王 俊，尹 萌，韓東冬，茅蕾蕾，許愛華＊＊

（1.揚州大學醫(yī)學院 揚州 225001；2.江蘇省揚州市藥品檢驗所 揚州 225009）

銀杏外種皮提取物重金屬元素與銀杏酸測定＊

王 俊1，尹 萌2，韓東冬1，茅蕾蕾1，許愛華1＊＊

（1.揚州大學醫(yī)學院 揚州 225001；2.江蘇省揚州市藥品檢驗所 揚州 225009）

目的：本研究旨在檢測銀杏外種皮提取物（Ginkgo Biloba Exocarp Extracts，GBEE）中，5種重金屬元素和銀杏酸的含量。方法：實驗采用水提醇沉法制備6個不同產(chǎn)地的GBEE；采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定鉛、鎘、銅、砷4種重金屬元素含量，原子熒光光度法（AFS）測定汞元素含量；采用HPLC 法檢測銀杏酸含量。結(jié)果：6個產(chǎn)地的 GBEE 中，鉛、鎘、銅、砷、汞的含量均在《中國藥典》限量水平以下；且均不含任何銀杏酸。結(jié)論：GBEE中不含銀杏酸成分，其重金屬元素含量符合《中國藥典》限量規(guī)定。

銀杏外種皮提取物 重金屬元素 銀杏酸

銀杏是中國的特產(chǎn)，銀杏的果實白果和銀杏葉皆具有重要的藥用價值而早已載入了《中國藥典》。銀杏外種皮是銀杏果實的最外層肉質(zhì)皮，目前在產(chǎn)區(qū)尚屬廢棄之物。GBEE為采用銀杏外種皮經(jīng)水煮、醇沉精制而得，主要有效部位為蛋白多糖類化合物[1]。本課題組已有的藥效學研究顯示，GBEE 具有促進免疫、抗腫瘤、抗腫瘤轉(zhuǎn)移以及減毒增效等作用[2-5]。臨床觀察顯示，其膠囊制劑可使胃癌瘤體縮小，并能改善多種癌癥患者的生存質(zhì)量，具有很好的應(yīng)用前景[6]。本研究檢測不同產(chǎn)地GBEE中的5種重金屬元素以及銀杏酸含量，為評估其安全性以及質(zhì)量標準的建立提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Elan DRC-e電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Perkin Elmer公司）；AFS-2202a 雙道原子熒光光度計（北京吉天儀器有限公司）；Multiwave 3000微波消解系統(tǒng)（奧地利Anton Paar公司）；Waters高效液相色譜儀，包括：Alliance 2695四元泵，Waters 2996 PAD檢測器；R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；BT125D 型1/10 萬電子天平（德國sartorius公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

1.2 材料

銀杏果實于2013年10月上旬分別采摘于江蘇泰州泰興（1號）、江蘇泰州姜堰（2號）、江蘇南通（3號）、江蘇無錫（4號）、安徽黃山（5號）、山東臨沂（6號），經(jīng)揚州大學醫(yī)學院中醫(yī)藥研究室陳華圣教授鑒定均為銀杏科銀杏屬植物銀杏的成熟果實，其肉質(zhì)外種皮徒手剝離，曬干備用；鉛（Pb）、鎘（Cd）、銅（Cu）、砷（As）、汞（Hg）5種單元素標準溶液均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸、過氧化氫（美國Sigma公司）；超純水由Milli-Q超純水處理系統(tǒng)制備；總銀杏酸A（包括銀杏酸C13：0、C15：1、C17：1）和總銀杏酸 B（包括銀杏酸C15：0、C17：2）皆為中國藥品生物制品檢定所提供；無水甲醇、冰醋酸為色譜純；石油醚為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 GBEE的制備

采用水提醇沉法[7]制備GBEE。將6個不同產(chǎn)地的銀杏外種皮按1：8（W：V）料液比加水于90-95℃煎煮提取，每次1 h，重復(fù)提取3次，過濾，合并濾液，將過濾液減壓濃縮至一定的濃度后乙醇沉淀，乙醇終濃度為80%，收集沉淀物，用高濃度乙醇洗滌數(shù)次后真空干燥，即得灰白色GBEE粉末，其平均得率為5.04%。

2.2 重金屬元素測定

2.2.1 標準溶液的配制

精密量取各單元素標準溶液，用稀釋溶液逐級稀釋配制成相應(yīng)的系列濃度的溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備

精密稱取6個不同產(chǎn)地GBEE樣品粉末各0.5 g，置聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL濃硝酸放置過夜，次日加入3 mL過氧化氫，將消解罐加蓋組裝放入微波消解爐中，程序升溫至180℃消解30 min取出，放冷后將消解液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中定容，搖勻，即得GBEE樣品溶液。同時制備空白試劑對照溶液。皆1式3份，供ICP-MS/AFS測定。

2.2.3 儀器工作參數(shù)

ICP-MS：高頻發(fā)射功率1 350 W，采樣深度6.6 mm，載氣流量1.2 L·min-1，等離子氣流量15 L·min-1，輔助氣流量1.0 L·min-1，霧化室溫度2℃，溶液提升量0.8 mL·min-1，掃描方式跳峰，觀測點/峰3，每點積分時間0.3 s，重復(fù)次數(shù)3。AFS：光電倍增管負高壓300 V，原子化器溫度200℃，原子化器高度8 mm，燈電流30 mA，載氣流量400 mL·min-1，屏蔽氣流量1 000 mL·min-1。

2.2.4 方法學考察

線性關(guān)系和檢出限：精密量取各單元素的系列標準溶液，在“2.2.3”相應(yīng)的實驗條件下測定，以ICP-MS/AFS為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X），儀器自動處理數(shù)據(jù)，得到各元素的回歸方程。結(jié)果表明，各元素在其相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 00-0.999 99 之間。將“2.2.2”項下處理過的空白對照溶液按與樣品溶液相同的方法測定10次，以測定值的3倍標準偏差所對應(yīng)的濃度值作為各元素的檢出限，見表1。

精密度：分別精密量取各單元素標準溶液，在“2.2.3”相應(yīng)的實驗條件下重復(fù)測定6次，RSD在0.98%-6.95%之間。結(jié)果表明，所用儀器的精密度良好。

加樣回收率：精密稱取1-6號GBEE各0.25 g（6份），分別精密加入3個濃度水平的各單元素標準溶液，每個濃度系列平行2份，按“2.2.2”方法制備樣品溶液，在“2.2.3”相應(yīng)的實驗條件下測定。結(jié)果顯示各元素的平均回收率在 96.12%-105.59%之間，RSD均小于5.0%。

2.2.5 GBEE樣品中重金屬元素測定

取“2.2.2”項下樣品溶液，按“2.2.3”項下相應(yīng)的實驗條件測定，計算各元素含量。結(jié)果顯示，6 個產(chǎn)地的 GBEE 中Pb、Cd、Cu、As、Hg的含量均低于《中國藥典》（2010 版）一部對藥材的限量規(guī)定（鉛≤5.0 mg·kg-1、鎘≤0.3 mg·kg-1、銅≤20.0 mg·kg-1、砷≤2.0 mg·kg-1、汞≤0.2 mg·kg-1[8]）。結(jié)果還顯示，在6個產(chǎn)地中，泰州地區(qū)（1號和2號）的GBEE中5種重金屬元素含量皆低于6個產(chǎn)地的平均含量，見表2。

表1 GBEE 樣品中各元素回歸方程和檢出限

2.3 銀杏酸測定

2.3.1 色譜條件

ODS C18色 譜 柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫25℃；流動相：甲醇-1%冰醋酸溶液（V：V，86.5：13.5），流速1.0 mL·min-1；檢測波長為310 nm。

2.3.2 銀杏酸標準品的定位譜圖

精密稱取總銀杏酸A 2.5 mg，總銀杏酸B 5.0 mg，分別溶于無水甲醇，定容于25 mL棕色容量瓶中，量取等體積的總銀杏酸A甲醇溶液和總銀杏酸B甲醇溶液，混合均勻，0.45 μm 濾膜過濾，得定位標準品甲醇溶液。精密量取100 μL 進樣，在“2.3.1”色譜條件下檢測，結(jié)果顯示，5 種銀杏酸均得到了較好的分離，見圖1。

2.3.3 GBEE樣品中銀杏酸的檢測

分別精密稱取6個不同產(chǎn)地GBEE各1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入石油醚（60-90℃）50 mL，稱定重量，回流提取2 h，放冷，再稱定重量，用石油醚（60-90℃）補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，減壓回收溶劑至干，精密加入無水甲醇2 mL，密塞，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，得GBEE樣品甲醇溶液。在“2.3.1”色譜條件下進樣100 μL，參照總銀杏酸定位標準品譜圖的出峰時間判斷，結(jié)果顯示，GBEE中不含任何銀杏酸成分，見圖2。

3 討論

重金屬元素生物毒性較大，進入人體后富集于某些器官中可導致一系列急慢性疾病[9]，《中國藥典》對部分中藥中Pb、Cd、Cu、As、Hg等重金屬元素的限量皆有明確規(guī)定[10]。因此，重金屬元素檢測已經(jīng)成為控制相關(guān)中藥質(zhì)量的常規(guī)項目。本研究采集華東地區(qū)6個產(chǎn)地的銀杏外種皮，并按相同工藝制備了GBEE，采用ICP-MS/AFS法[11，12]檢測了5種重金屬元素，結(jié)果顯示，6種GBEE中Pb、Cd、Cu、As和Hg元素的含量均符合《中國藥典》安全標準，尤其是江蘇泰州地區(qū)的GBEE，其5種重金屬元素的含量均低于所測6個產(chǎn)地的平均值，可能與有銀杏之鄉(xiāng)美譽的生態(tài)環(huán)境有關(guān)。該結(jié)果為GBEE質(zhì)量標準的進一步研究與制訂提供了科學依據(jù)，也為銀杏外種皮藥用資源產(chǎn)地的選擇提供了參考。

目前臨床廣泛用于治療心腦血管疾病的銀杏葉制劑其活性成分主要為黃酮和內(nèi)酯，其中含有的少許銀杏酸由于具有胚胎毒性、細胞毒性和免疫毒性等生物毒性，被公認為是其主要毒副作用成分，其含量為銀杏葉提取物及其制劑質(zhì)量標準中的主要控制指標[13，14]。很多研究結(jié)果皆顯示，銀杏外種皮中的銀杏酸的含量高于銀杏葉。本實驗所制備的GBEE以銀杏外種皮為原料，但其主要工藝與銀杏葉制劑不同，是將銀杏外種皮通過沸水煎煮、乙醇沉淀而得，主要活性成分是不溶于乙醇的蛋白多糖類化合物。由于乙醇是提取銀杏酸的主要試劑之一[15]，考慮到乙醇溶劑的殘留問題，檢測GBEE中是否含有少許銀杏酸很有必要。本研究采用HPLC法檢測了6個不同產(chǎn)地的GBEE，結(jié)果顯示均不含有任何銀杏酸成分，可能與制備過程中對GBEE沉淀物使用高濃度乙醇進行了反復(fù)離心洗滌有關(guān)。該結(jié)果提示，采用該工藝制備的GBEE及其制劑在質(zhì)量控制方面可以不考慮銀杏酸檢測項目。

表2 GBEE樣品中重金屬元素含量（n=3，mg·kg-1）

圖1 總銀杏酸標準品HPLC圖

圖2 GBEE樣品HPLC圖

1 吳倩,許愛華,楊茜,等.銀杏外種皮提取物有效部位GBEE-2對胃癌SGC-7901細胞凋亡及其通路的影響.中藥新藥與臨床藥理, 2011, 22(3)： 270-273.

2 李俊,傅恩賜,許愛華,等. GBEE 對荷瘤小鼠 IL-2、IL-12、TNF-α 及TGF-α水平的影響.中國免疫學雜志, 2012, 28(5)： 415-417.

3 Xu A H, Chen H S, Sun B C, et al. Therapeutic mechanism of ginkgobiloba exocarp polysaccharides on gastric cancer. World J Gastroenterol, 2003, 9(11)： 2424-2427.

4 沈婷婷,許愛華,鄭媛媛,等.銀杏外種皮提取物對C57BL/6J小鼠Lewis肺癌轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機制.中國藥理學與毒理學雜志, 2013, 27(1)： 67-71.

5 陳穎,茅蕾蕾,胡碧原,等.銀杏外種皮提取物聯(lián)合順鉑對S180荷瘤小鼠抗腫瘤增效減毒作用. 中國新藥雜志, 2014, 23(13)： 1569-1573.

6 陳華圣,翟范,褚云飛,等.銀杏外種皮多糖膠囊制劑治療中晚期上消化道惡性腫瘤的臨床研究.中西醫(yī)結(jié)合學報, 2003, 1(3)： 189-191.

7 許愛華.具有抗腫瘤及免疫促進活性的銀杏外種皮提取物及其有效部位的制備方法.中國, 201010251050. 9, 2010-12-15.

8 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010： 70, 96, 122, 205, 283, 306-308,附錄49-50,附錄67-69.

9 梁曉艷,唐秀能,胡軍高,等.復(fù)方扶芳藤合劑中重金屬元素測定及其安全性評價.中成藥, 2013, 35(10)： 2189-2195.

10 謝達溫,廉源沛,梁文琳,等.微波消解-ICP-MS法測定川芎和天麻藥材中5種重金屬元素. 世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2015, 17(3)： 740-743.

11 于娟,杜守穎,陳玨. ICP-MS測定片仔癀肝寶中6種重金屬的含量.世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2014, 16(8)： 1789-1795.

12 汪洪.冷原子吸收光譜法和原子熒光光譜法檢測糧食中有害元素——汞的分析方法之比較.糧食加工, 2006, 31(5)： 87-88.

13 李轉(zhuǎn)梅,張學蘭,李慧芬,等.白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸定量比較.中成藥, 2015, 37(1)： 164-168.

14 田紫平,喻微,何貴州,等. HPLC 測定銀杏葉中總銀杏酸的含量.微量元素與健康研究, 2015, 32(2)： 36-37, 47.

15 王國艷,朱晶晶,樓鳳昌.銀杏外種皮的化學成分及其對植物真菌的抑制作用.中國藥科大學學報, 2014, 45(2)： 170-174.

參考文獻

Determination of Heavy Metal Elements and Ginkgolic Acid in Ginkgo biloba Exocarp Extracts

Wang Jun1, Yin Meng2, Han Dongdong1, Mao Leilei1, Xu Aihua1
（1.Medical College, Yangzhou University, Yangzhou 225001, China; 2.Jiangsu Yangzhou Institute for Drug Control, Yangzhou 225009, China）

This article was aimed to detect the content of 5 heavy metal elements and the ginkgo acid in the Ginkgo biloba exocarp extracts (GBEE). GBEE from six different areas were prepared by water extraction and alcohol precipitation method. The Pb, Cd, Cu, as 4 kinds of heavy metal elements were detected by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）. The Hg was detected by atomic fluorescence spectrometry (AFS). The content of ginkgolic acid was detected by the HPLC method. The results showed that the content of Pb, Cd, Cu, Hg and As were all lower than the limit of the Chinese Pharmacopoeia in the GBEE from 6 Ginkgo biloba growing areas. In addition, GBEE did not contain any component of ginkgolic acid. It was concluded that GBEE from six different areas contained no ginkgo acid, the content of 5 heavy metal elements conformed to the limited provisions.

Ginkgo biloba exocarp extracts, heavy metal elements, ginkgolic acid

10.11842/wst.2016.01.011

R284

A

（責任編輯：朱黎婷 張志華，責任譯審：許愛華）

2015-09-29

修回日期：2015-09-29

＊ 江蘇省科技發(fā)展計劃醫(yī)藥高技術(shù)研究基金項目（BG2007609）：抗腫瘤創(chuàng)新藥物GBEE的臨床前研究，負責人：許愛華。

＊＊ 通訊作者：許愛華，教授，碩士生導師，主要研究方向：腫瘤藥理學與中藥分析。