dǎo)致過氧化物大量產(chǎn)生并進一步使受體磷酸化,NR-1被大量激活。

綜上所述，SCI后CCP大鼠脊髓背角淺層組織存在NR-1表達升高，NR-1可能參與了SCI后CCP的發(fā)生、發(fā)展。

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謝永剛(E-mail: xyglzxrx@sina.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.013

R651.2

A

1002-266X(2016)18-0040-02

2015-12-15)